Roman Hrstka ÚÚvod dovod do nnáádorovdorovéé biologiebiologie Masarykůůůův onkologický ústav, Brno hrstka@mou.cz ŽŽŽŽŽŽŽŽivotnivotníí cykluscyklus Vývoj a růst organismu – rovnovážný stav (reparační mechanismy, proliferace~buněčná smrt) – stárnutí – smrt. • Metazoa – krátký životní cyklus, dospělí jedinci tvořeni převážně post-mitotickými buňkami • Obratlovci – delší život, velká část buněk stále schopna dělení a proliferace Vývoj mnohobuněčěčěčěčného organismu 1. Dělení (cleavage) 2. „Pattern formation“ - zajišťuje, založení orgánů na správných místech 3. Organogeneze 4. Růst Nádor, tumor, neoplazma, novotvar - je nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu, která v tomto organismu nemá fyziologickou funkci a roste neregulovaným způsobem. - je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst není v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu. Klasifikace nádorůůůů: (A) podle schopnosti infiltrovat se do jiné tkáně • Benigní (nezhoubné): zůstávají v místě svého vzniku, nemigrují, neinvadují jiné tkáně. • Maligní (zhoubné): pronikají do okolních tkání a prostřednictvím krevního a lymfatického systému do celého těla, v nových tkáních vyvolávají tvorbu sekundárních nádorů (metastází) (B) podle původu • Karcinomy: z epiteliálních buněk (~ 90% nádorů) • Sarkomy: z pojivových tkání (< 1% onemocnění) • Leukemie: z hematopoetických buněk Kancerogeneze • je proces vzniku a vývoje nádoru • je vícestupňový proces • podstatou kancerogeneze je postupné hromadění genetických (a epigenetických) změn 1 1 11+2 1 1+2 1+2+3 1+2 1 Normální buňňňňka mutace 1. 2. 3. 4. 1+2+3 1+2 1 Nádorový potenciál Maligní transformace Hromaděěěění mutací Molekulární model iniciace nádoru (familiární adenomatózní polypóza) tlusté střřřřevo hlava a krk ččččípek plíce kuřřřřáka prs prostata POČÁTEČNÍ STŘEDNÍ POKROČILÝ CIS NORMÁLNÍ PREKANCERÓZNÍ KARCINOM 5-20 let adenom 5-15 let kouření 4-10 let dysplastická ústní leukoplakie 6-8 let CIN I 9-13 let CIN III / CIS 10-20 let 20-40 let atypická hyperplazie DCIS 6-10 let PIN ≥10 let latentní karcinom 3-15 let Neoplastická transformace Jako první byly ve vztahu k tvorbě nádorů objeveny geny RNA virů v genomu obratlovců odpovědné za transformaci normální buňky na buňku nádorovou (nazvané onkogeny), které byly částečně nebo i kompletně aktivovány karcinogeny, zářením nebo i normálním procesem stárnutí. 1969 Objevení onkogenůůůů! Co z toho vyplynulo? Pochopení mechanismů, kterými se normální buňka brání expresi těchto endogenních virových informací, může vést k nalezení cesty potenciální terapie některých typů nádorů. Onkogeny Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky, který se svým translačním produktem podílí do značné míry na regulaci dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je protoonkogen pozměněný nebo aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky. Mutace protoonkogenůůůů jsou: - aktivující - dominantní - vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně v zárodečných buňkách [Vrozená citlivost k medulárnímu thyroidnímu karcinomu (MTC) je typickým příkladem hereditárního karcinomu způsobeného mutací RET protoonkogenu. prediktivní genetické vyšetření] I. Fúze buněěěěk Nádorová buňňňňka Normální buňňňňka Hybrid Výsledky fúze • Hybridní buňky rostou jako normální buňky. • Charakteristika maligního růstu je recesivní. Normální buňky potlačují abnormální růst. • V případě ztráty některých chromozomů, se maligní růst znovu projeví. Nesouhlasí s teorií o onkogenech. Nádorové supresory Produkty genů pro nádorové supresory (antionkogeny) v normálních buňkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stádiu klidu (G0). Jejich ztráta se projevuje neregulovanou proliferací. Mutace nádorových supresorůůůů jsou: - inaktivující - recesivní (spojeno s LOH) („recesivní onkogeny“) - vyskytují se v somatických a také v zárodečných buňkách March 15th 1979 Virology. 