Použití lidského biologického materiálu vePoužití lidského biologického materiálu ve
výzkumu 2012výzkumu 2012
Rudolf Nenutil
Masarykův onkologický ústav
Oddělení onkologické a experimentální patologie
Proč:Proč:
Možnosti a experimentální výtěžnost buněčných modelů jsou omezené
samotná kultivace je selektivní
je velmi obtížné napodobit mikroprostředí
je prakticky nemožné napodobit interakci s imunitním systémem
Je třeba ověřit zda nepracujeme s artefakty
jsou výsledky zobecnitelné pro určitý typ nádorů ?
existuje jejich korelace s klinickými daty ?
mají potenciální význam pro použití v diagnostice nebo léčbě ?
Proč:Proč:
Klinická patologieKlinická patologie
Angloamerický obor nezavedený v našem zdravotnictví
(„Department of Pathology and Laboratory Medicine“)
Klinická patologie vytváří pro lékaře u lůžka ucelený a souhrnný
obraz pacienta podle nálezů všech laboratorních oborů
(biochemie, hematologie, mikrobiologie, imunologie,
histopatologie)
Biologický materiálBiologický materiál
Krev
Moč, stolice, sputum
Stěry
Výpotky
Tkáně
punkční biopsie
mikroexcize
operační biopsie
Zpracování krveZpracování krve
Krev Separace lymfocytů Cytogenetika
Genomová diagnostika
Koagulace a separace Sérové markery
Blokáda koagulace
Separace složek
Plasma, markery
Chirurgická patologieChirurgická patologie
Příspěvek patologa:
 koordinace nálezů
 rozšířená bioptická diagnostika:
- prognostika
- predikce účinku léčby
Příspěvek klinika:
 koordinace vyšetření
 odběr materiálu
 orientace materiálu
 lokalizace a topika léze
 stanovení rozsahu choroby
podle celkového vyšetření
Chirurgická patologie je spolupráce oborově s specializovaného
patologa se stejně zaměřenými kliniky a laboratorními odborníky
na tvorbě diagnózy s využitím všech současných dostupných
vyšetřovacích metod.
Práce je nejčastěji organizována v mezioborových „komisích“
„Surgical pathology“
BiopsieBiopsie
DEFINICE:
Diagnostické histomorfologické vyšetření orgánů a tkání živých
pacientů (= máme k dispozici informaci o struktuře tkáně)
TYPY BIOPTICKÉHO VYŠETŘENÍ:
Mikrobiopsie – („zavřená biopsie“)
- punkční silnou jehlou („core needle“)
- endoskopická excize
Biopsie otevřená
- diagnostická excize, mikroexcize
- vyšetření chirurgického resekátu
CytologieCytologie
„fine needle aspiration, smear“„fine needle aspiration, smear“
DEFINICE:
Diagnostické morfologické vyšetření odebraných buněk
živých
pacientů (máme k dispozici pouze morfologii buněk, ne
tkáně)
TYPY CYTOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ:
Punkční cytologie
- ložiskové léze
- výpotky
Exfoliativní cytologie
- stěry, otisky, sekret
Punkční jehlová biopsiePunkční jehlová biopsie
„„core needle biopsy“core needle biopsy“
1 mm
DEFINICE:
Diagnostické morfologické
vyšetření malého vzorku tkáně
(punkční váleček)
Je možno získat:Je možno získat:
DNA
RNA
Proteiny
Omezení:
chybí morfologická korelace (=nevíme co přesně máme)
množství materiálu je malé
vzorek je neopakovatelný
Vyšetření operačního resekátuVyšetření operačního resekátu
„surgical specimen“„surgical specimen“
DEFINICE:
Diagnostické morfologické vyšetření orgánu nebo jeho
části
 Zaslaný materiál
• co a odkud jest odebráno, způsob odběru, fixace
• označení vzorku (-ů)
 Pacient
• příznaky a jejich trvání
• relevantní výsledky provedených vyšetření (RTG,
biochemie, KO, endoskopie...)
• výsledky předchozích histologických vyšetření
• další závažné choroby
• cílený dotaz
Klinické údajeKlinické údaje
Co se s materiálem děje na patologii?Co se s materiálem děje na patologii?
 Makroskopický popis a „přikrojení“
 odběr na speciální metody, např. genetické
 Dokončení fixace
 Tzv. parafinový proces (voda nahrazena
parafinem)
 Řezání: 4-6 mikrometrů silné řezy
 Barvení různými metodami
 Diagnostika
Zpracování bioptického materiálu v onkologiiZpracování bioptického materiálu v onkologii
Primární
rozdělení
tkáně
ZMRAŽENÍ NATIVNÍ FIXACE
RNAlaterDalší
ošetření
Kryobloky Otisky, stěry Odběr pro
cytogenetiku
Parafinové
bloky
Uložení do banky
Izoláty pro molekulární diagnostiku
Výstup I
(rutinní)
Peroperační
biopsie
Peroperační
cytologie
Bioptická
diagnóza
Výstup II
(speciální)
Analýza : PCR, RT-PCR atd.
