1 EnzymovEnzymováá stanovenstanoveníí •• kompletnkompletníí konverze analytu na mkonverze analytu na měřěřitelnitelnéé produkty (barevnprodukty (barevnéé, fluoreskuj, fluoreskujííccíí,, ……)) -- ""endend-- pointpoint" stanoven" stanoveníí •• kinetickkinetickáá stanovenstanoveníí -- rychlost enzymovrychlost enzymovéé reakcereakce limituje analyt (funguje naplimituje analyt (funguje napřř. jako substr. jako substráát),t), ostatnostatníí komponenty reakkomponenty reakččnníí smsměěsi jsou vsi jsou v nadbytku (dalnadbytku (dalšíší substrsubstrááty, koenzymy, enzym,ty, koenzymy, enzym, ……)) •• recyklarecyklaččnníí stanovenstanoveníí -- úúččastnastníí se dvase dva komplementkomplementáárnrníí enzymy (napenzymy (napřř. lakt. laktáátt dehydrogenasa a laktdehydrogenasa a laktáát oxidasa)t oxidasa) •• katalytickkatalytickáá stanovenstanoveníí NNááslednslednéé reakcereakce •• ččasto nestaasto nestaččíí pouze jedna (primpouze jedna (primáárnrníí, m, měřěřenenáá) reakce,) reakce, ale je nutnale je nutnéé zazařřadit nadit nááslednslednéé indikaindikaččnníí kroky (sekvencekroky (sekvence reakcreakcíí):): AA BB CC EEprimprim XX YY EEindind t~t~0: [B] <<0: [B] << KKmm BB,, vvindind == VVindind.[B]/.[B]/KKmm BB -- reakce 1.reakce 1. řřáádudu t>t>0:0: kk[E[Eprimprim] =] = VVindind vvindind == VVindind[B]/([B]/(KKmm BB + [B]) =+ [B]) = VVindind/(K/(Kmm BB/[B] + 1)/[B] + 1) [B][B] ≥≥ 100100KKmm BB …… chyba kolem 1%chyba kolem 1% je třeba 10 až 100-násobný nadbytek Eind vůči Eprim 2 KlinickKlinickáá (potravin(potravináářřskskáá,, ……) stanoven) stanoveníí COOC O CH2 CH2 COO- COOCH NH2 CH2 CH2 COO+ NADH + NH4 + + NAD+ + H2O 2-oxoglutarát glutamátdehydrogenasa L-glutamátamoniakamoniak COOC O CH2 P COOC O CH2 COO- COOCH OH CH2 COO+ CO2 + OH- fosfoenolpyruvát oxalacetát ~ fosfoenolpyruvát karboxylasa + NADH + H+ L-malát malátdehydrogenasa + NAD+ COCO22 Org. kyselinyOrg. kyseliny L-laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H+ pyruvát + L-glutamát L-alanin + 2-oxoglutarát laktátdehydrogenasa alaninaminotransferasa kys. mlkys. mlééččnnáá puruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+L-laktátdehydrogenasa kys. pyrohroznovkys. pyrohroznováá 2-oxoglutarát + NADH + NH4 + glutamátdehydrogenasa L-glutamát + NAD+ + H2O kys. oxoglutarovkys. oxoglutarováá L-glutamát + NAD+ + H2O 2-oxoglutarát + NADH + NH4 + NADH + jodonitrotetrazolium.Cl + H+ diaforasa NAD+ + formazan glutamátdehydrogenasa kys. glutamovkys. glutamováá 3 citrát oxalacetát + acetát pyruvát + CO2 oxalacetát + NADH + H+ L-malát + NAD+ pyruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+ citrátlyasa malátdehydrogenasa L-laktátdehydrogenasa kys. citronovkys. citronováá kys. jablekys. jableččnnáá L-malát + NAD+ oxalacetát + NADH + H+ oxalacetát + L-glutamát L-aspartát + 2-oxoglutarát malátdehydrogenasa aspartátaminotransferasa CH COO- CH-OOC H2O fumarasa L-malát+ kys. fumarovkys. fumarováá oxalát oxalátdekarboxylasa formiát + CO2 formiát + NAD+ + H2O formiátdehydrogenasa HCO3 2- + NADH + H+ kys.kys. ššťťavelovavelováá kys. mravenkys. mravenččíí 4 Ethanol, acetaldehyd, kys. octovEthanol, acetaldehyd, kys. octováá ethanol + NAD+ acetaldehyd + NADH + H+ acetaldehyd + NAD+ + H2O kys. octová + NADH + H+ aldehyddehydrogenasa alkoholdehydrogenasa CH2 COO- COO- COO- HO CH2 acetát + ATP + CoA acetyl-CoA + ADP + Pi acetyl-CoA + oxalacetát + H2O + CoA malát + NAD+ oxalacetát + NADH + H+ acetát:CoA-ligasa (tv. ADP) citrát malátdehydrogenasa citrátsynthasa MonosacharidyMonosacharidy + H2O + O2 glukosaoxidasa glukonolakton + H2O2β-D-glukosa glukosaglukosa fruktosafruktosa CH2 OH O CH2 O-P O CH2 O-P O O + ATP hexokinasa + ADP β-D-glukosa β-D-glukosa-6-fosfát + NADP+ glukonolakton-6-fosfát + NADPH + H+β-D-glukosa-6-fosfát G6PDH β-D-fruktosa + ATP hexokinasa β-D-fruktosa-6-fosfát + ADP β-D-fruktosa-6-fosfát fosfoglukoisomerasa β-D-glukosa-6-fosfát 5 Glycerol, tuky, mastnGlycerol, tuky, mastnéé kyselinykyseliny CH2 CH CH2 OH OH OH glycerolkinasa L-glycerol-3-fosfát + ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa pyruvát + ATP pyruvát + NADH + H+ L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD+ + ATP triacylglycerol + 3 H2O lipasa, esterasa glycerol + 3 mastné kyseliny mastná kys. + CoA + ATP MK:CoA-ligasa (tv. AMP) AMP + acyl-CoA + P-P acyl-CoA + O2 acyl-CoA-oxidasa enoyl-CoA + H2O2 OH cholesterol + O2 4-cholestenon + H2O2 cholesteroloxidasa CholesterolCholesterol 6 AMP, ADP, ATPAMP, ADP, ATP AMP + ATP myokinasa 2ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa L-laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H+ L-laktátdehydrogenasa ATP + pyruvát 3-fosfoglycerát + ATP 3-fosfoglycerátkinasa 3-fosfoglyceroylfosfát + ADP 3-fosfoglyceroylfosfát + NADH + H+ glyceraldehyd-3-fosfát DH glyceraldehyd-3-fosfát + NAD+ + Pi glyceraldehyd-3-fosfát triosafosfátisomerasa dihydroxyaceton-3-fosfát dihydroxyaceton-3-fosfát + NADH + H+ 3-fosfoglycerát DH 3-fosfoglycerát + NAD+ AMP, ADPAMP, ADP ATPATP EnzymovEnzymovéé biosensorybiosensory převodník elektronická (transducer) jednotka biorekogniční vrstva analyt výstupní signál biosensor je analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve vzorku . = látka, která se stanovuje 7 PotenciometrickPotenciometrickéé bioelektrodybioelektrody •• zzááklademkladem potenciometriepotenciometrie je zmje změěnana potencipotenciáálu vyvolanlu vyvolanáá akumulacakumulacíí nnáábojeboje na rozhranna rozhraníí elektrody selektrody s roztokemroztokem A - A - A - A - K + K + ppřřevodnevodnííkem je iontovkem je iontověě selektivnselektivníí elektroda (ISE) velektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvoukombinaci s enzymovou vrstvou mměěřříí se potencise potenciáál pracovnl pracovníí elektrody proti referentnelektrody proti referentníí elektrodelektroděě, p, přřitom vitom v systsystéému netemu netečče proude proud PotenciometrickPotenciometrickéé enzymovenzymovéé elektrodyelektrody )+ln(+= / 0 yz jiji aka zF RT EE potencipotenciáál ISE pro sledovaný iont (aktivita al ISE pro sledovaný iont (aktivita aii) v p) v přříítomnostitomnosti ruruššivivéého iontu (aktivita aho iontu (aktivita ajj)) sklenskleněěnnáá elektrodaelektroda -- HH++ -- mměřěřeneníí pH, bpH, běžěžnněě dostupndostupnáá pevnpevnéé ISEISE -- tenktenkáá vrstva iontovvrstva iontovéého vodiho vodiččee monokrystal nebo smmonokrystal nebo směěs krystals krystalůů precipitprecipitáátt homogennhomogenníí nebonebo heterogennheterogenníí (mnohon(mnohonáásobnsobněě levnlevněějjšíší, vlastn, vlastníí materimateriááll dispergovdispergováán v inertnn v inertníí matrici (PVC, silikon, ...)matrici (PVC, silikon, ...) 