Nové trendy ve výzkumu mikroRNA Ondřej Slabý Masaryk Memorial Cancer Institute CEITEC, Masaryk University Molecular Oncology II – Solid Cancer Laboratory logo_MOU kódující geny představují méně než 2% celkové sekvence genomu vs. minimálně 90% lidského genomu je aktivně transkribováno čím více je organizmus komplexní, tím více obsahuje nekódujících RNA Svět nekódujících RNA Recent evidence suggests that the non-coding RNAs (ncRNAs) may play major biological roles in cellular development, physiology and pathologies. NcRNAs could be grouped into two major classes based on the transcript size: small ncRNAs and long ncRNAs. Sana et al, J Transl Med, 2012 Nové třídy nekódujících RNA HISTORIE 1993 Ambros, Ruvkun – objev miRNA lin-4 1998 Fire, Mello – popis RNA interference 1999 Tuschl, Zamore, Bartel, Sharp -RNAi 21-23 fragmenty 2000-2001 Hannon -Ago2, Dicer 2002 Zamore RNAi a miRNA sdílejí svoji efektorovou dráhu 2002 Croce, Calin miR-15,miR-16 u CLL 2004 Croce 50% miRNA genů na fragilních častech chromozomů 2006 Croce Deregulace miRNA v nádorové tkáni … 2007 První originální práce na téma miRNA v onkologii v ČR J Cell, 1993 Nature, 1998 PNAS, 2004 Současnost ambros.JPG Victor Ambros 2012, CSHL © O. Slabý NEW! Definice mikroRNA MikroRNA je definována jako krátká, 21–23 nukleotidů dlouhá jednořetězcová RNA, která vzniká z dlouhého primárního transkriptu (pri-miRNA) a vlásenkové prekurzorové struktury (pre-miRNA) účinkem ribonukleáz v jádře a cytoplazmě a jejíž hlavní funkcí je post-transkripční regulace genové exprese. Kritéria: 1)krátká RNA musí být jednoznačně detekovatelná pomocí Northern blotu, RT-PCR nebo jiné standardní metody umožňující detekci RNA, 2)krátká RNA se musí vyskytovat v kmenové části vlásenkové, asi 70 nukleotidů dlouhé prekurzorové struktury, 3)sekvence krátké RNA a jejího prekurzoru musí být fylogeneticky konzervovaná (s výjimkou druhově specifických miRNA), 4)inhibice klíčových ribonukleáz v biogenezi miRNA musí vést k poklesu hladin krátké RNA a k akumulaci její prekurzorové struktury. Úvod do molekulární medicíny 4/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 Základní fakta o mikroRNA •miRNA were firstly discribed by Ambros et al. (1993) in C. elegans (lin-4) •Approx. 3% predicted human genes are miRNA genes •1390 annotated human microRNAs*(1000 -2000 predicted) •miRNAs have potential to regulate up to one half of genes in human genome •Phylogenetically well conserved •Several miRNAs are encoded by more than one gene •miRNA genes frequently form clusters and families (eg. cluster miR-17) •miRNA genes are mainly localized in intergenic regions and in introns *Sanger miRBase release 17.0, 2011 Struktura a distribuce genů pro mikroRNA v lidském genomu •Geny pro miRNA jsou rozmístěny na všech lidských chromozomech s výjimkou chromozomu Y. •Přibližně 50 % miRNA se nachází v podobě klastrů (u člověka 55 klastrů), které jsou přepisovány jako polycistronní primární transkripty. Dle vztahu ke známým a definovaným transkripčním jednotkám dělíme na •Mezigenové miRNA (přibližně 50 %) •Intronové miRNA (přibližně 40 %) •miRtrony •Exonové miRNA Kanonický model biogeneze a funkce mikroRNA DESTABILIZACE mRNA!!! Pokles hladiny proteinových produktů cílových genů je ve více než 80% způsoben poklesem hladin mRNA v důsledku jejích destabilizace a nikoliv translační represí. (využití RPF) Guo, Bartel, Nature, 2010 DESTABILIZACE REPRESE REPRESE deadenylace NEW! Biologický poločas a rozpad mikroRNA Kai S, Nature Struct. Mol. Biol. 2010 MiRNA obecně představují vysoce stabilní molekuly, poločas miRNA v buněčných liniích nebo orgánech dosahuje mnoho hodin nebo dokonce i dnů! MiRNA mohou být regulované například blokováním jejich vazebných míst na mRNA pomocí RNA-vazebných proteinů. Volné miRNA jsou méně stabilní Koncept kompetujících endogenních RNA - ceRNAs Opačné vnímání regulačního mechanizmu miRNA → mRNA, kdy tzv. „competing endogenous RNA“ (ceRNA) regulují hladinu daného transkriptu tak, že soutěží o vazbu miRNA, která má schopnost daný transkript post-transkripčně regulovat. Všechny transkripty, které mají vazebná místa pro jednu miRNA, a tak možnost soutěžit její vazbu a vzájemně ko-regulovat