Proteomika
FISH, ISH
(IHC)
Cytogen.
diagnóza
IHC, FISH,
ISH
Kryobanka Databáze mikroskopických obrazů
Databáze mikroskopických nálezů
Archiv
bloků Izolátů RNAlater Banka bloků
Legislativní aspektyLegislativní aspekty
Česká republika je členem „: Úmluvy o lidských právech a
biomedicíně. “
Novela zákona 20 z roku 1966 o Zdraví lidu platná od 1.1.2008
Paragraf 26:
Lidskou tkáň je pro účely vědy a výzkumu možno použít „pouze
pokud byla pacientovi o možnosti jejího uchování a použití pro
lékařské potřeby podána ošetřujícím lékařem informace a pacient
s tím vyslovil prokazatelný písemný souhlas; součástí souhlasu
je vymezení účelu použití částí těla pacienta“.
Použití materiálu z biobanky pro výzkum schvaluje lokální etická
komise. Výběr z banky může rovněž podléhat schválení vědecké
komise (hodnotí adekvátnost a potenciál projektu).
Banky biologického materiálu
Více např.: http://www.isber.org http://www.bbmri.eu
+ Perfektně morfologicky charakterizovaný
Lze snadno mikrodisekovat v případě potřeby
Umožňuje perfektní lokalizaci na cílové struktuře
Každá patologie ho archivuje, možno vytvořit velké sestavy
- Zatížen artefakty zpracování, tj.:
izolace a amplifikace DNA : omezeně
izolace a amplifikace RNA: velmi omezeně
izolace a blotting proteinů: prakticky nemožné
Parafinový materiálParafinový materiál
„„FFPE“FFPE“
Speciální techniky biopsieSpeciální techniky biopsie
Speciální histologie:Speciální histologie:
 Histochemie
 Imunohistologie
 El. mikroskopie
 Morfometrie
Molekulární metodiky:Molekulární metodiky:
 ISH - hybridizace in
situ (FISH)
 PCR in situ - PCR v
histologických řezech
 CGH (komparativní
genomová hybridizace
Chromogen
Sekundární protilátka
Primární protilátka
Antigen
Princip imunohistochemiePrincip imunohistochemie
Snadné vyhledání specifických buněk
Histogeneze a typizace nádorů
Prognostické parametry
Predikce odpovědi nádoru na léčbu
Exprese biomarkerů ve vazbě na specifickou strukturu
Koexprese biomarkerů
K čemu je to dobréK čemu je to dobré
Imunohistologie - melanA
Snadné vyhledání specifických buněkSnadné vyhledání specifických buněk
Heterogenita nádoru a metastazující klon -
Her-2
Primum Metastáza
Klonální evoluce - paralelní barvení Her-2/neu a
estrogenového receptoru v ca prsu (oba hnědá)
Ojedinělé buňky oba + Divergence klonů Klony samostatně
Steroidní receptorySteroidní receptory
 Sonda (próba) - krátký úsek DNA
komplementární ke hledané
sekvenci, předem označený.
Hybridizace in-situHybridizace in-situ
 FISH - fluorescenční in situ hybridizace
 sonda označena fluorochromem
 pozorování ve fluorescenčním mikroskopu
 vyšší rozlišovací schopnost
 možno použít několik sond současně
 specifické sondy proti fúzním genům (bcr/abl..)
FISHFISH
Složený tkáňový blok „Tissue array“Složený tkáňový blok „Tissue array“
Imunohistologie - problémy
 Protilátka která blotuje nemusí být
použitelná pro IHC a naopak
 Falešná pozitivita, nespecifické
barvení
 Někdy obtížná interpretace
Imunohistologie - problémy
Imunohistologie - problémy
1:50 1:200 1:400
Imunohistologie - problémy
Imunohistologie - problémy
1:50 1:200
Technologie HistoRX - AQUA
+ Méně zatížen artefakty zpracování:
izolace a amplifikace DNA : ano
izolace a amplifikace RNA: ano
izolace a blotting proteinů: ano
- Horší morfologická charakterizace
Limitované možnosti TMA
Méně snadná mikrodisekce
Zdroje tkání jsou omezené
Hluboce zmrazená tkáňHluboce zmrazená tkáň
Následné využití získaných
nukleových kyselin
RNA
 Kvantitativní RT-PCR
 Expresní DNA čipy
 Sekvenace
 mikroRNA exprese a
profily
Stanovení prognózy a predikce
léčebné odpovědi
DNA
 PCR diagnostika (HPV
16…)
 Sekvenace, RFLP
analýza - detekce
mutací a
polymorfizmů (p53,
KRAS, DPD,…)
 Metylační status
Individualizace léčby pacientů s nádorovým onemocněnímIndividualizace léčby pacientů s nádorovým onemocněním
Následné využití získaných
proteinů
Imunoblotting
ELISA
2D elektroforéza
Hmotnostní spektrometrie
Laserová mikrodisekce - praxe
Laserová mikrodisekce - praxe
Prognóza = pravděpodobnost
bezpříznakového přežití po definovanou
dobu
příklad: klinické stadium nemoci (anatomický rozsah)
Predikce = pravděpodobnost příznivé
odpovědi na určitou léčebnou modalitu.
příklad: přístomnost estrogenového receptoru (odpověď
na antiestrogeny)
Prognostické a prediktivní parametryPrognostické a prediktivní parametry
Prognóza, predikce odpovědi na cílenouPrognóza, predikce odpovědi na cílenou
léčbuléčbu
Faktory ovlivňující indikaci „necílené“ léčby: prognostické
•Klinické stadium
•Histologický typ
•Histopatologický grade
Faktory ovlivňující indikaci „cílené“ léčby: prediktivní
Přítomnost cílových struktur:
•Hormonální receptory
•Tyrosinkinázy (např. rodina EGFR, c-kit)
•Přítomnost specifických mutací (např K-ras, B-raf V600, EGFR, c-
kit)
 Stručný a výstižný popis materiálu,
zaznamenány zvl. údaje pro pT pN
klasifikaci a pro posouzení resekčních
hranic.
 orgán, ložisko a jeho velikost (mm), vztah
k okrajům či okolním strukturám, další
změny...
 mízní uzliny, jejich počet, patologický
vzhled...
Makroskopický popisMakroskopický popis
 V nejjednodušších případech může chybět
 Popis patologických změn ve tkáních,
výsledky speciálních vyšetření
(imunohistochchemie...)
 Pro klinika „nezajímavé“, ale:
 má forenzní hodnotu
 jiný patolog umí podle popisu rekonstruovat
obraz a rozvést diff. dg. rozvahy (např.
duplicita nebo metastáza)
Mikroskopický nálezMikroskopický nález
 Jasně formulované závěry ke všem
vyšetřeným tkáním (dle platných
klasifikací).
 V případě nejednoznačného nálezu
diferenciálně-diagnostická rozvaha.
 Doporučení dalšího diagnostikého
postupu, nový odběr...).
 „Co není v závěru, jako by
nebylo“
ZávěrZávěr
 Histologický typing
 Histologický grading
 Staging WHO – TNM klasifikace
 Resekční okraje
 Vaskulární invaze, cílové molekuly (SR, EGFR,
HER-2, C-KIT), imunitní odpověď, prognostické
znaky (p53, Ki 67 )
Jaké informace navíc obsahujeJaké informace navíc obsahuje
„onkologický“ bioptický nález?„onkologický“ bioptický nález?
Předmět vyšetření a lokalizace: 1 souuzlinní sentinelové p. axily, akt. 2000
2 resekát mhq p. mamy, steh obv. , perop. zhodnoc.
Klinická diagnóza (popř. stručný klinický průběh): ca mamma el. dx.
Prosíme vyšetření histologické, SR, HER2, proliferace a materiál na TB
Makroskopický nález: 1) SNB z l.dx. axilly: laločnatá, zčásti lipomatózní lymfatická uzlina délky 19 mm, nesuspektní (dr. Lžičařová) - kryo
nezhotoveno.
SNB - zpracováno kompletně.
2) Orientovaný exstirpát vel. 45x55x50 mm. Na řezu v kaudální části infiltrát vel. 15x8x12 mm, kaudální okraj 5 mm, laterální okraj 3 mm,
dorsální okraj 2 mm (fasciální), mediální okraj 10 mm, ventrální a kraniální 20 mm (dr. Lžičařová).
Odebrán nativní materiál pro tkáňovou banku.
Odebrán nativní materiál na p53.
Zapsala H. Chaloupková.
Mikroskopický nález: ad2):
1: para normal=mediální okraj: solidní a kribriformní low grade DCIS s nekrózami. K okraji 1mm.
2: para tumor: invazivní karcinom trabekulárí a tubulární (15%) stavby, jaderná variabilita střední, mitotická aktivita fokálně až 9/2,5mm2. BR
skore 6, grade 2. Angioinvaze přítomna. V okolí tumoru low grade DCIS s nekrózami, kribriformní stavby, SR pozitivní.
3: tumor: idem.
4-5: tumor+kaudální okraj: okraj 3mm pro invazivjí a 1mm pro minoritní DCIS komponentu
6-8: dorsální okraj: 5mm pro invazivní karcinom. DCIS zasahuje bezprostředně do okraje- fascii zde neidentifikuji.
9: dorsolaterální okraj: 5mm pro obě složky.
ad1): 10-11: SNB: mízní uzlina, v HE bez patologie, po seriovém prořezání a detekci CK 19: bez metastatického postižení.
Imunohistochemické stanovení receptorů nádorových buněk bl.č. : 3
ER Labvision SP1, PR Novocastra NCL-PGR-312. Ki67 Labvision SP6.
ER: 100%
PR: 95%
Proliferační antigen Ki-67: 57%
Závěr:
Invazivní duktální karcinom G2 v terénu G2 DCIS. Resekční okraje pro DCIS pozitivní (dorsálně) a těsné 1mm (mediálně a kaudálně). VNPI = 9.
Angioinvaze: ANO.
SR silně pozitivní při vysoké proliferaci. Her-2 dle dokumentace negativní - 0 (Plzeň).
SNB: negativní.
KLASIFIKACE:
topografie(ICD-O-3): C509 (vpravo), morfologie(ICD-O-3): 8500/32, dg: C509, pTNM(7): pT1c (15 mm) N0(i-)(sn) (sn uzliny[poz/vyš]: 0/1)
[pN], L1
 Typ - názvosloví (WHO, ICD-O)
 Stadium – anatomický rozsah nádoru (TNM)
 Grade – morfologický odhad malignity nádoru
 Rating - prognostika a predikce účinku
specifické terapie
Sumarizace – co u nádorů stanovujemeSumarizace – co u nádorů stanovujeme
Standardní nomenklatura WHO (ICDO-3):
8500/33
Histologický typHistologický typ
Morfologie
Např.
8890 spinocelulární
karcinom
9010 fibroadenom
…
Biologické chování
0 benigní
1 nejisté
2 in-situ
3 maligní
6 metastáza
Grade 1 až 3
Odhad „stupně malignity“, „diferenciace“
V praxi = konvenční morfologická kritéria, liší se podle lokalizace a
morfologie nádoru
 Karcinom prsu: tubulární formace, jaderná polymorfie, mitotická
aktivita
 Sarkomy měkkých tkání: podobnost výchozí buňce, nekrózy,
mitotická aktivita
 Folikulární lymfomy: zastoupení „větších buněk“
 Prostata: Gleason skóre
 …
Histologický gradeHistologický grade
TNM a klinické stadiumTNM a klinické stadium
T(umor) N(odi) Metastases
 Tumor: nejčastěji kombinace velikosti a
anatomického rozsahu
 Uzlinové metastázy: ano-ne, případně počet a
lokalizace
 Vzdálené metastázy
Bez prefixu: klinická, prefix p pooperační …
Klinické stadium: určité kombinace TNM,
římské číslice I-IV
Např. pT1 pN0 pM0 stadium I
pT1-2 pN1 pM0 stadium II
jakékoliv pT jakékoliv pN M1 stadium IV
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
4
3
2
1
STADIUM
Biologické prediktory, ratingBiologické prediktory, rating
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
CD1
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
PR
Specifické pro některé nádory např.:
 Estrogenový receptor a Her-2 amplifikace u karcinomu prsu
 Mutace K-ras u karcinomu tlustého střeva
 …
Určují někdy i odpověď na specifickou (tzv. „biologickou nebo
cílenou“ léčbu
Jenže to není tak jednoduchéJenže to není tak jednoduché
Prognostické a prediktivní parametry spolu navzájem korelují
Léčba může vše ovlivnit..
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Survival Plot
0 20 40 60 80 100 120
Time
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SurvivorFunction
2
1
HER2
Bez chemoterapie S chemoterapií
K čemu je to dobréK čemu je to dobré
 Indikace onkologické léčby
 Sledování epidemiologie nádorů a úspěšnosti léčby nebo
diagnostiky
 Výzkum, klinické studie
K čemu je to dobréK čemu je to dobré
 Molekulární klasifikace nádorů
 „Cancer genome project“ http://icgc.org/
 Mapování drah a „druggable targets“The Cancer Genome Atlas
Network – Nature, v tisku
Jak má vypadat sestava biologickéhoJak má vypadat sestava biologického
materiálu k výzkumnému použitímateriálu k výzkumnému použití
Epidemiologicky reprezentativní (průřezová,
„konsekutivní“) – k evaluaci jevu nebo biomarkeru
Nebo naopak velmi cílená (= uniformní ve všech
parametrech kromě sledovaného), k objevu nových
biomarkerů
Musí být k dispozici klinická data
Materiál musí být homogenně zpracovaný
Materiál musí být adekvátní k zamýšleným metodám
Musí být proveditelná (a provedena) kontrola kvality pro
použité metody