8 PPřřííkladyklady •• pHpH : penicilin (: penicilin (penicilinpenicilinasasaa),), acetylcholinacetylcholin ((cholinestercholinesterasasaa),), esteresterasasy, nukleovy, nukleovéé kyseliny (kyseliny (nuklenukleasasy)y) •• NHNH33 / NH/ NH44 ++ : mo: moččovina (ureovina (ureasasa), aminokyseliny (oxidaa), aminokyseliny (oxidaččnníí deaminacedeaminace -- glutamglutamáátt DH,DH, oxidoxidasasaa LL-- // DD--aminoaminokkyselin;yselin; αα,,γγ-- eliminace amoniakueliminace amoniaku –– LL--methioninmethionin γγ--lylyááza)za) •• COCO22 : mo: moččovina (ureovina (ureasasa), aminokyseliny (lysina), aminokyseliny (lysin dekarboxyldekarboxylasasaa,, tyrosintyrosin dekarboxyldekarboxylasasaa), lakt), laktáát (laktt (laktáátt monooxygenmonooxygenasasaa -- dekarboxylujdekarboxylujííccíí oxidoxidasasa)a) •• CNCN-- :: amygdalinamygdalin ((ββ--glukosidglukosidasasaa)) MMěřěřeneníí kyslkyslííku a Hku a H22OO22 •• ClarkClarkůůvv amperometrickýamperometrický sensorsensor Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCl elektroda elektrolyt membrána propustná pro O2 ElektrodovElektrodováá redukce kyslredukce kyslííku (ku (--750 mV) je750 mV) je ččtytyřřelektronový proces:elektronový proces: OO22 + 2 H+ 2 H22O + 2 eO + 2 e-- HH22OO22 + 2 OH+ 2 OH-- HH22OO22 + 2 e+ 2 e-- 2 OH2 OH-- ElektrodovElektrodováá oxidace peroxidu vodoxidace peroxidu vodííku (ku (>> 6600 m00 mVV):): 2 H2 H22OO22 2 H2 H22O + OO + O22 + 2 e+ 2 e-- + 2 H+ 2 H++ absolutnabsolutníí specifita pouze kespecifita pouze ke kyslkyslííkuku -- ruruššivivéé lláátky nemohoutky nemohou projprojíít pt přřededřřazenou membrazenou membráánounou elektrodelektrodaa pro stanovenpro stanoveníí peroxiduperoxidu vodvodííkuku je podobnje podobnáá kyslkyslííkovkovéé ss ttíímm rozdrozdíílem,lem, žže nene neníí poupoužžitaita plynopropustnplynopropustnáá membmembáána ana a poupoužžíívváá se pozitivnse pozitivníí polarizacepolarizace -- anodickanodickáá oxidaoxidacce peroxidue peroxidu 9 KyslKyslííkovkováá elektrodaelektroda EnzymovEnzymovéé elektrody selektrody s oxidasamioxidasami •• tyto enzymy oxidujtyto enzymy oxidujíí molekulu substrmolekulu substráátu (tu (analytuanalytu) za) za úúččasti kyslasti kyslííku,ku, ppřřitom vznikitom vznikáá bubuďď peroxid vodperoxid vodííku neboku nebo voda:voda: substrsubstráát +t + OO22 produkt +produkt + HH22OO22 substrsubstráát +t + OO22 produkt + Hprodukt + H22OO •• detekce peroxidu je obecndetekce peroxidu je obecněě citlivcitlivěějjšíší (nulov(nulováá výchozvýchozíí hladina)hladina) čas Proud O2 analyt H2O2 0 Rozsahy detektoru oxidace peroxidu vodoxidace peroxidu vodííku jeku je spojenspojenáá s nebezpes nebezpeččíím interferencem interference ze strany jiných oxidabilnze strany jiných oxidabilníích lch láátek,tek, napnapřř. v s. v sééru mohou vadit kyselinyru mohou vadit kyseliny askorbovaskorbováá a moa moččovováá ččii paracetamolparacetamol