Základní metodické přístupy v experimentální onkologii & Modelové systémy Experimentální modely v onkologii Obecné zásady při výzkumu: • Snaha porozumět fundamentálním procesům funkce a vývoje živých organismů • Formulace přesně definovaných otázek ve vymezené oblasti výzkumu • Výběr vhodného modelového systému (Mendel) • Zjednodušený, ale impaktní systém umožňující testovat specifickou hypotézu a zda se dosáhne výsledného fenotypu • Buněčné linie • Caenorhabditis elegans • Drosophila melanogaster • Kvasinky • Danio rerio • Mus musculus Příprava buněčných linií Nebezpečí kontaminace jinou buněčnou kulturou [DSMZ, ATCC (mikrosatelitní DNA fingerprinty)] Buňky se dělí a rostou dokud neobsáhnou celý prostor, pak následuje: • Zástava b. dělení kontaktní inhibicí • Indukce buněčné diferenciace kontaktní inhibicí • Akumulace apoptotických a nekrotických buněk • Deplece nutričních faktorů Práce s eukaryotickými buněčnými liniemi Optimální podmínky kultivace (5-10% CO2, 37°C, pH, glukóza, růstové faktory, antibiotika) Výměna média (pH), pasážování buněk, kryoprezervace 2D vs. 3D kultivace Konfluence buněk, suspenzní vs. adherentní buňky Genové manipulace Výhody a nevýhody buněčných linií • Prakticky neomezená životnost • Kontinuální a rychlá proliferace • Snadná práce • Možnost připravit stabilní KO, transientní transfekce, a další genetické manipulace • Atypické okolí nádorových buněk • Nebezpečí kros-kontaminací • Kumulace dalších změn Buněčné linie Vybavení Kultivační média Práce s b. liniemi Kryoprezervace Primokultury Výhody a nevýhody • Příprava monoklonálních protilátek • Vývoj buněčných vakcín Využití buněčných linií v biotechnologii Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) projekt Detailní genetická a farmakologická charakterizace panelu lidských nádorových linií (~1000) s cílem vytvořit model, který bude reflektovat vlastnosti lidských nádorů a usnadní/umožní volbu nejvhodnější terapie. Komparativní a (ko-)expresní analýza Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe) Snadno kultivovatelné, 1. eukaryotický organismus plně osekvenovaný, celá řada funkčních homologů se savčími buňkami Vhodný model pro screening protinádorových léčiv Pozitivní selekční screening Příklad využití kvasinek při screeningu b. signalních drah při testování nových látek Danio rerio (Zebrafish) jako model pro p53 p53-mutant vznik tumorů ze Schwanných buněk p53-mutace + mutace B-raf vznik maligního melanomu Drosophila melanogaster Malé, snadno pěstovatelné, krátký životní cyklus (2 týdny), relativně malý genom (1,4x108 bp), existence polytenních chromosomů, řada mobilních genetických elementů. Transformační systém využívající mobilní genetický element P, po injikaci do embrya – tvorba mozajek (využití např. při studiu tkáňově specifické exprese) Caenorhabditis elegans Dobře pěstovatelný na petriho misce Velikost genomu 8x107 bp Pohlaví determinováno chromosomem X Chemoterapie (jednoduchá aplikace, velké množství ryb, dlouhodobá léčba x nespecifická, predominance jaterních tumorů, potenciální riziko pro výzkumníka) Transplantace savčích buněk (rychlost, průhledná embrya, lidské nádory, fluorescence x, nízká penetrance tumorů) Genetické knockouty (Inaktivace jednoho specifického genu - N-ethyl-N-nitrosourea mutageneze, „Human-like cancer“ mutace x slabá penetrance, genové duplikace, rozdílné spektrum tumorů, „background“ mutace) Exprese transgenů (jednoduše generovatelné injikací, použití lidských genů, použití fluorescence, tkáňově specifická exprese x nedostatek specifických promotorů) Panel nových mAb proti p53 TA DBD OD 1MAQNDSQEFAELWEKNLIIQ2O 5A9 149VRRCPHHERTPDGDNLAPAG160 1F9 251KTEESNFKKD260 ZFp53-1.1 ∆∆∆∆Np53 251KTEESNFKKDQETKTMAKTT270 ZF p53-2.1 7C7 271TGTKRSLVKESSSATSRPEG290 ZFp53-4.1 301EEIFTLQVRGRERYEILKKL320 ZF p53-3.1 Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. 