svou expresi, potom vytvářejí komplexní síť (ceRNA network). Salmena, Pandolfi, Cell, 2011 Alemeida, Calin, Expert Opin. Biol. Ther., 2012 NEW! IzomiRs Neilsen, Trends in Genetics, 2012 •Poprvé popsány v roce 2008 na základě výsledků sekvenačních studií (Morin et al., 2008, Genome Res) •Jedna oblast kódující miRNA může vést ke vzniku mnoha rozdílných izomiRs. •Zastoupení jednotlivých izomiRs je tkáňově specifické a může se měnit v rámci odpovědi na různé biologické signály. •Vznik 5’ a 3’ izomiRs je podmíněn štěpením Droshou a Dicerem nebo účinkem transferáz. •Polymorfní izomiRs mohou vznikat v důsledku SNP (vzácné) nebo editací mikroRNA (A-I). Funkční dopady: specificita pro cílové mRNA, Ago loading, biologický poločas NEW! MikroRNA jako onkogeny nebo nádorové supresory Lujambio, Nature 2012 Kong et al, Lancet Oncology 2012 Kasinsky, Slack, Nature Reviews Cancer, 2012 MikroRNA jako onkogeny nebo TS v závislosti na kontextu MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění MikroRNA jsou zapojeny do regulace všech šesti klasických a čtyř nových znaků maligního nádoru dle Weinberga a Hanahana. (Hallmarks of Cancer: The Next Generation, Cell, 2011) Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění NEW! Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA jsou zapojeny do regulace klíčových signálních drah regulujících kmenové vlastnosti nádorových buněk. MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění NEW! Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA se podílejí na regulaci klíčových procesů autofagie, jako jsou signalizace mTOR, skládání komplexu ULK1, interaktom proteinu Beclin-1 nebo ATG4 signalizace. MikroRNA jako biomarkery Slaby et al., Mol Cancer, 2009 SNP a mikroRNA, rizikové faktory 1.SNPs v biogenetické dráze miRNA 2.SNPs v sekvenci pri, pre a maturované miRNA 3.SNPs ve vazebných oblastech pro miRNA G/A ITGB4 (miR-34a) Brendle et al, Carcinogenesis 2009 Slaby et al., J Cell Mol Med, 2011 SNP a mikroRNA SNP ve vazebných místech pro miRNA regulované chemoprotektanty NEW! Slaby et al., Nutrition and Cancer, 2012 Weber et al., Clin Chem, 2010 Cirkulující mikroRNA jsou přítomny ve dvanácti typech tělních tekutin RedovaSlaby2012-Figure1.jpg Původ cirkulujících mikroRNA Redova, Slaby, 2012 Gilad et al., 2008 Stabilita cirkulujících mikroRNA Příčina stability cirkulujících mikroRNA Mlcochova et al., 2012 Sérové mikroRNA jako diagnostické biomarkery u CRC Screen shot 2010-02-10 at 9.48.16 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 9.49.22 AM.png Ng et al, GUT, 2009 89% senzitivita 70% specificita ALE….. miR-17-3p (P = 0,65) miR-29a (P = 0,27) miR-92a (P = 0,90) • miR-17-3p, miR-29a, miR-92a, miR-135b • endogenní kontrola: miR-16 • 100 pacientů, 30 zdravých dárců ČESKÁ REPUBLIKA Sérové mikroRNA jako diagnostické biomarkery u CRC Faltejskova et al, unpublished data, 2012 MicroRNAs in serum: dignostic biomarkers of renal cell carcinoma Figure 1. Serum of healthy controls and RCC patients clustered according to diferentially expressed miRNAs (yellow color indicate serum samples of RCC patients, blue healthy controls, LIMMA method, p<0.0001). Redova et al., J Transl Med 2012 MicroRNAs in serum: diagnostic biomarkers of renal cell carcinoma miR-451 miR-378 AUC=0.772 AUC=0.71 AUC=0.857 miR-451 & miR-378 ROC Sensitivity=81% Specificity=83% Redova et al., J Transl Med 2012 N=90 N=35 N=90 N=35 Močové mikroRNA jako diagnostické biomarkery uroteliálního karcinomu Yamada et al. Cancer Science, 2010 MikroRNA jako diagnostické biomarkery NSCLC ve sputu SPINOCELULÁRNÍ KARCINOM Xing et al, Mod Pat, 2010 ADENOKARCINOM Yu et al, IJC, 2010 MikroRNA jako tkáňové biomarkery MikroRNA jako tkáňové biomarkery Rozdílné expresní profily mikroRNA mezi nádorovou a nenádorovou tkání Volinia et al., PNAS, 2006 HCL analýza 540 vzorků nádorových a paralelních nenádorových tkání šesti typů solidních nádorů. > Žlutá znamená zvýšenou a modrá sníženou expresi v tumoru The second study comes from the same group and use completely different approach to prove association of miRNAs with cancer. They have analyzed global miRNA proffiles. MikroRNA jako tkáňové biomarkery spojené se známými histologickými