specifita se dspecifita se dáá zlepzlepššit pit přřededřřazenazeníímm kontrolnkontrolníí membrmembráány, kterny, kteráá omezomezíí ppřříístup interferujstup interferujííccíích lch láátektek 10 PPřřehledehled oxidasoxidas Substrát oxidasy Zkratka EC číslo koenzym H2O2 Alkohol AOD 1.1.3.13 FAD ano L-Aminokyseliny 1.4.3.2 FAD ano D-Aminokyseliny 1.4.3.3 FAD ano Askorbát 1.10.3.3 Cu ne Bilirubin BRO 1.3.3.5 ne Diaminy DAO 1.4.3.6 Cu ano Fenol (Tyrosinasa) 1.14.18.1 Cu ne Galaktosa 1.1.3.9 Cu ano Glukosa GOD 1.1.3.4 FAD ano L-Glutamát 1.4.3.11 FAD ano Cholin 1.1.3.17 FAD ano Cholesterol COD 1.1.3.6 FAD ano p-difenoly (Lakasa) 1.10.3.2 Cu ne L-Laktát LOD 1.1.3.2 FAD ano L-Laktát (dekarb.) LMO 1.13.12.4 FMN ne L-Lyzin 1.4.3.14 ano Monoaminy MAO 1.4.3.4 FAD ano NADH ano Oxalát 1.2.3.4 Fp ano Pyruvát 1.2.3.3 FAD ano Sulfit 1.8.3.1 Mo ano Urát(Urikasa) 1.7.3.3 Cu ano Xanthin XOD 1.1.3.22 Mo ano EnzymovEnzymovéé elektrody selektrody s dehydrogenasamidehydrogenasami •• nejvnejvěěttšíší skupinouskupinou oxidoreduktasoxidoreduktas jsoujsou dehydrogenasydehydrogenasy (250(250 NADNAD++ a 150a 150 NADPNADP++ dependentndependentnííchch enzymenzymůů)) •• bioanalytickybioanalyticky významnvýznamnéé druhy jsou shrnuty vdruhy jsou shrnuty v tabulce:tabulce: Substrát Zkratka EC číslo Alkohol ADH 1.1.1.1 3-Hydroxybutyrát 3-HBDH 1.1.1.30 Aldehyd AlDH 1.2.1.5 3-Hydroxysteroid 3-HSDH 1.1.1.50 Alanin Ala-DH 1.4.1.1 Isocitrát ICDH 1.1.1.42 Formiát FDH 1.2.1.2 Inositol IDH 1.1.1.18 Galaktosa Gal-DH 1.1.1.48 L-Laktát L-LDH 1.1.1.27 Glycerol Gly-DH 1.1.1.6 D-Laktát D-LDH 1.1.1.28 Glukosa GDH 1.1.1.47 L-Leucin L-LeDH 1.4.1.9 Glukosa-6-fosfát G6P-DH 1.1.1.49 L-Malát L-MDH 1.1.1.37 Glutamát GlDH 1.4.1.3 Sorbitol SDH 1.1.1.14 PPřřehledehled dehydrogenasdehydrogenas substrát + NAD(P)+ + 2 e- + H+ produkt + NAD(P)H 11 Detekce NAD(P)HDetekce NAD(P)H •• elektrochemickelektrochemickáá detekce NADH jedetekce NADH je momožžnnáá amperometrickouamperometrickou reoxidacreoxidacíí vznikajvznikajííccíího NADH (Eho NADH (E°° --560560 mVmV/SCE);/SCE); ppřříímmáá oxidace vyoxidace vyžžaduje vysokýaduje vysoký potencipotenciáál (pl (přřes 1 V na uhles 1 V na uhlííku), nastku), nastáávváá dimerizacedimerizace a adsorpce produkta adsorpce produktůů nana povrch elektrodypovrch elektrody •• reoxidacereoxidace se mse můžůže prove provéést lst léépepe prostprostřřednictvednictvíím modifikujm modifikujííccíích lch láátektek vváázanýchzaných na povrchu elektrodyna povrchu elektrody •• nejnejččastastěěji se pouji se použžíívajvajíí fenazinyfenaziny,, fenoxazinyfenoxaziny aa fenothiazinyfenothiaziny, oxidace, oxidace nastnastáávváá jijižž kolem 0 V/SCEkolem 0 V/SCE •• lze ulze užžíít takt takéé hexakyanohexakyanožželezitanelezitan nebonebo TTF.TCNQTTF.TCNQ •• prprůůbběěh reakce je homogennh reakce je homogenníí -- vznikvznikáá chargecharge transfer komplex CT, po rozpadutransfer komplex CT, po rozpadu je pakje pak reoxidovreoxidováánn medimediáátortor, p, přřitom E >itom E > EE°° •• lze pracovat plze pracovat přři nii nižžšíším potencim potenciáálulu N + N CH3 O N H2N N + R2 S NH3C XHN N+ Me2 CH3OSO3 PMS Fenazin methosulfát R: methyl Meldola Blue R: ethyl