PROTEOMICKÉ PŘÍSTUPY V EXPERIMENÁLNÍ ONKOLÓGII Pavel Bouchal Analýza genové exprese: protein, nebo mRNA? Protein: „proteom" (PROTEin complement expressed by a genOME) • informace o skutečných efektorech buněčných procesů - (což není případ mRNA) • proteiny jsou oproti mRNA chemicky velmi heterogenní - různá hydrofobicita aminokyselin - stanovení genové exprese na úrovni proteinu je složitější mRNA: „transkriptom" • hladiny mRNA neodpovídají plně hladinám proteinů (degradace mRNA-čas, splice varianty, posttranslační modifikace proteinů) • stanovení genové exprese je snadnější ve srovnání s proteiny H RCCOOH PŘEHLED AMINOKYSELIN H— Gly ch3- Ala H,C :ch— H3C Val \ :ch-ch2— hhc Leu H3C CH2^ CH- H3C Ne -CH2— Trp -CH2— Phe HO—CH^ Tyr HO-CH2-Ser H3C—CH-I OH Thr HS—CH2— Cys C H3—S—C H2—C H2-Met HOOC-CH2-Asp HOOC-CH2-CH2-Glu H2N \ O C—CH2— Asn HoN \ O ,C C H2~C H2 Gin H2 N—C H2—C H2—C H2-C H2 Lys H2 N—C—N H—C H2-C H2-C H2-h NH Arg -CH2- ISL^NH His CHp-CHo II CH2,CH—COOH NH Pro HSe—CH2— SeCys Analýza genové exprese: metody k dispozici Proteinové metody • Separace proteinů (elektroforéza, chromatografie) nebo peptidů-před MS • Identifikace proteinů: hmotnostní spektrometrie (MS), nebo imunochemie - protilátky • Protilátky: proti konkrétnímu proteinu (variantě), velmi specifické (ale někdy crossreaktivita!), velmi citlivé • MS: identifikace i několika tisíc proteinů současně, méně citlivé mRNA metody • nejprve přepis mRNA -> cDNA (reverznítranskriptáza) • qRT-PCR - analýza exprese 1 genu - PCR amplifikace • více genů: čipové metody (expresní čipy-i pro celý genom): na principu hybridizace nebo se zahrnutím PCR (citlivější) Analýza genové exprese: protein, nebo m RNA? • Co si tedy vybrat? ... nejlépe obojí (potvrzení na více biologických úrovních), kvantifikace na úrovni proteinu je ale zásadní, např. tedy: Proteomika Western blot qRT-PCR Imunohistochemie Nejpoužívanější proteomické přístupy a jejich kombinace (osnova další části přednášky) • Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) • Hmotnostní spektrometrie • SELDI-TOF MS • SILAC značení • ÍTRAQ-2DLC-MS/MS • MRM • Vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie • Protilátkové arrays (cell arrays, tissue arays) Příprava vzorku pro 2-DE Homogenizace a solubilizace Buněčné linie: stačísonikace v lyzačním pufru Tkáně: mechanická homogenizace + sonikace v lyzačním pufru Plazma, sérum: nechat stát v lyzačním pufru Inhibice proteas (Complete™, PMSF)!!! Inhibice fosfatas (Na2V03, NaF)!! Odstranění nukleových kyselin (benzonasa)!! Odstranění dalších interferujících látek (je-li třeba)! Nízká iontová síla (10 mM soli)!!!! Analýza „subproteomů" cytoplasma, ribosomy: diferenciální centrifugace membránová frakce: diferenciální centrifugace, extrakce detergenty (TX-114) nebo extrakce Na2C03 Precipitace vzorku (zakoncentrování, delipidace): aceton, trichloroctová kyselina Solubilizace vzorku ~lh/lab T, NEZAHŘÍVAT nad 37 °C, pak centrifugace (-16000 g, 20 min,4°C) Solubilizace vzorku • CHAOTROPNÍ ČINIDLA denaturují proteiny 7 M močovina, 2 M thiomočovina DETERGENTY obalují hydrofobní části bílkovin a tím zvyšujíjejich rozpustnost 2-4% CHAPS nebo 1% ASB 14 nebo 1% C7BzO; 0,5-1% TRITON X-100 • REDUKČNÍ ČINIDLA štěpí disulfidické vazby-S-S- mezi cysteiny 50-100 mM dithiothreitol • AMF0LYTY pufrují pH a také zlepšují rozpustnost proteinů Pharmalyte, Bio-Lyte, Ampholyte (0,2-2%) Příklady: 7 M močovina, 2 M thiomočovina, 4 % CHAPS, 70 mM DTT, 2% amfolyty nebo 7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1 % C7Bz0, 70 mM DTT, 2% amfolyty nebo 7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1 % ASB 14, 1% TRITON X-100, 70 mM DTT, 2% amfolyty (směs