C7188 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Moderní metodické přístupy v molekulární medicíně I BIOLOGICKÝ MATERIÁL, GENOMIKA I Ondřej Slabý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav Lékařská fakulta Masarykovy univerzity CEITEC © Ondřej Slabý, 2011 logo_MOU GS011558 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 2 © Ondřej Slabý, 2009 Interdisciplinární charakter biomedicínského výzkumu – příklad onkologického výzkumu Radiolog Klinický onkolog Chirurg Patolog Molekulární biolog Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 3 © Ondřej Slabý, 2009 Biologický materiál užívaný pro účely molekulární medicíny Tkáň (nativní vs. fixovaná – př. FFPE- formalin fixed paraffin-embedded tissue; chirurgický resekát, biopsie) Plná krev (plazma + buňky) Plazma (tekutina po odstranění krevních elementů, obsahuje faktory hemokoagulace) Sérum (tekutina nad sraženinou, bez faktorů krevního srážení) Moč Kostní dřeň, bronchiální aspirát, ejakulát, bronchoalveolární laváž, kloubní tekutiny, mozkomišní mok, sputum, stolice, výtěry… Banky biologického materiálu archivace vzorků v parách kapalného dusíku při teplotě -160°C K archivovanému vzorku nativní tkáně uložen fixovaný parablok=morfologický korelát Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 4 © Ondřej Slabý, 2009 Odběr klinického materiálu Klíčový moment rozhodující a kvalitě celého výzkumu!!!!!! Všechny odběry musí probíhat stejně, a celý proces musí být přísně kontrolován! Zaznamenání času podvázání cév Tzv. ischemické zdržení Vysoké nároky na stabilizaci především při práci s RNA Nejčastěji použiváne stabilizační činidlo RNAlater Doba transportu na patologii Fixace vzorku Kontrolovaná archivace vzorku DNA 4oC RNA -70oC Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 5 © Ondřej Slabý, 2009 5 LCM Laserová mikrodisekce – nástroj k získání vybraných buněčných populací laser capture microdissection (LCM) © Ondřej Slabý, 2009 Strana 6 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Izolace nukleových kyselin DNA pic 1 Homogenizace tkáně (ultrazvuk, mechanicka, rotor-stator) Lyze buněk (enzymaticky-proteináza K, chemicky-SDS, EDTA, fyzikálně-zahřívání…) RNA méně stabilní než DNA! (homogenizace beta-ME, DTT) Extrakce směsí fenol-chloroform Srážení nukleových kyselin alkoholem Přečištění enzymy Purifikace nukleových kyselin chromatografií (adsorpce na silikát) Úvod do molekulární medicíny 3/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 7 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 24 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 3/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 8 Spektrofotometrická kvantifikace a čistota nukleových kyselin Roztok dvouřetězcové DNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 50ug/ul Roztok jednořetězcové DNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 30ug/ul Roztok jednořetězcové RNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 40ug/ul Proteiny mají díky aromatickým aminokyselinám absorpční maximum při 280 nm Poměr A260/A280 se má u nekontaminované DNA pohybovat v rozmezí 1,8 až 2,0 Poměr A260/A230<1,7 indikuje kontaminaci chaotropními solemi a fenolem Nanodrop ND1000 – umožňuje kvantifikaci pouze v 1ul vzorku Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 16 © Ondřej Slabý, 2009 Křivky z Nanodropu Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 9 © Ondřej Slabý, 2009 Integrita nukleových kyselin Agilent Bioanalyzer 2100 Lab on a chip (LOC) technology Je miniaturiziované zařízení implentující kapilární gelovou elektroforézu pro účely analýzy NK 18S rRNA 28S rRNA Poměr 28S/18S ~ 2,0 pro nefragmentovanou RNA 80% rRNA 10-20% tRNA 1-5% mRNA Úvod do molekulární medicíny 3/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 10 Integrita nukleových kyselin Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 11 © Ondřej Slabý, 2009 Integrita nukleových kyselin RIN = RNA Integrity Number (0 – 10) The