a molekulárními podtypy nádorových onemocnění mikroRNA nepodléhají degradačním procesům během formalínové fixace a archivace v parafinových blocích jako je tomu u mRNA èARCHIVY FFPE MATERIÁLU NA PATOLOGIÍCH JE TAK MOŽNÉ VYUŽÍVAT PRO ROZSÁHLE RETROSPEKTIVNÍ STUDIE > > > versus mikroRNA z FFPE mRNA z FFPE Yaguang Xi, RNA, 2007, 13:1–7 > MikroRNA jako tkáňové biomarkery Guan et al, JECCR 2012, 31:54 Meta-analýza mikroRNA up-regulovaných v tkání NSCLC NEW-META-ANALÝZY Guan et al, JECCR 2012, 31:54 Meta-analýza mikroRNA down-regulovaných v tkání NSCLC Landi et al, Clin Cancer Res, 2010 MikroRNA asociované s různými histologickými podtypy NSCLC Lebanony et al, JCO, 2009 MikroRNA asociované s různými histologickými podtypy NSCLC miR-205 SENZITIVITA 96% SPECIFICITA 90% Dacic et al, Modern Pathlogy, 2010 MikroRNA asociované s mutačním stavem KRAS/EGFR u pacientů s NSCLC miR-21: new diagnostic biomarker of colorectal cancer Screen shot 2010-02-10 at 9.59.26 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 10.00.11 AM.png Slaby et al, Oncology, 2007 J Schetter et al, JAMA, 2008 And for the first time prove that miR-21 is positively correlated with clinical stage of CRC miR-21: prognostic and predictive marker of colorectal cancer Screen shot 2010-02-10 at 9.58.08 AM.png Schetter et al, JAMA, 2008 Faltejskova et al, IJCD, 2012 Analysis of miR-21 inhibition of colon cancer cells DLD1 Faltejskova et al., Int J Colorectal Dis 2011 Scratch wound healing assay – inhibition of DLD1 cells migration Figure 10 Relative cell motility (two-tailed t-test, p=0.016) Analysis of miR-21 inhibition of colon cancer cells DLD1 Anti-miR-21 Control O h 24 h Faltejskova et al., Int J Colorectal Dis 2011 Asociace miR-21 s klinickým stádiem a prognózou u pacientů s NSCLC Saito et al, Clinical Cancer Res, 2011 DESIGN Asociace miR-21 s klinickým stádiem a prognózou u pacientů s NSCLC Saito et al, Clinical Cancer Res, 2011 Meta-analýza prognostické role miR-21 u pacientů s nádorovým onemocněním p<0.001 p=0.03 Fu et al, Eur J Clin Invest 2011 Nair et al, JNCI, 2012 MikroRNA jako prognostické tkáňové biomarkery Meta-analýza 43 studií u různých typů nádorových onemocnění NEW! miR-135b, miR-31, miR-135a miR-30a-3p, miR-30e-3p MikroRNA jako prediktivní tkáňové biomarkery Slaby et al, unp.data, 2012 Predikce léčebné odpovědi u pacientů s CRC wtKRAS léčených anti-EGFR terapií (cetuximab) Screen shot 2010-02-10 at 10.31.29 AM.png MikroRNA jako terapeutické cíle Slaby et al., 2012 Iorio et al., EMBO Mol Med, 2012 MikroRNA jako terapeutické cíle Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 In vitro functional analysis of highly deregulated microRNAs in colorectal cancer In colorectal cancer we have identified by global expression profiling several microRNAs highly deregulated in colorectal cancer tissue and correlated with some important clinico-pathological phenotypes, for some of them we have performed functional in vitro analysis through anti-miRNAs or miRNA mimics. The most significant effects were observed in case of miR-215, replacemt approach lead higher apoptotic rate, lower viability and lower migratory abilities in both studied colorectal cancer cell lines (HOXD10, ERG). We are just preparing in vivo Subcutanous and orthotopic xenografts model for furher validations. MikroRNA jako terapeutické cíle Seznam mikroRNA které jsou testovány jako potenciální terapeutické cíle NEW! MicroRNAs as therapeutic targets Miravirsen, anti-miR-122 RNDr. Ondřej Slabý, PhD postdocs Mgr. Martina Rédová, PhD MUDr. Marek Svoboda, PhD MUDr. Julie Bienertová-Vašků, PhD PhD students Mgr. Renata Héžová Mgr. Jiří Šána Mgr. Petra Faltejsková Mgr. Hana Mlčochová Mgr. Robert Iliev Undergraduate students Bc. Andrej Bešše Bc. Jitka Mlčochová Bc. Klára Šrůtová Bc. Eva Dulavová Bc. Anna Čurdová Bc. Jaroslav Juráček Molekulární onkologie II logo_MOU This is our research group, we are maybe the smallest and the youngest group at CEITEC. Most of the members of RG are pregraduate students, we have 3 postdocs (1 full-time, 2 part-time), 3 PhD students and more than 10 pregraduate students. In the september we are opening one postdoc position and 2 phd positiions.