Nile Blue X: H Toluidine Blue O X: naphthoyl Naphthoyltoluidine Blue O Mox + NADH CT CT Mred + NAD+ Mred Mox + 2 e+ n + PPřřenos elektronenos elektronůů zz biomolekulbiomolekul •• ppřříímýmý ppřřenos elektronenos elektronůů ppro konstrukciro konstrukci biosensorbiosensorůů jeje atraktivnatraktivníí -- zjednoduzjednoduššilil byby konstrukkonstrukcici •• bbohuohužželel,, bylbyl pozorovpozorováánn uu malmalýchých redoxnredoxnííchch bbíílkovin (lkovin (cytochromcytochromyy cc aa bb,, azurinazurin,, ferredoxinferredoxin) a n) a něěkterkterýchých enzymenzymůů (lak(lakasasaa,, peroxidperoxidasasaa).). substrsubstráátt EEoxox ee-- produktprodukt EEredred ppřříímý reversibilnmý reversibilníí ppřřenos elektronenos elektronůů z biomolekuly (bz biomolekuly (bíílkovina, nukleovlkovina, nukleováá kyselina) je obvykle ztkyselina) je obvykle ztíížženen řřadou faktoradou faktorůů v enzymechv enzymech se sice vyskytuje celse sice vyskytuje celáá řřada redoxnada redoxněě aktivnaktivníích skupinch skupin (disulfidick(disulfidickéé mmůůstky, Festky, Fe--S skupiny, flaviny, hem,S skupiny, flaviny, hem, řřada iontada iontůů kovkovůů), ale), ale nachnacháázzíí se obvykle uvnitse obvykle uvnitřř molekulymolekuly kkontakt redoxnontakt redoxníí skupiny s povrchem elektrody je moskupiny s povrchem elektrody je možžný pouze proný pouze pro orientovanorientovanéé molekuly, comolekuly, cožž výraznvýrazněě snisnižžuje odezvyuje odezvy vvelikost molekuly vede k velmi pomalelikost molekuly vede k velmi pomaléé difdifúúzizi biomolekulybiomolekuly sese adsorbujadsorbujíí pevnpevněě na povrch elektrod a dochna povrch elektrod a docháázzíí ttíímm sousouččasnasněě k jejich denaturacik jejich denaturaci 12 PPřřenos elektronenos elektronůů zz biomolekulbiomolekul •• ppro usnadnro usnadněěnníí výmvýměěny elektronny elektronůů mezi enzymy a elektrodou semezi enzymy a elektrodou se poupoužžíívajvajíí nníízkomolekulzkomolekuláárnrníí redoxnredoxníí lláátkytky –– medimediáátorytory •• ppououžžititíí medimediáátortorůů urychluje aurychluje a obvykle vobvykle vůůbec umobec umožňžňuje výmuje výměěnunu elektronelektronůů mezi aktivnmezi aktivníím centremm centrem enzymu a elektrodou.enzymu a elektrodou. substrsubstráátt EEoxox MMredred ee-- produktprodukt EEredred MMoxox reaguje s biokomponentou a elektrodoureaguje s biokomponentou a elektrodou dostatedostateččnněě rychlý prychlý přřenos elektronenos elektronůů (zn(znááma stechiometrie a poma stechiometrie a poččetet ppřřenenášášených elektronených elektronůů)) stabilnstabilníí formy (redukovanformy (redukovanáá i oxidovani oxidovanáá) za podm) za podmíínek pounek použžititíí neneúúččastnastníí se postrannse postranníích reakcch reakcíí vhodný redoxnvhodný redoxníí potencipotenciááll bez vlivu pH na prbez vlivu pH na průůbběěh redoxnh redoxníí reakcereakce netoxický (napnetoxický (napřř. pro aplikace in vivo). pro aplikace in vivo) vhodný k imobilizaci (nerozpustnývhodný k imobilizaci (nerozpustný čči snadno adsorbovatelný)i snadno adsorbovatelný) PoPožžadavky na mediadavky na mediáátortor Název E° (V) tris-(2,2’-bipyridyl)ruthenium(III) 1.031 tris-(2,2’-bipyridyl)osmium(III) 0.603 