RIN value: Schroeder et al, 2006 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 12 © Ondřej Slabý, 2009 Integrita nukleových kyselin Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 13 © Ondřej Slabý, 2009 Izolace RNA a vliv její integrity na analýzu expresních profilů Vzorek č. 395-2001-1a RIN = 8,4 Vzorek č. 03/271 RIN = 2,8 c = 0,4412 ug/ul A260/A280 = 1,93 A260/A230 = 1,79 c = 0,2412 ug/ul A260/A280 = 2,03 A260/A230 = 1,82 RIN = RNA Integrity Number (0 – 10) Jako minimální RIN vzorku byla stanovena hodnota 7. Strana 14 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) přímo během reakce (tzv. „v reálném čase") pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Její výhodou oproti konvenční PCR je možnost přesného stanovení výchozícho počtu kopií cílové templátové sekvence DNA, čili schopnost kvantifikace. Real-time PCR se provádí s pomocí přístrojů zvaných cyclery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR. Real-Time PCR – nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 15 © Ondřej Slabý, 2009 Real-Time PCR – nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese Nejčastější způsoby detekce amplifikačního produktu Specifické TaqMan sondy Interkalační barvivo SYBR green Denaturační křivka kontrola specifity reakce Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 17 © Ondřej Slabý, 2009 Real-Time PCR – nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese 1)Baseline - fluorescenční signál je pod detekovatelným limitem detektoru 2)fluorescence exponenciálně narůstá společně s produktem amplifikace. Ovšem společně s pokračující amplifikací se snižuje i poměr polymeráza : PCR produkty. 3) plateau fáze - koncentrace vytvořených amplikonů dosáhne koncentrace 10-8 M, zastaví se exponenciální růst, od koncentrace 10-7 M už Rn dále nenarůstá. Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 18 © Ondřej Slabý, 2009 Real-Time PCR – nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese graf1%20kopie Treshold (prahový) cyklus CT – cyklus, při kterém Rn signály začnou odpovídat exponenciálnímu růstu množství amplifikačního produktu Pro určení CT vyhodnocovací software vypočítá průměrnou odchylku Rn v několika prvních cyklech a na základě této odchylky rozpozná následnou změnu vedoucí od baseline (kterou obvykle představuje asi prvních 15 cyklů) k exponenciálnímu průběhu (treshold změna Rn je definovaná jako desetinásobek průměrné odchylky v baseline fázi PCR) CT je závislé na koncentraci DNA templátu, účinnosti amplifikace a funkčnosti fluoroforového systému. graf2%20kopie Absolutní kvantifikace Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 22 © Ondřej Slabý, 2009 Vztah integrity RNA a Ct prahového cyklu při měření stejného transkriptu v analogickém vzorku Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 Real-Time PCR – nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese Normalizace pomocí endogenní kontroly – relativní kvantifikace metoda Δ Δ Ct Reference – obvykle nějaké housekeepingové geny jsou aktivní ve všech buňkách zajišťují základní funkce buněčného metabolismu: syntéza nukleových kyselin a proteosyntéza,transport živin a jejich zpracování, biosyntéza cytoskeletu a organel (GAPDH, HPRT1, ACTB, B2M,….) ΔCt1 = Ct (gen) – ΔCt (reference) – v kalibračním vzorku (např. nenádorový střevná epitel) ΔCt2 = Ct (gen) – ΔCt (reference) – v analyzováném vzorku (např. kolorektální karcinom) Δ ΔCt = ΔCt2 – ΔCt1 2-ΔΔCt = [gen ve vzorku] / [gen v kalibrátoru] (př. 3 znamená, že normalizovana hladina stanovovaného genu je 3x vyšší v kolorektálním karcinomu než v nenádorovém epitelu) 2-ΔCt1 = [gene]/[reference] Rozdíly v množství celkové RNA ve vzorcích a asi 20% chyba reverzní transkripce Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Real-Time PCR arrays obvykle cílené na geny konkrétní signální dráhy nebo biologického procesu www.appliedbiosystems.com www.sabiosciences.com Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 