pro membránové proteiny) Příprava vzorku z buněčné linie: praktický příklad protokolu -k peletu buněk přidat lyzační pufr (7M močovina, 4% thiomočovina, 1% C7BzO, 40 mM Tris,70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10, Complete Mini 1 tbl/10 ml, 5 mM NaF, 0.2 mM NaV03) -desintegrace ultrazvukem 60 x 0.1 s -solubilizace 75 min/lab T; po 60 min přidat 150 U benzonasy -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -stanovení bílkoviny -150 jig proteinu (pro barvení stříbrem) precipitovat 7,5 násobkem acetonu přes noc / -20°C -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -resolubilizace peletu v rehydratačním pufru (7M močovina, 2M thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10) -nanesení na IPG strip Modifikace dle: Bouchal P., Zdráhal Z., Helénova Š., Janiczek O., Hallberg K.B., Mandl M., Proteomics 2006, 6, 4278-4285 Příprava vzorku: obecné doporučení „AS SIMPLE AS POSSIBLE" 1. rozměr: isoelektrická fokusace (IEF) Separace podle pl. Počítají se volthodiny (Vh) IPG-IEF (proužky s imobilizovaným pH gradientem) - dobrá re p rod u kováte I n ost, napětí až 10000 V, současný standard, komerčně dostupné Základní pH gradienty 3-10, 3-10 NU 3-11 NU 4-7, 6-11 Gradienty v úzkém rozsahu i jedné jednotky pH Dávkování vzorku: in-gel rehydratace (standard) cup loading (bazické gradienty, např. pH 6-11) CA-IEF - IEF s nosnými amfolyty (vytvářejí gradient pH v trubičkových gelech ) - obtížná manipulace, nedobrá re p rod u kováte In ost, katodický drift, již málo používané (nerovnovážný systém pro analýzu bazických a kyselých proteinů; trubičkové gely) - obtížná kontrola chování gradientu, již málo používané 2. rozměr: SDS-PAGE • Ekvilibrace IPG proužků před SDS-PAGE: obalení proteinů SDS -(uděluje proteinům uniformní náboj na jednotku hmotnosti), další redukce (DTT) a alkylace (jodacetamid) • SDS-PAGE (malý i velký formát) 10 až 12 % (homogenní) Mr 15000-100000 8-16% (porozitní gradient) Mr 10000-150000 re p rod u kováte I n ost! • Pufrové systémy: tris-glycin-SDS (=„Laemmli") - standard tricinový (pro nízkomolekulární proteiny, Mr 1000-25000) Aparatury na SDS-PAGE Barvení gelů relat. citlivost • Stříbrem: analytické (problémy s MS!) + + + • Coomassie brilliant blue (mikropreparativní) + koloidníCBB + + • SYPRO Ruby/Orange -fluorescenční + + (+) (analyt.+mikroprep.) • Phosphoimaging + + + (analyt., inkorporace značeného izotopu během biosyntézy proteinů) • DIGE (diferenční gelová elektroforéza) + + (+) (fluorescenční obarvení 2+1 (referenční) vzorků před 2-DE analýzou (Cy2, Cy3, Cy5), všechny vzorky v 1 gelu, vizualizace: 3 různé X (referenční) - laserový skener Srovnání barvení gelů 2-D proteinová mapa PŮ71B7 M Pi 379$ P34S32 jP0B23B P11021-^ Pr1t.1«' P07237 * P27797 \ P23I \ \ PtU6Bf phi**!071' , P122T7 ' P50Z1- »■ * P12324 pi2SzT J pw7sa ^* V ,^PC73na~-P-: .v;* r-P409tup P06753 *«/ ^ POt7í)2* P10768 P1pf569 r "^Pofíos/ p2*79 "f47735 000764 P06733 26 po 3 'r poayg^PWBs pim f p2267/< p09936 ^„rľľ?^58 V * ľ*" ~ I j|^p07554 POUibf: '00505 P12532 P04Ů75 rj[l4 4LlS O033& p2179g ^-PS^Ts™^3 Pí 3693 / P306Z6 y ■-■ji 14 PtS<(Q4 P3001& P2S1Ě1 Jp15531 "Pd&HI h Q1G7&1 101 5540 Jtj94 30 4.5 5.0 Pl 6.0 Langen H. etal.: 2-DE map of human brain proteins. Electrophoresis 20, 907 (1999) Obrazová analýza 2-DE gelů • Odečtení pozadí a detekce spotů • Manuální kontrola a korekce detekovaných spotů • Vzájemné přiřazování odpovídajících si spotů na různých gelech v jedné sadě (matchsetu) - MATCHING • Kvantitativní a statistická analýza dat • Tvorba obrazových 2-D databází PDQUEST (Bio-Rad) IMAGE MASTER (GE Healthcare) DeCyder (2-D DIGE, GE Healthcare) a další 2-D DIGE (diferenční 2-D