1979 Oct 30; 98(2):308-18. The SV40 A gene product is required for the production of a 54,000 MW cellular tumor antigen. Linzer DI, Maltzman W, Levine AJ. Objevení proteinu p53 p53Rb velký T antigen N C 1988 1990 Pročččč nebyla od poččččátku objevení proteinu p53 jasná jeho funkce? Gen a protein p53 Gen leží na chromozomu 17 (17p13) a má 11 exonů (z nichž první se neexprimuje). Protein je jaderný fosfoprotein, 393 AA, 53 kDa. - poprvé popsán jako protein interagující s LT SV40 - jedná se o transkripční faktor - funguje jako tetramer - konsensus sekvence: 5´- Pu-C(A/T)(A/T)G-Py - 3´ - mutace u cca 40% všech lidských nádorů p53p53 p53p53MDM2MDM2 Fyziologické podmínky Degradace p53 v proteasomech NuclearNuclear exclusionexclusion Nízká hladina p53 v jádře p53p53 p53p53 p53p53 p53p53 Stresové podmínky p53p53 MDM2MDM2 MDM2MDM2 se nevse neváážžžžžžžžee Zvýšení hladiny p53 Exprese cExprese cíílových genlových genůů UbiUbiUbiUbUbUbUbUbUb Posttranslačččční modifikace p53 Posttranslační modifikace souvisejí s regulací aktivity a také stability p53. Struktura proteinu p53 DNA binding domain DNADNA bindingbinding domaindomain N- terminal domain NN-- terminalterminal domaindomain Transcription machinery MDM2MDM2 regulatoryregulatory domaindomain CC--terminusterminus Expression of target genes DNA binding Ubiquitination and degradation 11 22 33 Regulace stability p53 mdm2-gen p53 promotor ribozom mdm2 protein mdm2-mRNA p53 Ub p53 Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Regulace buněčěčěčěčné lokalizace p53 p53 má na C-konci několik signálů jaderné lokalizace - NLS, je po syntéze transportován do jádra. p53 má dvě sekvence pro export z jádra - NES: v oligomerizační doméně (ve funkčním tetrameru odstíněno) a na N-konci v MDM2 vazebné doméně. Export z jádra je výrazně potencován vazbou MDM2 (i když vazba MDM2 není podmínkou) a také ovlivněn fosforylací v dané oblasti: fosforylace vyvolaná stresem inhibuje transport z jádra (vedle toho, že znemožňuje vazbu MDM2) Popsána kináza Parc, která zadržuje p53 v cytoplasmě. p53 funguje hlavně jako transkripční faktor. Proč je regulován export z jádra? 1. Je to další mechanismus umožňující přesnou regulaci p53. 2. Export z jádra souvisí s nějakou další funkcí p53 v cytoplasmě (apoptóza - lokalizace v mitochondriích). Responses To p53 Activation HarrisHarris CCCC andand LevineLevine AJAJ,, OncogeneOncogene ((20052005)) Induction of target genes p53 p53 Target gene Genomic integrity Growth control Protein Interactions p53 BclXlBclXl p53p53 Other?