High resolution melting (HRM) – analýza tání s vysokým rozlišením C:\Documents and Settings\Jason McKinney\Desktop\heteroduplex melt curve.bmp O6-metylguanin-DNA metyltransferáza (MGMT) v predikci odpovědi na léčbu temozolomidem (TMZ) gen MGMT exprese Promotorová oblast exprimován GBM s metylovaným promotorem MGMT •Není reparační protein DNA - MGMT •Nejsou opravována poškození DNA indukovaná účinkem temozolomidu •Lepší odpověď na léčbu •Lepší přežití pacientů s glioblastomem Metylovaný bez « turned off » Nemetylovaný Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 3/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 20 Prediktivní význam metylace MGMT u pacientů s multiformním glioblastomem – odpověď na nové alkylační agens temozolomid Stav metylace promotoru genu pro reparační protein MGMT stanovený metodou HRM Nemetylovaný promotor, Vyšší hladiny MGMT, Vyšší DNA reparační kapacita (- prognostický faktor) Metylovaný promotor, Nižší hladiny MGMT (+ prognostický faktor) Slaby et al., Cancer Science, 2011 Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 23 © Ondřej Slabý, 2009 DNA microarrays (čipy) – definice a ukázky Miniaturizované zařízení nesoucí na svém povrchu imobilizované fragmenty nukleových kyselin v přesně určeném uspořádání. Tyto fragmenty jsou sekvenčně derivované tak, aby mohly specificky hybridizovat s testovaným genetickým materiálem, který je předem speciálně označen za účelem posthybridizační detekce Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 25 © Ondřej Slabý, 2009 * * * * * 5µm Milióny kopií jedné sondy Přes 6 500 000 hybridizačních jednotek Testovaná NK Sonda = fragment NK 1.28cm GeneChip U133A - DNA čip Hybridizační jednotka U133 set (A+B) -33 000 lidských genů -1 000 000 hybridi- začních jednotek DNA čip (Affymetrix GeneChip U133A) Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Experiment s DNA čipem Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 21 © Ondřej Slabý, 2009 Základní dělení DNA čipů Dle charakteru detekce 1)pasivní – pracovní podmínky pro všechny hybridizační jednotky jsou stejné – Affymetrix, Agilent 1)aktivní – pracovní podmínky každé hybridizační jednotky lze ovlivňovat individuálně – Nanogen Dle typu sond 1)cDNA čipy – historicky Agilent 2)oligonukleotidové čipy – Affymetrix (25mers), Agilent (60mers) Dle počtu sond 1)vyskohustotní DNA čipy (celogenomové) – Affymetrix, Agilent, … 2)nízkohustotní DNA čipy (stovky genů) – Eppendorf, Superarray, … 3) Úvod do molekulární medicíny 3/12 Strana 26 © Ondřej Slabý, 2009 Výroba in house cDNA ČIPŮ dvouvláknové fragmenty komplementární (complementary) cDNA o délce 300-400 párů bazí cDNA EXPRESNÍ KNIHOVNA mRNA -> reverzní transkripce -> cDNA -> fragmentace -> + univerzální vektor -> inkorporace do plasmidů -> transfekce bakterií -> uskladnění bakteriálních klonů v jamkových destičkách -> ->(1 bakteriální klon obsahuje plasmid s jedním cDNA fragmentem) Strana 27 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 2/12 Čipovač Microarrayer Spotter Svoboda-obr1-cz http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html Výroba DNA ČIPŮ spotováním Stealth_2000 Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 28 © Ondřej Slabý, 2009 I) Kontaktní systémy a) bez zásobníku - plné hroty (solid pins) b) se zásobníkem (250-1000nl) - přepraví 0,25 – 5nl, což vytvoří hybridizační jednotku 75-350um v průměru - štěrbinovité hroty (split pins) - pinzetovité hroty (tweezers) II) Bezkontaktní systémy a) „ink-jet“ (kapacita až 10000nl) - piezoelektrický (4-100nl) - elektromagnetický (0,05-10nl) b) „bubble-jet“ Nanášecí tělesa Výroba ČIPŮ spotováním 1.28 x 1.28+ cm plocha čipu HJ ~100 mm průměr separovány ~100 mm. (» 5,000 – 20,000 probes) Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 I) Kovalentní - čip pokryt např. modifikovanými silany mající aldehydovou skupinu. 