ferrocen-1,1’-dikarboxylová kyselina 0.403 ferrocenylmethyltrimethylamonium 0.388 1,1’-bis(hydroxymethylferrocen] 0.224 ferrokyanid K 4 [Fe(CN)6] 4- 0.190 hydroxyethylferrocen 0.161 N,N‘-dimethyl-p-fenylendiamin 0.139 ferrocenoctová kyselina 0.124 p-benzochinon 0.039 N,N,N‘,N‘-tetramethyl-p-fenylendiamin 0.029 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) -0.016 1,2-naftochinon -0.090 fenazin methosulfát (PMS) -0.161 methylenová modř -0.230 tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) -0.191 2-hydroxy-1,4-naftochinon -0.378 fenosafranin -0.493 MediMediáátorytory Fe CN CN NC NC S SS S ferrocen Fc tetrathiafulvalen TTF tetrakyanochinodimethan TCNQ 13 PouPoužžititíí medimediáátortorůů ppřříímý pmý přřenos v roztokuenos v roztoku v micelv micelááchch v elektrodv elektroděě kovalentnkovalentněě nana 3D3D--polymernpolymerníí navnaváázaný nazaný na elektrodelektroděě medimediáátortor enzymenzym BiosensorBiosensor propro glukosuglukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka 14 KonduktometrickKonduktometrickéé biosensorybiosensory •• ssledovledováánníí zmzměěn vodivostin vodivosti -- produkceprodukce ččii spotspotřřebaeba iontiontůů nebo zmnebo změěnyny velikosti nabitýchvelikosti nabitých ččáásticstic •• vznikvznik iontiontůů jeje spojenspojen ss úúččinkeminkem hydrolashydrolas (lipidy(lipidy ššttěěpenpenéé lipasou) alipasou) a amidasamidas, zm, změěna velikosti nabitýchna velikosti nabitých ččáásticstic probprobííhháá uu reakcreakcíí fosfatasfosfatas,, sulfatassulfatas ččii nukleasnukleas •• klasickýmklasickým ppřřííkladem jekladem je reakcereakce ureureasasy py přři stanoveni stanoveníí momoččoviny:oviny: NHNH22CONHCONH22 + 3 H+ 3 H22OO ⎯→⎯→ 2 NH2 NH44 ++ + HCO+ HCO33 -- + OH+ OH-- •• pproblrobléémemmem je vlastnje vlastníí vodivost pracovnvodivost pracovníího prostho prostřřededíí (pou(použžititíí mmáálolo vodivýchvodivých pufrpufrůů -- organickorganickéé, nap, napřř.. imidazol)imidazol) •• ttakakéé zmzměěnu vodivosti vyvolanou samotným pnu vodivosti vyvolanou samotným přříídavkem vzorku je tdavkem vzorku je třřebaeba odliodliššit, jeit, je žžáádoucdoucíí zanedbat zmzanedbat změěny vodivosti v celny vodivosti v celéém roztoku a sledovatm roztoku a sledovat ppřředevedevšíším tm těěsnsnéé okolokolíí elektrod selektrod s imobilisovanýmiimobilisovanými enzymy (vlastnenzymy (vlastníí signsignááll v dv důůsledkusledku bbioreakce)ioreakce) •• protoproto se výhodnse výhodněě poupoužžíívváá diferendiferenččnníí uspouspořřááddáánníí.. KonduktometrickKonduktometrickéé ppřřevodnevodnííkyky detail elektrod interdigitated array enzymová referentní vrstva kontakty izolace ukukáázka dvojitzka dvojitééhoho konduktometrickkonduktometrickééhoho ppřřevodnevodnííkuku (s(síítotiskovtotiskováá technologie,technologie, rozmrozměěry 7 x 25 mm)ry 7 x 25 mm) 15 EnzymovEnzymovéé optodyoptody •• PPřříímméé typytypy -- opticky mopticky měřěřenenáá lláátka (nejtka (nejččastastěějiji fluoroforfluorofor) se p) se přříímo vyskytuje vmo vyskytuje v biokatalytickbiokatalytickéé reakcireakci •• NADHNADH -- pompoměěrnrněě „„slabýslabý““ fluoforfluofor ((ΦΦff = 0.02), extink= 0.02), extinkččnníí a emisna