……………. http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr Pathways of p53 Activation P ATM/ATR Chk2 CK2 p53 Genotoxic stressGenotoxic stress Non-genotoxic stressNon-genotoxic stress E2F ras β−β−β−β−catenin c-myc Oncogenic stressOncogenic stress p14Arf Target gene JNK P38 MAPK Rac1 MDM2 http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr The p53 pathway: positive and negative feedback loops HarrisHarris SLSL andand LevineLevine AJAJ,, OncogeneOncogene ((20052005)) http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr TP53 is a Tumor Suppressor Gene p53+/+ p53+/- p53-/- 1% at 18 months % mice with tumor 75% at 6 months 2% at 9 months Donehower LA, Harvey M, Slagle BLDonehower LA, Harvey M, Slagle BL et al.et al. NatureNature ((19921992)) p53 +/+ mdm2 +/+ p53 +/+ mdm2 -/- p53-/Mdm2 +/+ p53-/Mdm2 -/TP53 a vývoj embrya p53 izoformy BourdonBourdon JC.JC.,, FernandesFernandes KK.. etet alal.. GenesGenes DevDev.. (200(20055)) p63 & p73 isoformy alternativní sestřřřřih a promotory Yang and McKeon,Yang and McKeon, Nat Rev Mol Cell Biol.Nat Rev Mol Cell Biol. ((20002000)) TP53 17p13 Zvýšená citlivost ke spontánní kancerogenezi TP73 1p36 vážné neurologické defekty (hypokampální malformace, hydrocefalus) chronické infekce a záněty, postižení feromonových senzorických drah Není zvýšená citlivost ke spontánní kancerogenezi TP63 3q27-28 zkrácené končetiny, nemají vlasové folikuly, zuby, prsní, slzné a slinné žlázy T T T T TP53 rodina: rozdílné funkce Zlomy DNA inhibitory topoizomeráz radioterapie Alkylačččční ččččinidla UV zářřřření DNA crosslink Hypoxie Onkogeny Porušení mitózy ATMATR Chk1Chk2 ARF Apoptóza Inhibice angiogeneze Reparace poškozeníp21 WAF1 14-3-3σσσσ Reprimo GADD45 p53R2 Bax, PUMA, NOXA CD95, Killer/DR5 APAF, Casp9, PIDD Eph2A, Tsp1, BAI1, MMP2, PML, PTEN Scotin Zástava děěěělení Mutantp53 •Genová nestabilita • Nekontrolovaná proliferace • Inhibice apoptózy Inaktivace p53 v nádorech • Mutace • Jaderná exkluze (37% zánětlivých karcinomů prsu, více než 90% nediferencovaných neuroblastomů) • Interakce s virovými onkoproteiny (LT SV40, E1B, E6) • Amplifikace mdm2 (neuroblastomy), případně mdmX (gliomy) Frekvence mutací p53 v nádorech Mutations of p53 Missense Silent Nonsense Transactivation Functional Partially Functional (p21>>Bax) Nonfuctional Folding Folded Unfolded Position N-terminal C-terminal Core domain Silent mutace Typy mutací p53 • především bodové missense mutace • krátké delece a inzerce (více v okrajových částech genu) 175 248 273 245 282 Missense Mutations are Clustered in the DNA-binding Domain Transactivation (1-42; 43-62) Oligomerisation (323-356) Regulation (363-393) DNA binding (102-292) Proline-rich (65-97) N- -C 1 % 2.3 % 80 % 3.4 % 0. 3% 50.8 % 45.4 % 82.1 % 36.4 % 72.7 % Mut. frequency Missense mut. http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr Most Frequent Mutations Are In The Loops That Make Contact With DNA 0° 90° 180° Codon: 175 248 273 282 245249 176220> > > > >> > Mutačččční spektra p53 http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr Přřřříklady nádorověěěě specifických mutací CC to TT Various codons Skin cancer: 7% Other cancers: 0% G to T Codon 249 Liver cancer: >50% Other cancers: <2% G to T Codons 157, 158, 248, 273 Lung cancer: 30% Other cancers: <10% Source Mutagen Adduct TP53 pattern UV radiations Aflatoxins Tobacco smoke http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr A Specific Mutation Pattern In Lung Cancer from Smokers Smokers (N=419) Non-tobacco related (N=4516) Non-Smokers (N=153) A:T>C:G A:T>G:C G:C>T:A del/ins/complex A:T>T:A G:C>A:T G:C>A:T at CpG G:C>C:G G to T 30% 12% 9% G to A (CpG) 13% 23% 36% Pfeifer et al.Pfeifer et al. OncogeneOncogene (2002)(2002) http://wwwhttp://www--p53.p53.iarciarc..frfr Biologická aktivita TP53 Mutantůůůů Mutant p53 Loss Of FunctionLoss Of