5´-konce sond jsou modifikovány a nesou aminovou skupinu – kontaktem vznikne pevná Schiffova báze II) Nekovalentní - čip pokryt např. poly-L-lysinem, ke kterému se molekula cDNA váže elektrostatickými interakcemi a vodíkovými můstky Povrchová úprava nosné plochy – hydrofóbních skel \\Ludwig-sun2\vpraz\chips\fast-slide-photo.jpg Po nanesení sond – fixace: např. UV záření blokace: volných míst montáž: cartrige Výroba DNA ČIPŮ SPOTOVÁNÍM Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 30 © Ondřej Slabý, 2009 Výroba cDNA ČIPŮ Svoboda-obr2 Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 31 © Ondřej Slabý, 2009 U cDNA čipů hybridizujeme na jednom čipu značenou ss-cDNA získanou z testovaného a referenčního vzorku. Proto je nutno každou ss-cDNA označit rozdílným fluorochro- mem. Standardně: referenční ss-cDNA je Cy-3 – zeleně a testovaná ss-cDNA Cy5 – červeně Po hybridizaci následuje vymití přebytečného materiálu a čtení (skenování) čipu pomocí fluorescenčního skeneru Dvoubarevný čipový experiment (cDNA,Agilent) Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 32 © Ondřej Slabý, 2009 Oligonukleotidové DNA čipy – Affymetrix – výroba syntézou in situ -oligonukleotidové čipy, jednovláknové fragmenty NK o délce ≈25 bazí FOTOLITOGRAFICKÁ SYNTÉZA 1.28 x 1.28+ cm plocha čipu HJ ~5 x 5 mm průměr plocha (» miliony sond na 6,500,000 HJ) Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 33 © Ondřej Slabý, 2009 PŘÍPRAVA OLIGONUKLEOTIDOVÝCH SOND mRNA sekvence daného genu -> virtuálně vyselektováno 11-20 specifických oligonukleotidových úseků reprezentujících daný gen-> reverzní transkripce do sekvence cDNA -> fotolitografická syntéza přímo na povrchu čipu Affymetrix GeneChip Referenční a partnerské sondy v referenčních a partnerských hybridizačních jednotkách. Liší se cílenou záměnou jednoho nukleotidu v centrální oblasti (negativní kontrola). Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 34 © Ondřej Slabý, 2009 IVT, značení cRNA biotinem a posthybridizační detekce Izolace RNA / mRNA -> reverzní transkripce -> ss-cDNA -> PCR syntéza ds-DNA s T7 promotory -> lineární amplifikace a zároveň in-vitro reverzní transkripce s inkorporací NTPs (pseudouridin nesoucí biotin --nepřímá metoda) -> biotinem značená cRNA -> hybridizace hybridization_of_tagged_probes fragmentace Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Faktory ovlivňující čipové analýzy heterogenita souboru pacientů, kvalita vstupního materiálu, rozdílnost čipových platforem, validace výsledků Biologická variabilita = charakteristika individua nebo systému (genetický základ a jeho variace, vývojové stádium, fyziologický stav, teplota, kultivační podmínky, sledované experimentální podmínky, atd.) Biologickou variabilitu odlišit od technologické variability (zpracování a nanášení vzorku, čipy a jejich výroba, značení cDNA, hybridizace, RNA a cDNA amplifikace, skenování a skener) odlišit -pozadí od biologicky důležitých genů včetně těch exprimovaných na nízké úrovni -odlišit nespecifické změny (stresové reakce), atd. -kontaminace jinými buněčnými populacemi Moderní metodické přístupy v molekulární medicíně II – faktory ovlivňující čipové analýzy, základní statistické přístupy k analýze čipových dat, další čipové technologir SNP čipy, CGH čipy, mikroRNA čipy, ChiP–on-chip, využití genomiky pro molekulární klasifikaci nádorových onemocnění, jak navrhovat studie a jak číst publikace – výhody a limitace genomických metod Náplň příští přednášky Take home Interdisciplinární charakter biomedicínského výzkumu Biologický materiál užívaný pro účely molekulární medicíny Odběr klinického materiálu (stabilita, archivace) Laserová mikrodisekce Izolace nukleových kyselin Kvantifikace a stanovení kvality nukleových kyselin Real-Time PCR (definice, způsoby detekce, absolutní a relativní kvantifikace) Real-Time PCR arrays DNA čipy (definice a základní členění) cDNA čipy oligonukleotidové čipy Faktory ovlivňující čipové analýzy 1) 1) Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 2/12 Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy?