EXPERIMENTEXPERIMENTÁÁLNLNÍÍ
ONKOLOGIEONKOLOGIE
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Přednášející:
Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. (bouchal@chemi.muni.cz,
bouchal@mou.cz)
-proteomika, nádorová biochemie, organizační zajištění
Mgr. Roman Hrstka, Ph.D. (hrstka@mou.cz)
-biologie nádorové buňky, genomika
MUDr. Petr Müller, Ph.D. (muller@mou.cz)
-genová terapie, proteinové inženýrství, farmakologie
MUDr. Rudolf Nenutil, CSc. (nenutil@mou.cz)
-patologie
RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. (vojtesek@mou.cz)
-exprese a purifikace proteinů, protilátky, spolupráce a kariéra ve vědě
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Lidský genom…
Sekvenace: kompletní
Anotace: kompletní, nikoliv však definitivní
Funkce genových produktů a regulace exprese: ve
výzkumu
Evoluce, výměna genetické informace a dělení miliard
buněk během života organismu: probíhá
…a karcinogeneze
Karcinogeneze: vyvolána poškozením genomu
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
KARCINOGENEZE
Multifaktoriální a vícestupňový proces
• Fyzikální karcinogenní faktory
• Chemické karcinogeny mutace DNA vedoucí k aktivaci
• Biologické karcinogenní faktory onkogenů a/nebo inaktivaci
• Konstituční karcinogenní faktory antionkogenů
Reparační mechanismy
• fungují  oprava DNA
• nefungují
pak buď
 apoptóza
nebo
 šíření mutací do dalších buněčných generací  karcinom
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Fyzikální karcinogenní faktory:
Radiační vlivy
• Ionizující záření
korpuskulární (částicové): α, β
elektromagnetické: γ, rtg
• UV záření
Ionizující záření:
• Chromosomální aberace: nestabilní
(letální) vs. stabilní (přenášející se
do dalších buněčných generací)
• Účinek záleží na dávce a době
působení
• Nejohroženější: lymfatická tkáň
• Latence – různá – Hirošima:
leukémie ~ 8 let
ca. plic a BrCa: ~12-18 let
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Přeživší z Hirošimy:
1 Sv... chromosomální aberace u 10% buněk
5 Sv... chromosomální aberace u 50% buněk
limit pro pracovníka se zářením 50 mSv/rok
přírodní radiační pozadí občana ČR 2,5 až 3 mSv/rok
přírodní radiační pozadí občana Kerali v Indii 17 mSv/rok
přírodní radiační pozadí občana Guapari v Brazílii 175 mSv/rok (horniny)
přírodní radiační pozadí občana Ramsaru v Iránu 400 mSv/rok (horniny)
RTG střev 4 mSv
RTG žaludku 2,4 mSv
RTG kyčlí 1,7 mSv
pracovník JE Dukovany obdrží 0,4 mSv/rok
obyvatelstvo v okolí JE Dukovany obdrží 0,005 mSv/rok
3 lety nadzvukovým letadlem Praha - USA 0,38 mSv/rok
SÚJB – osobní „účty“ ozáření
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
UV záření
• tvorba pyrimidinových dimerů => eliminace =>
apyrimidinová místa
• jedno- a dvouřetězcové zlomy, spojování řetězců
• tvorba volných radikálů ˙OH, ˙O3
•
adaptace na UV: pigmentace
 aktivace onkogenů/deaktivace antionkogenů
 ? karcinom
Fyzikální karcinogenní faktory:
Radiační vlivy
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
• Jednorázové mechanické poškození tkáně - v žádném případě není
prokázána souvislost s karcinogenezí
• Karcinogeneze vyvolaná dlouhodobým působením (implantáty)
prokázána u některých druhů zvířat, u jiných nikoliv (pravděpodobně
iritace a indukce proliferace – promoční charakter)
Fyzikální karcinogenní faktory:
Mechanické vlivy
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Vždy mutageny
Mechanismus účinku: elektrofilní látky – chemická reakce s DNA, RNA
Přímé (ultimátní) karcinogeny
• alkylační látky (cytostatika – cyklofosfamid, chlorambucil, busulfan
nitrosurea, …)
• acylační látky (1-acetyl-imidazol, dimethylsulfát, …)
Prokarcinogeny (=proximální karcinogen) -> intermediární karcinogeny
-> finální (terminální) karcinogeny
• aromatické uhlovodíky, aromatické aminy, nitrosaminy, produkty
plísní (aflatoxin), kovy (Cr, Ni, Co), As, azbest, insekticidy, fungicidy,
... viz tabulka