Function Retained FunctionRetained Function Protein interactions Transactivation, Repression, …. Growth promotion Gain Of FunctionGain Of Function WT p53 DNA- Binding, Transactivation, Repression Growth suppression Dominant NegativeDominant Negative Temperature Sensitivity Temperature Sensitivity p53p53 M p73p73p73 p53p53p53 M Neschopnost vazby na své „přirozené“ sekvence p53p53 M p53p53 M p53p53 M p63p63p63p53p53 M Gain of functionZtráta přřřřirozené funkce NO MDM2 Kumulace defektního proteinu p53p53 M p53p53 M HSP90HSP90 Spouštění „cizích“ promotorů 1990 Nature Genetics 4, 42 - 46 (1993) Gain of function mutations in p53 Dirk Dittmer1, Sibani Pati1, Gerard Zambetti1, Shelley Chu1, Angelika K. Teresky1, Mary Moore1, Cathy Finlay1 & Arnold J. Levine1 1Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton, New Jersey 08544−−−−1014, USA První zmínka o pojmu „Gain of Function“ proteinu p53 Definitivní ustálení pojmu „Gain of Function“ pro protein p53 Zástava děěěělení Reparace poškození Apoptóza Nekontrolovaná proliferace Insuficientní apoptóza Konformace Hladina p53 schopnost indukce Interakce s proteiny: transkripčččční aparát stresové proteiny inhibičččční proteiny DNA vazebná kapacita Posttranslačččční modifikace fosforylace acetylace Stav genu mutace, delece, LOH izoformy Možžžžnost predikce ? Terapie založžžžená na stavu p53 ATM ATR Chk1Chk2ARF p53 mutovaný ? NE chemoterapie radioterapie... Terapie založžžžená na aktivaci p53 p53p53 posttranslačččční modifikace TERAPIE ZALOŽŽŽŽENÁ NA STAVU p53 Stabilizace struktury proteinu Inhibice HSPs p53p53p53p53 p53p53 Hsp90Hsp90 p53p53 Geldanamycin 17-alyl-aminogeld. PRIMA Amifostin + postttranslačččční modifikace ANO jaké jsou vlastnosti mutace ? Aktivovatelný Snížžžžení Gain of function, Inhibice HSPs Genoterapie Adenovirus + upravený p53 Neaktivovatelný Screening malých molekul, které aktivují p53 p53 activity LacZp53 Over 130,000 compounds screened Lain S., Hollick JJ. et al. Cancer cell (2008) p53 cílená léččččba p53 Cdk7/9? Roscovitine DRB Camptothecin Nutlin 3 Leptomycin B Cdk7/9? Topoisomerase crm1mdm2 JJ91 Tojj91 2000 Nádor = defekt v regulaci b. proliferace a homeostázy I. Soběěěěstaččččnost přřřři tvorběěěě růůůůstových signálůůůů Normální buňka vyžaduje mitogenní růstové signály x Nádorová buňka vykazuje výrazně redukovanou závislost na exogenních růstových stimulech. Strategie: • Tvorba vlastních růstových faktorů Zesílená exprese Strukturní změny „Přepnutí“ integrinů • Receptory na buněčném povrchu • Alterace v „downstream“ signalizaci Růůůůstové faktory Onkogeny jen zřídka vznikají z genů kódujících růstové faktory. Je to kupř. sis-onkogen, který kóduje syntézu růstového faktoru odvozeného od krevních destiček (PDGF).Ten se může navázat na přirozený PDGF-receptor a navodit maligní transformaci buňky. Příkladem autokrinní stimulace (autostimulace) je sekrece transformujícího růstového faktoru TGFα; jde o analog EGF, který je secernován řadou nádorových buněk a který se váže na EGFreceptor, navozuje tak jeho trvalou stimulaci. Receptory růůůůstových faktorůůůů Receptory po vazbě příslušného specifického faktoru přenášejí růstový signál jednou nebo více kaskádami signální transdukce. Některé povrchové buněčné receptory mají jako integrální součást tyrozinkinázu ve své cytoplasmatické doméně. Geny těchto receptorů se stávají onkogenními, když po mutaci zůstávají receptory aktivní i v nepřítomnosti