4 metody přenosu GI: • Infekce buněk kostní dřeně rekombinantním retrovirem umožní expresi přeneseného genu v infikovaném zvířeti • Infekce embrya pomocí rekombinantního retrovirového vektoru • Transformace embryonálních kmenových buněk • Klonovaná DNA může být mikroinjikována do fertilizovaných oocytů a přenesena do náhradní matky *Náhodný charakter integrace poziční efekt !!! (YACs & BACs) *Poprvé gen pro elastázu, nezbytná 134 bp regulační oblast pro správnou funkci „Hybridní transgen“ Knockout and knockin Využití homologní rekombinace u ES buněk (více jak 1000 genů “KO”) Odběr biologického materiálu Biologický materiál pro genetickou analýzu - Nesrážlivá krev - Kostní dřeň - Moč - Sliny - Bukální sliznice - Fibroblasty (kožní biopsie) - Tkáně – N2 – FFPE vodná fáze (NK) proteiny fenol/chloroform (lipidy) • Umístění buněk/tkání do extrakčního pufru • Dlouhodobé uchovávání (RNA later, chelatační činidla) Fenol/chloroformová extrakce a následně etanolová nebo isopropanolová precipitace Metody adsorpční Adsorpce NK na silikagel v přítomnosti chaotropních solí (guanidin isothiokyanát, NaI), eluce přes kolonky Metody vysolovací obchází použití organických rozpouštedel, při izolaci z krve nejprve hemolýza, následuje izolace DNA z leukocytů Izolace nukleových kyselin Koncentrace, kontrola čistoty a kvality DNA / RNA A260 = 1, c(dsDNA) = 50 µg/ml A260 = 1, c(ssDNA) = 33 µg/ml A260 = 1, c(ssRNA) = 40 µg/ml A260/A280 v rozmezí 1,7 - 1,8 čistá DNA A260/A280 < 1,7 DNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami A260/A280 > 1,9 DNA znečištěná RNA nebo organickými látkami A260/A280 = 1,9 – 2,1 čistá RNA A260/A280 < 1,9 RNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami Hybridizační metody • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A normál TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A normal TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu RNA sondy Nízkohustotní arrays Izolace RNA Značená cDNA RT PCR + značení biotinem Hybridizace Detekce AP- avidin Analýza Průkaz onkologických markerů pomocí DNAmikroaray testů Tato technika spočívá v umístění tisíců imobilizovaných DNA sekvencí oligonukleotidových značek v miniaturizovaném čipu. Povrchy jako je sklo nebo plast umožnily využít fluorescenční signály, zvýšení reproducibility a rychlosti hybr. kinetiky. Velmi zjednodušeně lze princip metody: Nejprve se izoluje vzorek DNA z buněk odebraných vyšetřované osobě a ten se označí fluorescenčním činidlem. Označená DNA se pak hybridizuje se vzorky určitých DNA sekvencí (DNA array) na destičce. Po promytí se měří fluorecence na „DNAarray“ a hodnotí pomocí počítače. •genová exprese •komparativní genomická hybridizace •SNP •sekvenace Současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) kontrolní DNA (zdr. jedinec) značena červeně (TRITC) Komparativní genomová hybridizace Komparativní genomová hybridizace Genomová array CGH Výhody a nevýhody • není zapotřebí kultivace buněk • (použití interfázních chromozomů) • odhalí delece a amplifikace všech chromozomů buňky v jednom pokusu • možná diagnostika neznámé aberace • malé množství vzorku lze amplifikovat PCR • nelze zjistit balancované změny (translokace, inverze) • nelze odlišit diploidní a tetraploidní tumory • nelze vyšetřit změny v telomerických a v heterochromatinových pericentromerických oblastech • nutné aby alespoň 50% buněk neslo změnu Elektroforetické metody gelová elfo PFGE DGGE Kapilární elfo • PCR umožňuje detekovat jediný leukocyt infikovaný HIV mezi 105 neinfikovaných bílých krvinek. K tomu je třeba onen jediný leukocyt, obsahující sekvenci typickou pro HIV, pomocí PCR rozmnožit. Při 30 PCR cyklech se původní počet cílových sekvencí