Chemické karcinogeny
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Hlavní skupiny
(pro)karcinogenů
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Enzymy odpovědné za karcinogenezi
E E
Prokarcinogen  intermediární karcinogen  terminální karcinogen
• Monooxygenasy ze systému cytochromu P-450 (CYP)
(metabolismus xenobiotik – léčiv a škodlivin z vnějšího prostředí –
funkčně heterogenní skupina)
• Hydroxylasa aromatických uhlovodíků (cytochrom P-448)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Oxidace
Benzo[a] pyren
O
H O
O H
silné kancerogeny
7,8-Diol-9,10-epoxidy benzo[a]pyrenu
Metabolická přeměna benzo[a]pyrenu hydroxylasou aromatických
uhlovodíků (cytochrom P-448)
Enzymy odpovědné za karcinogenezi:
tvorba vysoce reaktivních epoxidů
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Typický příklad:
iniciační agens: benzo[a]pyren
promoční agens: forbolové estery v krotonovém oleji,
např. terpen (=kokarcinogen)
Vícestupňový účinek chemických
karcinogenů
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Testování mutagenity:
Amesův test
• kmen Salmonella typhimurium s mutací v genu enzymu
zapojeného do syntézy His (His-)
• další mutace testovaným mutagenem:
?
His-  His+
• mutovaný kmen je schopen růstu na médiu bez His
• problém: bakterie nemají monooxygenasy (simulace
metabolické aktivace prokarcinogen  terminální
karcinogen) – řešení: inkubace látky se supernatantem
S-9 krysích jater
• schopnost detekce 90% známých karcinogenů
Kolonie S. typhimurium
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Testování mutagenity in vivo
• Transgenní myším, v jejichž genomu je inkorporován
bakteriofág λ nesoucí lacl gen, je podávána testovaná
látka
• Po určité době je fág aktivován
• Fágové částice vneseny do E. coli
• Produkt lacl je represorem β-galaktosidasy, mutovaný
produkt není funkční
• β-galaktosidása štěpí analog laktosy X-gal za vzniku
modrého zbarvení
• látka je mutagenní ... ... modré plaky
• látka není mutagenní ...... bílé plaky
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Látky ve stravě a kancerogeneze
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Biologické karcinogenní faktory:
Virová transformace
Živé příčiny: viry
Helicobacter pylori – spojován s ca. žaludku
10% v současné době popsaných virů má onkogenní charakter, nádory
i při prokázaném virovém původu však nelze považovat za infekční
v pravém slova smyslu – mechanismus, hostitelské předpoklady
RNA viry x DNA viry
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Retroviry= RNA-viry s reverzní
transkriptázou
Retroviry obecně:
• transformující => vznik nádoru, nebo
• netransformující (chybí informace pro maligní přeměnu, bez
cytopatického efektu)
• výjimečně způsobuje i nenádorové onemocnění – HIV (infekce
lymfocytů)
Nesou
• strukturní a funkční geny
• reverzní transkriptázu
• LTR (long terminal repeat) úseky s funkcí promotoru a enhanceru –
regulující transkripci v hostiteli (DNA mRNA)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
• silně onkogenní vir - nese přímo onkogen (v-onc = virový onkogen,
např. v-src, v-ras vs. c-ras)
• slabě onkogenní vir, nemusí obsahovat v-onc, transformuje
prostřednictvím LTR inzerovaného v sousedství celulárního
protoonkogenu (p-onc)
• vir nese gen-tat kódující protein, který zprostředkovává transaktivaci
celulárních onkogenů
3 mechanismy transformace retroviry
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Transformace retroviry: příklady
U člověka prokázána pouze transformace virem HTVL-1 (slabě
onkogenní, nenese v-onc, onemocní 1% nakažených 20-30 let po
infekci, leukémie-Japonsko, Karibik, sporadicky)
RNA viry u zvířat:
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Nižší transformační potenciál (méně agresivní) než RNA-viry, ale
epidemiologicky závažnější
V jádře napadené buňky replikace virové DNA, permanentní přechod
buněk z G0 a G1 fáze do S fáze