navázaného ligandu. Jiným příkladem je produkt erbA onkogenu, jehož proto-onkogen kóduje intracelulární receptor pro hormon štítné žlázy. Vazba hormonu transformuje receptor na transkripční faktor. Onkogenem pozměněný receptor (ErbA), který působí jako negativní faktor, kompetuje s endogenním tyreoidálním receptorem, a důsledkem je usnadnění buněčného růstu. Hormonální receptory • Na povrchu buněk (transmembránové) i uvnitř peptidové (G-spřažené receptory) • Dělíme na steroidní (obv. solubilní proteiny) Estrogenní receptory: 2 varianty: - G-spřažený receptor (GPR30) – syntéza PIP3 - nukleární hormonální receptor Genomicky vazba na ERE, iniciace transkripce Negenomicky komplexy s G prot., TK MAPK, PI3K/AKT II. Ztráta citlivosti k signálůůůům zastavujícím buněčěčěčěčný růůůůst a proliferaci • Buňka je „přepnuta“ antiproliferačními signály z proliferace do G0 fáze, ale je stále připravena působením dalších extracelulárních signálů opět proliferovat • V buňce dojde k permanentnímu zablokování schopnosti proliferovat vstupem do tzv. postmitotické fáze, respektive dojde k terminální diferenciaci Nádorová buňka musí obejít tento kontrolní mechanismus: vyřazením pRb dráhy kóduje tzv. retinoblastoma 1 protein (RB1, pRb) – reguluje buněčný cyklus v případě mutace --> retinoblastom (sporadický x dědičný, „two hits“ hypotéza) brání buňkám v replikaci poškozené DNA – G1 blok Výjimky („two hits“) Haploinsuficience – jedna funkční alela není dostatečná Imprinting – 1-2% lidských genů, kdy jen 1 rodičovská alela aktivní. Např. IGF-2, obvykle exprese otcovské alely, při ztrátě imprintingu a overexpresi --> Wilmsův tumor, hepatoblastom, rhabdomyosarkom,... Přibližně 10% populace konstitutivní ztráta IGF-2 imprintingu (hypometylace) = zvýšené riziko ca kolorekta. http://www.geneimprint.com Dominantně negativní mutace – vedou ke vzniku proteinu, který neplní správně svoji funkci a navíc interaguje s proteinem tvořeným funkční alelou a tím ho inaktivuje. Buněčěčěčěčný cyklus a nádory Deregulace b.cyklu u nádorůůůů 1. aberantní exprese pozitivních regulátorů (cykliny) 2. ztráta funkce negat. regulátorů (CDKI) P P P P P vstup do S fáze E7 E2F pRb E7 pRb E2F p16 p16 D1-CDK4/6 nekontrolovaná transkripce genů aktivace p14 E6E6AP ubikvitin p53 p53 protea zom p21 E-CKDK2 G1 fáze SchSchééma funkce proteinma funkce proteinůů E6 a E7 pE6 a E7 přři infekcii infekci proteiny E6 a E7 high risk HPV jsou schopné transformovat zdravou buňku pouze v kooperaci TGFββββ MYC signalizace III. Neomezený replikačččční potenciál Pokusy in vitro na normálních lidských diploidních fibroblastech ukázaly, že buněčná kultura má limitovanou životnost – asi po 50-70 děleních se růst zastavuje, avšak buňky mohou v G1 fázi vydržet až několik roků. Pokud u dané populace dojde k danému počtu dělení, přestávají se množit = senescence Např. inhibicí pRb nebo p53 může dojít k opětovnému dělení buněk krize (masivní buněčná smrt) Nádorové buňňňňky proliferují neomezeněěěě – jsou „nesmrtelné“. • Multifaktoriálně podmíněné děje →dlouhověkost je schopnost jedince udržet homeostázu obrannými a reparačními mechanismy • Rychlost stárnutí je řízena a) genetickou složkou - reparační mechanismy, antioxidační obrana, polymorfismy „genů dlouhověkosti“ (apolipoprotein E2, SNP192 genu kódujícího paraoxonasu) b) složkami vnějšího prostředí→životní styl (tělesná aktivita, regulovaný příjem potravy) • S postupujícím věkem se objevují funkční