znásobí 106 až 109. • Vzorky pro PCR jsou biologické kapaliny (celá krev, plasma, sérum, moč, sputum, sperma apod.), tkáně, vlasy a vousy, stěry biologických stop, suché skvrny biologického materiálu aj. Podle povahy vzorku se volí i postup jeho úpravy. V podstatě se jedná o převedení vzorku do suspenze či roztoku, popř. jeho homogenizaci, lýzu buňek a izolaci NA buď extrakcí, nebo sorpcí na vhodném sorbentu. Pro PCR je přibližně třeba 10 - 500 µg lidské DNA, 1 - 10 µg bakteriální DNA a 0,1 - 1 µg plasmidové DNA. Konkrétní koncentrace se řídí celkovým objemem reakční směsi v PCR. Např. z 1 ml celé krve se získá cca 20-200 µg DNA. Multiplex PCR Zpětná PCR (Reverse transcription) PCR v reálném čase - výhody: způsob detekce měření kinetiky v brzkých fázích vyšší senzitivita kvantitativní charakter výsledků - nevýhody: nákladnější Průběh PCR reakce • Fáze PCR reakce • Treshold • Nárůst fluorescence je přímo úměrný množství specificky naamplifikovaného produktu cyklus PCRprodukt exponenciální lineární plateau TRESHOLD Typy sond 1. Nespecifické (např. interkalační barviva) 2. Specifické (fluorescenčně značené sondy) 3. Fluorescenčně značené primery Analýza dat Relativní x Absolutní kvantifikace cyklus Fluorescence TresholdCt1 Ct2 Ct3 ∆Ct = Ct cíl. gen – Ct endog. kontrola ∆∆Ct = ∆Ct vzorek - ∆Ct kontr. vz. 2-∆∆Ct 1 2 3 y=mx+b log input = (CTvzorku–b)/m množství vzorku = 10^[log input] Analýza exprese u onkologických onemocnění Rozdíl v expresních profilech zdravá x nádorová buňka Nejčastější markery: MGB1, CEA, CK20, EGFR1, C-MYC, TH, TS, … Detekce MRD SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 1. Z izolované mRNA je z každého transkriptu získán jedinečný tag. 2. Jednotlivé tagy jsou následně zligovány (spojeny), čímž vznikají dlouhé polynukleotidové sekvence, které mohou být následně klonovány, sekvencovány apod. 3. Ve finále je zastoupení jednotlivých tagů kvantifikováno, což podává informaci o míře exprese analyzovaných transkriptů. Strategie v identifikaci DNA bodových mutací a delecí 1. přístupy zaměřené na stanovení délky DNA fragmentů (RFLP) 2. techniky založené na hybridizaci 3. PTT test (Protein Truncation Test) 4. techniky založené na kvantifikaci DNA 5. DNA sekvencování 6. metody založené na principu heteroduplexní analýzy Ad 2) Metoda ASO (Allele-Specific Oligonucleotide). Vzorky 1-6 nakapány v duplikátu na membrány a hybridizovány s A a S oligonukleotidy. Vzorky 3 a 5 = heterozygoti; 1 a 4 homozygoti pro alelu A; 2a 6 homozygoti pro alelu S; Ad 4) techniky založené na kvantifikaci DNA PCR s alelově-specifickými primery ARMS (Amplification Refractory Mutation System) v kombinaci se systémem „Scorpion“ Kolorektální karcinom, který patří k nejrozšířenějším nádorovým onemocněním v rozvinutých zemích, může být při velmi časné diagnóze úspěšně léčitelný (v lokalizovaném stadiu až 90 %). Existují genetické abnormality, které vedou nejprve k benigní proliferaci buněk sliznice tlustého střeva tj. k tvorbě polypů, dále pak adenomů a nakonec ke vzniku adenokarcinomu, popřípadě adenokarcinomu brzy metastazujícímu. Mutační analýza onkologických onemocnění Asi 1/3 populace mívá po padesátce adenomy tlustého střeva; ale jen u 10 % vznikne karcinom. Tyto adenomy možno klasifikovat podle jejich velikosti, patologie (makroskopická struktura) a dysplazie (mikroskopická struktura) na málo a na vysoce rizikové. Histopatologická kritéria nejsou však dostatečně objektivní. Mnohem lepší je průkaz mutace genu K-ras, který patří k protoonkogenům, uplatňujícím se v kaskádě transdukce signálu a je tedy částečně odpovědný za přeměnu adenomu na adenokarcinom. Mutace genu K-ras se většinou objevují v exonu 1, a to buď na kodónu 12 (GGT) nebo 13 (GGC). Oba triplety (GGT i GGC) kódují glycin. Vznikne-li mutace