DNA-onkogenní viry
Příklady:
HPV – human papillomavirus (ca. děložního
čípku,…) – proteiny E6 a E7: blokace antionkogenů
p53 (E6) a RB1 (E7)
EBV – Epstein-Barrové virus (Burkittův lymfom;
mononukleóza)
HBV – hepadnavirus (hepatocelulární ca.;
hepatitida B)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Konstituční karcinogenní faktory:
protoonkogeny, onkogeny a antionkogeny
celulární protoonkogeny (p-onc) a onkogeny (c-onc)
Aktivace p-onc:
•Inzerční onkogeneze: Inzerce LTR retroviru do sousedství p-onc
(inzerce promotoru nebo enhanceru)
•Přestavba chromosomu: Translokace nebo delece vedoucí k
přiblížení aktivního promotoru a p-onc
•Bodová mutace: c-H-ras (Gly->Val, N-nitroso-N-methyl močovina)
•Genová amplifikace onkogenu  karyotypické odchylky
Onkogeny  onkoproteiny
Regulační funkce v buněčném dělení a diferenciaci
Antionkogeny: RB1, p53
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
KARCINOGENEZE
Multifaktoriální a vícestupňový proces
• Fyzikální karcinogenní faktory
• Chemické karcinogeny mutace DNA vedoucí k aktivaci
• Biologické karcinogenní faktory onkogenů a/nebo inaktivaci
• Konstituční karcinogenní faktory antionkogenů
Reparační mechanismy
• fungují  oprava DNA
• nefungují
pak buď
 apoptóza
nebo
 šíření mutací do dalších buněčných generací  karcinom
Regulace
prostřednictvím
p53
Jakými mechanismy??…
Viz přednáška o signálních
dráhách - R.Hrstka
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Morfologické změny u transformovaných
buněk
• Změny morfologie: oblejší tvar
• Ztráta závislosti na přichycení
• Ztráta inhibice růstu vzájemným kontaktem
• Změny cytoskeletálních struktur (aktinová filamenta)
• Změny v povrchových antigenech
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Biochemické změny
u transformovaných buněk
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Hypoxie, její příčiny a důsledky
• Rychlý růst nádorových buněk a proto rychlejší metabolismus
• Vyžadují zásobování kyslíkem
• Vyšší hladina hemoglobinu v nádorových buňkách
• Za nedostatku kyslíku může nastat přechod na anaerobní
glykolýzu, ovlivnění pH (laktát), syntéza enzymů pufrujících pH
• Podpora angiogeneze pro lepší zásobování buněk kyslíkem
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Změny v metabolismu sacharidů
Glukosa ATP
Glykolýza – anaer. (katabolismus)
Glukoneogeneze (anabolismus)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Změny v metabolismu lipidů
Katabolismus anabolismus
ATP
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Změny v metabolismu bílkovin, dusíku a AK
Proteolýza Transaminace
NH4
+
2-oxokyseliny
volné AK jako stavební složky nově
syntetizovaných proteinů
ATP
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Další biochemické změny u
transformovaných buněk
•Metabolické změny – sekundárním důsledkem obvykle zvýšené
proliferace, nelze použít např. k diagnostice
•Zvýšená aktivita ribonukleotidreduktasy
•Zvýšená syntéza DNA a RNA
•Snížený katabolismus pyrimidinů
•Ztráta diferencovaných biochemických funkcí (syntéza specializovaných
proteinů)
•Nadměrná syntéza některých růstových faktorů a hormonů
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Znalost fenotypových změn u
transformovaných buněk je zásadní pro
nalezení účinné chemoterapie
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Látky užívané v chemoterapii nádorů
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Léková rezistence a její příčiny
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Některé klinicky užívané nádorové
markery
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Literatura k tématu
(současně zdroje obrázků)
• Rejthar A., Vojtěšek B.: Obecná patologie nádorového
růstu. Grada Publishing, 2002, str. 67-90.
• Murray R.K., Harperova biochemie. Nakladatelství a
vydavatelství H&H, 2002, str. 749-769.
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)