emisníí maximamaxima jsou pjsou přři 350 a 450i 350 a 450 nmnm.. BiorekogniBiorekogniččnníímm elementem jsouelementem jsou dehydrogenasydehydrogenasy imobilisovanimobilisovanéé ppřřed koncem opticked koncem optickéého vlho vláákna. Aby se i koenzym dalkna. Aby se i koenzym dal zachytit v systzachytit v systéémumu biosensorubiosensoru, pou, použžíívváá se jehose jeho konjugkonjugáátt ss polyethylenglykolempolyethylenglykolem, který neproch, který neprocháázzíí dialysadialysaččnníí membrmembráánou. Výhodnnou. Výhodnáá jeje konstrukcekonstrukce sensorusensoru pro alkohol, kde je vzorek oddpro alkohol, kde je vzorek odděělenlen mikropormikroporééznzníí teflonovou membrteflonovou membráánou, NADH se nachnou, NADH se nacháázzíí ve vnitve vnitřřnníím roztokum roztoku sensorusensoru •• ExistujeExistuje řřada pokusada pokusůů vyuvyužžíít fluorescencit fluorescenci flavinovýchflavinových koenzymkoenzymůů (FADH(FADH22,, FMNHFMNH22) v) váázaných pevnzaných pevněě v molekule mnohav molekule mnoha oxidasoxidas. P. Přři vyi vyššíšší koncentracikoncentraci substrsubstráátu se zpomaluje zptu se zpomaluje zpěětntnáá oxidace redukovanoxidace redukovanéé formy kyslformy kyslííkem akem a intensitaintensita „„vnitvnitřřnní“í“ ((intrinsicintrinsic) fluorescence redukovan) fluorescence redukovanéého koenzymuho koenzymu narnarůůststáá. Výhodou je reversibilita takov. Výhodou je reversibilita takovéého systho systéémm EnzymovEnzymovéé optodyoptody •• NepNepřříímméé ((„„mediovanmediovanéé““,, extrinsicextrinsic) optick) optickéé biosensorybiosensory vyuvyužžíívajivaji optickoptickéé indikindikáátory. Nejtory. Nejččastastěějjšíší jsou optickjsou optickéé sensorysensory pro mpro měřěřeneníí kyslkyslííku aku a pHpH.. •• sledovsledováánníí kyslkyslííkuku vyuvyužžíívváá zhzhášášeneníí fluorescence indikafluorescence indikaččnníí molekuly, poklesmolekuly, pokles intensity fluorescence je dintensity fluorescence je dáán Sternn Stern--VolmerovýmVolmerovým vztahem:vztahem: •• IndikIndikáátor se obvykle nachtor se obvykle nacháázzíí vv silikonovsilikonovéé vrstvvrstvěě ppřředed ččelem optickelem optickééhoho vlvláákna. Nejkna. Nejččastastěěji se pouji se použžíívváá kyselinakyselina pyrenmpyrenmááselnselnáá ((pyrenebutyricpyrenebutyric acidacid,, PBAPBA), excitace p), excitace přři 350 ai 350 ažž 400400 nmnm;; ddalalšíší momožžnosti jsounosti jsou perylenperylen aa dekacyklendekacyklen, organokovov, organokovovéé komplexy rutheniakomplexy ruthenia lzelze výhodnvýhodněě excitovat pexcitovat přřii 460460 nmnm, tak, takžže jako zdroj me jako zdroj můůžže sloue sloužžit modrit modráá LED.LED. ])[+1/(= 20 OKII SVff (CH2)3COOH PBA pH zmpH změěny lze sledovat pomocny lze sledovat pomocíí acidobasickýchacidobasických indikindikáátortorůů. Z fluorescen. Z fluorescenččnníích lze pouch lze použžíít napt napřř.. 11--hydroxypyrenhydroxypyren--3,6,83,6,8--trisulfonovou kyselinutrisulfonovou kyselinu (HPTS, pH p(HPTS, pH přřechod 5 aechod 5 ažž 8) nebo 48) nebo 4--methylmethyl-- umbelliferon. Absobumbelliferon. Absobččnníích indikch indikáátortorůů je celje celáá řřada, kresolovada, kresolováá zelezeleňň a bromthymolova bromthymolováá modmodřř..