na jedné z obou bazí (kupř. GGT®GCT), pak v sekvenci polypeptidu je glycin nahrazen alaninem. Heteroduplexní analýza • SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) • DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) Sekvencování Chemické (Maxam-Gilbetovo) sekvencování - příprava koncově značených jednořetězcových fragmentů - 4 paralelní vzorky – modifikace jednoho typu báze, kde je fragment štěpen  Enzymatické (Sangerovo) sekvencování - Syntéza komplementárního vlákna k sekvenci kterou identifikujeme - 4 paralelní vzorky - do každého jeden dideoxyribonukleotid Pyrosekvencování Library Preparation is a Shotgun Approach Randomly shear DNA End polishing, Ligate adapters Limited PCR amplifies only correct libraries X X Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation ePCR Clonally Amplifies Library Beads are coated with P1 complementary adapters PCR synthesizes a perfect copy of the library fragment to the bead Simultaneously PCR amplifies the original library fragment Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation And enables further copies of the original library fragment to be synthesized to the bead ePCR Clonally Amplifies Library At the end the beads are covered with 20.000 to 40.000 clonal copies of the original library fragment. Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation Templated Beads are Attached to a Slide Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation Beads covalently attached to slide Ligation Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation SOLiD™ System Sequencing is Sequencing by Ligation Sequencing Sequencing by Ligation: Properties of the Probes Probes are octamers: • n = degenerate bases, z = universal bases • 45 combinations = 1024 probes, • 256 probes per color Repeat Ligation, Imaging, Cleavage Ligation and Imaging SOLiD™ System Sequencing is Sequencing by Ligation Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation Cleavage Reset Repeat steps 1-6 with new primer repeat SOLiD™ System Sequencing is Sequencing by Ligation Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation • Each position is interrogated twice in independent extension reactions with different primers • Dual interrogation provides increased confidence in calls Sequencing Uses 2base Encoding Library prep Templated bead preparation SOLiD™ System Sequencing Data Analysis Validation SOLiD™ System Sequencing Sequencing by Ligation: 2 Base Encoding Why Do We Use Color Space? A C G G T C G T C G T G T G C G T A T G G T C G T C G T G T G C G T If you have a true base change.... ... you will always find a two color change Single color changes can only come from sequencing errors and are corrected 2 color change = SNP Alignment of Sequencing Tags and Differentiation of Real SNPs From Correctable Mis-reads Reference sequence Sequence reads 1 color change = mis-read Sekvencování v onkologii Studium mutací a polymorfismů (K-RAS, BRCA1, p53, RB1) Fragmentační analýza např. RB1 - mutační scanning na úrovni DNA i RNA pomocí přímého sekvenování, vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy, analýza metylace promotorové oblasti vyšetření periferní krve / nádorové tkáně komplementární sekvence k univerzálnímu primeru Y Stuffer sekvence specifická hybridizační sekvence komplementární sekvence k univerzálnímu primeru X Schéma konstrukce párů sond DENATURACE (98°C) HYBRIDIZACE (98°C) LIGACE (54°C) PCR SEPARACE ds DNA ss DNA ss DNA F R Ligáza-65 použití univerzálních primerů inaktivace ligázy při 98°C fragmentová analýza Princip MLPA A) NORMÁLNÍ HOMOZYGOT C) HETEROZYGOT B) DELETOVANÝ HOMOZYGOT 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 2 2 3 2 4 4 4 4 4 44 A B C 3 2 1 3 33 Detekce delecí RNAi technologie RestrikRestrikččnníí ššttěěpenpeníí