elektroforéza) Literatura k 2-DE GórgA., Weiss W., Dunn MJ., Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics 2004, 4, 3665-3685 Westermeier R., Naven T., Hópker H.R., Proteomics in Practice: A Guide to Successful Experimental Design, 2nd Edition. Wiley 2008, ISBN: 978-3-527-31941-1 ... pro ty, kteří ji budou prakticky využívat Ke zkoušce: Příprava vzorku: homogenizace; denaturanty a jejich účinek Základní princip separace Které metody barvení se používají a jejich srovnání Princip 2-D DIGE Hmotnostní spektrometrie MS spektrum m/z Iontové zdroje: MALDI (matrix-assisted laser desorption-ionization) Analyzátory: TOF(time-of-flight) IT (ion trap-iontová past) Q3 (trojitý kvadrupól) ESI (electrospray Kombinace analyzátorů ->hybridní ionization) systémy Iontové zdroje: MALDI vs. ESI MALDI (matrix-assisted laser desorption-ionization) Krystalizace proteinu s matricí Ionizace laserem - ionizace probíhá z pevné fáze Většinou l-2x nabité ionty ESI (electrospray ionization) On-line napojení kapalinové chromatografie na MS (LC-MS/MS) Ionizace elektrosprejem - ionizace probíhá z kapalné fáze Vícenásobně nabité ionty Co umožňuje „běžná" hmotnostní spektrometrie Identifikace proteinů z gelu a roztoku: Štěpení trypsinem na peptidy -> MS spektrum -> peptide mas< fingerprinting v MS módu peptidy ve hmotnostním spektrometru lze dále fragmentovat -částečná sekvenace peptidů -> peptide mass fingerprinting v MS/MS módu (přesnější identifikace) identifikace probíhá na základě srovnání s databázemi Kvantifikace proteinů a peptidů: kvantifikace proteinů: SELDI-TOF MS, MALDI imaging kvantifikace peptidů v MS módu: SILAC, ICAT kvantifikace peptidů v MS/MS módu: i MS versus MS/MS SELDI-TOF MS • Surface - enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry • Příprava vzorku: podobně jako pro 2-DE • Surface=povrch čipu, na nějž se proteiny vážou na základě chemické nebo biochemické interakce Biochemické povrchy B? Ä M Á protilátka DNA enzym receptor Chemické povrchy SELDI-TOF MS pracuje pouze v MS módu, detekuje celé intaktní proteiny SELDI MS spektrum Kvantifikace pomocí SELDI-TOF MS Princip: Srovnání ploch píků mezi spektry - např. z různých pacientů entifikace proteinu=problem! kombinací separačních přístupů a externího MS/MS- zdlouhavá, často se nedaří. Je třeba mít štěstí Kvantifika SILAC= Stable isotope labeling by amino acids in cell culture Značené AK k dispozici: Lys, Arg Cells in Light, 12C6-Arg medium 13CrArg: 13C6H1zN40 Cells in Heavy, 13C6-Arg medium NH2 HH ,3CH2 WGH2 WCH2 Whole proteome mgdf tks f ke f Idac Injjgdps f r ptakellkhkfivftsilacsyl Heavy t e 1 i djr f wk a eghs dde s ds e proteins ghpe ws f 11 vgjjkkpdpkkvqn i s niceBaeqdlvqtlsclsmitB (\ Trypsin digest Heavy peptides efidaclng dpsfrptak tsilacsyltelic vqnisnica^ mgdftk 05 c mcoded with 13Cg-Arg Analysis by MS r Light Heavy ; + 6 Da i ^ s ■ & ES S ....................■■■■■■- m/z Mass shift of 6 Da introduced Kvantifikace s použitím SILAC značení control Starting Cell Culture in DMEM treated Media with light' AA (• ) Media with 'Heavy'AA(V) i?1 '55 c Begin SILAC Labeling m/z >4 'en B c Passage cells m/z '55 CD c m/z After five ce doublings m/z m/z m/z Relative protein abundance of proteins observable in mass spectrum after mixing cells from both SILAC light and heavy cultures -> m/z iTRAQ - 2DLC-MS/MS iTRAQ = Isobaric tags for relative and absolute quantitation Postup: • Příprava vzorku (např. 0.1% SDS) - až 8 kvantitativně srovnávaných vzorků v 1 analýze • Redukce a alkylace • Digesce trypsinem • Značení (iTRAQ značky: 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121) • Smíchání 8 značených digestů • Separace peptidů (SCX, IPG, ZIC-HILIC,...) • Kvantifikace