i morfologické změny skoro ve všech orgánech a tkáních. Tyto změny mají svůj podklad především ve stárnutí buněk. StStáárnutrnutíí organismuorganismu Hlavní mechanismy stárnutí: • Alterace nebo ztráta genů pro regulaci buněčného růstu (c-fos nebo RB-1), či indukce inhibitorů buněčného růstu • Replikativní stárnutí (telomery) • Apoptóza • Neenzymová glykace proteinů (posttr. modifikace AGE products) • Volné radikály (ROS) 1. Peroxidace – poškození NK, denně 10000 alterací DNA bází v jedné buňce, s věkem prudký nárůst; 2. oxidační modifikace proteinů degradace; vlivy prostředí – ion. záření • Změny v indukci Hsp proteinů (Hsp70) StStáárnutrnutíí bunbuněěěěěěěěkk Senescence se vyskytuje jako artefakt přřřři pěěěěstování buněčěčěčěčných kultur, který nereflektuje fenotyp buněěěěk v žžžživých tkáních a nepřřřředstavuje přřřřekážžžžku pro progresi nádoru in vivo ? SenescenceSenescence protirakovinný mechanismus X zhoršování regenerace Charakteristika senescentních buněk: • nevratná zástava buněčného cyklu v G1 fázi • morfologické znaky, změny ve struktuře heterochromatinu • zvýšená exprese p53, p21Cip1, p16INK4A • vysoká aktivita lyzozomální β-galaktosidázy IV.IV. ApoptApoptóózaza Fyziologický proces udržující rovnováhu mezi buněčným růstem a smrtí buněk Kaskáda reakcí cysteinových proteáz (kaspázy), vazba na tzv. substráty smrti (proteiny cytoskeletu, proteiny řídící opravu DNA, proteiny zabraňující apoptóze apod., štěpení DNA cca 180bp). V konečném důsledku morfologické změny - svrašťování buněk, apoptotická tělíska →fagocytóza Postupující věk →pokles transkripční aktivity genů vyvolávajících apoptózu→např. Snížená schopnost likvidovat buňky imunitního systému reagující proti vlastním tkáním →autoimunitní onemocnění apoptosis AutofAutofáágiegie cytoprotektivní mechanismus (rezistence k terapii) X odstranění poškozených organel, redukce chrom. nestability V. Angiogeneze (neokapilarizace, neovaskularizace) • Proces novotvorby krevních kapilár, díky této schopnosti může nádor stimulovat okolní tkáň k růstu cév, kterými mu je dopravována krev bohatá na živiny a kyslík • Rostoucí nádorové ložisko může bez cévního zásobení dosáhnout velikosti pouze 1 – 2 mm3, kdy přívod kyslíku a živin je možný ještě difuzí z okolní tkáně • Hypoxie, genetická nestabilita --> „angiogenní switch“ tj. nový fenotyp nádorových buněk, suprese antiangiogenních faktorů (thrombospondinu), zvýšená tvorba angiogenních faktorů. Buňky nádoru a sousední endotélie se v tomto směru vzájemně ovlivňují parakrinní, ale i autokrinní sekrecí angiogenetických faktorů. Čím je angiogeneze intenzivnější, tím je prognóza nádorového onemocnění nepříznivější; zvyšuje se riziko metastáz. Praktické důsledky: stupeň angiogeneze může sloužit jako prognostický faktor. Nejintenzivnější angiogeneze bývá na okraji nádorového ložiska, kde lze její intenzitu posoudit histologicky. Používá se také zviditelnění tzv. horkých ložisek (hot spots) pomocí monoklonálních protilátek proti cévním endoteliím nebo proti adhezním molekulám (CD31, CD34), event. proti tzv. von Willebrandovu faktoru. Citlivým ukazatelem hustoty kapilárního řečiště je stanovení akvaporinu-1 (AqP-1); jde o faktor působící synergicky s VEGF a významně zvyšující cévní propustnost. Angiogeneze (pokraččččování) Terapie založžžžená na potlaččččení angiogeneze: cíl: zpomalit ažžžž zastavit růůůůst nádoru • přirození antagonisté angiogeneze, popř inhibitory stimulátorů: např. rekombinantní thrombospondin (thrombospondin mimetic peptid – TPS-1) blokuje odpověď na angiogenní podněty, inhibuje aktivitu endotélií a podporuje jejich apoptózu. • Neutralizace účinku angiogenních faktorů: zablokování EGF nebo VEGF vytvořením komplexu s mAb (bevacizumab). • Blokáda receptorů angiogenních faktorů: solubilní receptory, které vytvoří na membránových receptorech inaktivní heterodimery, neschopné iniciovat signální transdukci, inhibice receptorových kináz • Genová terapie: antisense mRNA (VEGF), angiozym (specif. ribozym) • Inhibice proliferace endotelu: fumagilin (A. fumigatus, toxický), syntetická varianta AGM-1470 (o-chloracetyl-karbamoyl-fumagilol) netoxický, potlačuje proliferaci endotelií inhibicí translokace membránových bioproteinů a transkripčního faktoru Ets-1. • Stabilizace bazální membrány a extracelulární matrix: neporušená bazální membrána znesnadňuje invazi endotelií. Inhibice metalo-proteinas, které bazální membránu a extracelulární matrix rozrušují (extrakt ze žraločích chrupavek – neovastat) Drozofila jako model angiogeneze Mutace různých drozofilích genů účastnících se vývoje trachejí a jejich savčí protějšky: · trachealess (homolog HIF), · branchless (FGF), · breathless (FGF receptor), · sprouty (ras interactor) Cévní system drozofily je málo vyvinut, ale dobrým modelem pro savčí angiogenezi je na molekulární úrovni překvapivě podobný hmyzí tracheální systém. Podobně jako u savčích cév - obecná organizace trachejí drozofily je určena geneticky, ale jejich větvení je určováno tlakem O2. • Ztráta závislosti adherovat k podkladu (normální buňky v b. kultuře mohou metabolizovat (žít), ale nikoliv se dělit; nádorové buňky ano) • Ztráta inhibice motility kontaktem se sousedními buňkami (buňky mohou růst jedna přes druhou) • Změny na buněčné membráně (modifikace glykolipidů a glykoproteinů --> změny v morfologii nádorové b.) Maligní buňky: zvýšená motilita a invazivita, po průniku do krevní cirkulace schopnost tvořit metastázy. S tím spojena schopnost produkovat receptory, aby se mohly zachytit na proteinech bazální membrány (tvorba adhezních molekul), dále tvorba hydrolytických enzymů, které pomohou rozrušit kolageny, proteoglykany a glykosaminoglykany bazální laminy a umožnit tak pronikání do okolí, natrávit stěnu cév, zachytit se v cirkulaci na shlucích trombocytů a vytvořit tak nádorové emboly, odolávat účinkům protinádorového imunitního systému, zachytit se na stěně cév vzdáleného místa, proniknout do intersticia tkáně, založit metastázu, proliferovat, podporovat angiogenezi a případně vytvářet nové metastázy. VI. Invazivita a schopnost metastázovat Metastáze • Nejčastější příčina úmrtí • Schopnost metastázovat je jedním ze základních znaků malignity nádorových onemocnění, řada faktorů (druh nádoru, velikost primárního nádoru, angiogenní procesy) • Při vzniku metastáz hrají důležitou úlohu chemokiny. Jde o superrodinu prozánětlivých cytokinů, které selektivně přitahují a aktivují různé typy buněk tím, že se váží na specifické povrchové receptory (G-protein) Šíření metastáz: • lymfogenní - národové buňky se šíří cestou lymfatických cév do lymfatických uzlin. Nejběžnější způsob šíření epiteliálních nádorů. • hematogenní - nádorové buňky se šíří krví a zachycují se v kapilárách. Nádory vycházející z pojivových tkání a pokročilé nádory epitelové. • porogenní (per continuitatem) - nádorové buňky se šíří mechanicky preformovanými dutinami. (nádory mozku nebo vaječníků) Gastrulace u mnohobuněčěčěčěčných 3 hlavní signální dráhy: · Wnt/β-katenin · FGF · TGF-β/BMP TF: Snail, Slug, Twist, Zeb1/2 VII. Protinádorová imunitní odpověďěďěďěď Důkaz: imunokompromitovaní pacienti - 200krát vyšší riziko vzniku nádorového onemocnění Onkoproteiny APC-aktivace zvýšení produkce kostimulaččččních molekul aktivace a proliferace tumor-reaktivních buněěěěk CD4+ a CD8+ produkce IL-12 podpora odpověěěědi Th1-buněěěěk produkce IL-2 IFNγγγγ Protinádorová imunitní odpověďěďěďěď Protinádorová imunitní odpověďěďěďěď •Velký význam cytolytické T-lymfocyty typu CD8+ a T-lymfocyty typu CD4+: Aktivované T-buňky CD4+ exprimují CD40 ligand (gp39), který aktivuje CD40-receptor na antigen-prezentujících buňkách (dendritické buňky). Secernace prozánětlivých cytokinů, zejména IL-12, čímž dochází k aktivaci T-lymfocytů typu CD8+ a navození produkce IFNγ IL-2, což má za následek atrahování dalších imunokompetentních buněk. • Kromě cytolytických T-lymfocytů, které vyžadují aktivaci (IL-2) a prezentaci cílového antigenu za přítomnosti HLA I. třídy, jsou ještě NKbuňky, nevyžadující prezentaci antigenu. Některé NK-buňky participují na buněčné cytotoxicitě vyvolané specifickou protilátkou (antibodydependent cellular cytotoxicity = ADCC). Také aktivované makrofágy (pomocí INFγ) se mohou podílet na protinádorové cytotoxicitě (účinkem reaktivních forem kyslíku). Humorální protilátky působí dvěma mechanismy: (a) aktivací komplementu a (b) aktivací NK-buněk ADDC- mechanismem. Teorie protinádorového imunologického dohledu („cancer immunoediting“) VIII. Záněěěět a nádorová onemocněěěění Extracelulární matrix (ECM) • Pletivo makromolekul vně buněk (bílkoviny, glykoproteiny, proteoglykany a polysacharidy) • Poskytuje mechanickou podporu pro buňky • Ovlivňuje chování, proliferaci a diferenciaci buněk, které jsou s ní v kontaktu • Hlavními receptory buněk, které zprostředkovávají interakci buněk s ECM jsou integriny Integriny • Nepostradatelné komponenty všech Metazoí (od mořských hub po člověka) • Členy velké rodiny transmembránových proteinů, které jsou receptory pro adhesivní sekvence molekul extracelulární matrix • Zprostředkují přichycení buňky k ECM nebo k jiné buňce a umožňují přenos signálu (informace) mezi ECM a buňkou. Signalizace probíhá jak z ECM do buňky (outside-in signaling), tak z buňky do extracelulárního prostoru (inside-out signaling) • Heterodimerní molekula v které jsou α a β podjednotky spolu nekovalentně vázány IX. Změny v metabolické aktivitě Nekontrolovaná buněčná proliferace je nejen spojená s deregulací kontroly buněčného cyklu, ale má též zvýšené nároky na metabolickou aktivitu ~ 18x vyšší účinnost Aerobní glykolýza (O. Warburg) • GLUT1 (PET) • Hypoxie • Glykolytické intermediáty 2 subpopulace buněk ROS vs. antioxidanty X. Genomová nestabilita Funkčnost genetických repearčních mechanismů výskyt spontánních mutací je poměrně nízký při kancerogenezi musí dojít k vyřazení systému monitorujícího genomovou stabilitu = ‘‘caretakers’’ of the genome (Kinzler and Vogelstein, 1997) Nejčastěji s e jedná o faktory zodpovědné za: (1) detekci DNA poškození a aktivaci reparační mašinerie (2) přímo se podílející na opravě poškozené DNA (3) inaktivující mutagenní molekuly dříve než poškodí DNA Ztráta telomerické DNA u řady nádorů vede ke karyotypické nestabilitě a s tím spojeným amplifikacím a delecím na chromozomech