a identifikace proteinů (LC-MS/MS nebo MALDI-MS/MS) iTRAQ - 2DLC-MS/MS Schéma typického iTRAQ - 2DLC-MS/MS experimentu (zde 3-plex, nynľje možný až 8-plex) MS/MS spektrum s iTRAQ reportérovými ionty MRM a „targeted proteomics" • MRM=multiple reaction monitoring (=SRM=selected reaction monitoring) • Metoda kvantifikace peptidů z vybraného proteinu na základě tzv. přechodů (transitions) • Metoda vysoce selektivní, citlivá, používaná v analýze nízkomolekulárních látek • Velký potenciál pro validaci výsledků z proteomických studií jako „HMOTNOSTNĚ-SPEKTROMETRICKÝ WESTERN BLOT" - místo přípravy protilátky by mohl stačit návrh „přechodu" pomocí software • Uvádí se teprve do praxe Vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie • FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance • Orbitrap 1 Základní výhoda- j -vysoké rozlišení, díky 1 tomu možnost ořesné id< ikace proteinů Proti látkové arrays Srovnání proteomických metod: Výhody a nevýhody 2-DE SELDI SILAC ítraq-2dlc-ms/ms MRM + Jak správně naplánovat proteomický experiment v experimentální onkológii Jaký biologický materiál analyzovat? • Modelové systémy - buněčné linie • Tkáně • Buňky mikodisekované z tkání (LCM - laser captured microdissection) • Kostní dřeň - leukémie • Plasma - sérum ? ■ Vzorky od pacientů - etická pravidla!! Statistika • Při srovnání exprese nutnost paralelní analýzy minimálně 3+3 replikátů (analytické vs. biologické replikáty) • Normalizace dat • Kvantitativně vs. statisticky významný rozdíl: >2x vs. p-hodnota (Student t-test, Mann-Whitney test); • Korelační analýza - nutno přizpůsobit design studie • Korekce na mnohonásobné testování (FDR-korekce) • při srovnávání více než 2 vzorků vhodná konzultace se statistikem - často nutnost aplikace pokročilých statistických metod • Analyzujeme-li vzorky pacientů, soubor musí být dostatečně reprezentativní a klinicky (patologicky) charakterizovaný - spolupráce s patologem, s lékaři Validace dat na dalších biologických úrovních Screeningové metody: • 2-DE, ÍTRAQ-2DLC-MS/MS, SELDI-TOF Validační metody na proteinové úrovni: • western bloting, MRM Validační metody na úrovni mRNA: • qRT-PCR, (expresní čipy) Validační metoda na proteinové úrovni - tkáňové řezy: • Imunohistochemie !! Problematické skupiny proteinů (2-DE): Extrémně bazické, kyselé, nízko- a vysokomolekulárni proteiny Bazické proteiny (pH > 7) hledat na bazickém gradientu (např. 6-11). V bazické oblasti širokého gradientu pH 3-10 bývá špatné rozlišení. Použít redukční činidlo DeStreak. Kyselé proteiny: pH gradienty v kyselé oblasti jsou ve vývoji Pro nízkomolekulární proteiny (<15 kDa) použít -16% SDS-PAGE + tricinový pufrový systém ve 2.rozměru Vysokomolekulárni proteiny (>120 kDa): obecně problém, zkusit použít 8 % SDS-PAGE či gradientovou SDS-PAGE ve 2.rozměru Hydrofobnía membránové proteiny Jejich nalezení závisí na 1. úspěšnosti extrakce z biol. materiálu 2. použité separační metodě TMHMM-transmembrane hidden Markov model Dynamický rozsah koncentrací proteinů • Jednotlivé proteiny v celobuněčném vzorku se liší až o 12 řádů v rozsahu koncentrací • Více koncentrované proteiny zákonitě překrývají ty méně koncentrované • Málo koncentrované proteiny jsou pod limitem detekce Náznak řešení: • Prefrakcionace • Odstranění nejkoncentrovanějších proteinů (např. albuminu a dalších z krevní plasmy) • Použití imunochemické detekce • Kvantifikace na úrovni transkriptu Dalsf zdroje informacf - reviews v prednfch svetovych casopisech Molecular Cellular Proteoi TlicS ■*■**■ + Quantitative Proteomics by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology series, No.359, Sechi, S. (Ed.). Humana Press 2007