1
BBIOSENSORYIOSENSORY
Co toCo to jeje biosensor?biosensor?
PPřřehled tehled téémat pmat přřednednášáškyky
ZlepZlepššeneníí ooččekekáávanvanáá odod biosensorbiosensorůů
HistorickHistorickáá východiskavýchodiska
Informace oInformace o biosensorechbiosensorech
Vlastnosti ideVlastnosti ideáálnlnííchch biosensorbiosensorůů
SylabusSylabus
1. Definice1. Definice biosensorubiosensoru. Historický p. Historický přřehled. Charakteristiky ideehled. Charakteristiky ideáálnlnííhoho biosensorubiosensoru. Z. Záákladnkladníí mměřěřííccíí
ppřříístupy.stupy.
2. Elektrochemick2. Elektrochemickéé biosensorybiosensory, enzymov, enzymovéé elektrody. Potenciometrickelektrody. Potenciometrickéé systsystéémy amy a ISFETyISFETy..
ReferenReferenččnníí elektrody. 3.elektrody. 3. AmperometrickAmperometrickéé mměřěřeneníí kyslkyslííku, peroxidu vodku, peroxidu vodííku a NADH,ku a NADH, biosensorybiosensory ss
oxidoxidáázamizami aa dehydrogendehydrogenáázamizami.. 4.4. PPřřenosenos elektronelektronůů z enzymz enzymůů na elektrodu pomocna elektrodu pomocíí medimediáátortorůů..
KompozitnKompozitníí a organokovova organokovovéé molekuly. 5.Mmolekuly. 5.Měřěřeneníí impedance aimpedance a konduktometrickkonduktometrickéé biosensorybiosensory..
VoltametrickVoltametrickéé techniky.techniky.
6.6. SpektrofotometrickSpektrofotometrickéé,, fluorimetrickfluorimetrickéé aa chemiluminiscenchemiluminiscenččnníí sensorysensory, optick, optickáá vlvláákna. Optickkna. Optickéé
biokatalytickbiokatalytickéé sensorysensory.. BioluminiscenceBioluminiscence..
7.7. BiosensoryBiosensory pro detekci inhibitorpro detekci inhibitorůů. Recykla. Recyklaččnníí enzymovenzymovéé systsystéémy. Mikrobimy. Mikrobiáálnlníí, tk, tkááňňovovéé aa
receptorovreceptorovéé sensory.sensory.
8. Afinitn8. Afinitníí biosensorybiosensory s neps nepřříímou detekcmou detekcíí pomocpomocíí znaznačček.ek. ImunosensoryImunosensory. 9. Hybridiza. 9. Hybridizaččnníí
biosensorybiosensory pro stanovenpro stanoveníí nukleových kyselin a detekci sekvencnukleových kyselin a detekci sekvencíí oligonukleotidoligonukleotidůů.. 1010. P. Přříímméé
optickoptickéé afinitnafinitníí sensorysensory.. VyuVyužžííttíí exponenciexponenciáálnlníí vlny a resonance povrchovýchvlny a resonance povrchových plasmonplasmonůů keke
sledovsledováánníí bioafinitnbioafinitnííchch interakcinterakcíí v rev reáálnlnéé ččase. Integrovanase. Integrovanéé optickoptickéé systsystéémy, interferometry amy, interferometry a
podobnpodobnéé techniky.techniky.
11. Imobilizace11. Imobilizace biomolekulbiomolekul ppřři konstrukcii konstrukci biosensorbiosensorůů. Membr. Membráánovnovéé techniky.techniky. ElektropolymeraceElektropolymerace..
12. Aktivace povrchu12. Aktivace povrchu sensorsensorůů. Kovalentn. Kovalentníí vazbavazba biomolekulbiomolekul. 13. Miniaturizace a masov. 13. Miniaturizace a masováá
produkceprodukce biosensorbiosensorůů. S. Síítotisk, litografie,totisk, litografie, biosensorybiosensory jako soujako souččáást integrovaných analytickýchst integrovaných analytických
systsystéémmůů,, biobioččipy.ipy.
14. Komer14. Komerččnníí biosensorybiosensory. Perspektivy. Perspektivy biosensorbiosensorůů, oblasti uplatn, oblasti uplatněěnníí v medicv medicíínněě, potravin, potravináářřstvstvíí,,
ochranochraněě žživotnivotníího prostho prostřřededíí, vojenstv, vojenstvíí..
2
BiosensorBiosensor je analytický pje analytický přříístrojstroj
převodník elektronická
(transducer) jednotka
biorekogniční vrstva
analyt
výstupní signál
obsahujobsahujííccíí citlivý prvek biologickcitlivý prvek biologickéého pho půůvodu, který je buvodu, který je buďď
sousouččááststíí nebo v tnebo v těěsnsnéém kontaktu s fyzikm kontaktu s fyzikáálnlněě--chemickýmchemickým
ppřřevodnevodnííkem. Poskytuje prkem. Poskytuje průůbběžěžný elektronický signný elektronický signáál, kterýl, který
je pje přříímomo úúmměěrný koncentraci jednrný koncentraci jednéé nebo nnebo něěkolika (skupiny)kolika (skupiny)
chemických lchemických láátek ve vzorku .tek ve vzorku .
BiorekogniBiorekogniččnníí slosložžkaka
rozpoznrozpoznáávváá stanovovanou lstanovovanou láátku, kterou butku, kterou buďď::
specificky pspecificky přřememěňěňuje =uje = biokatalytickbiokatalytickáá reakcereakce::
enzym, organela, buenzym, organela, buňňka, tkka, tkááňň, org, orgáán, organismusn, organismus
nebo specificky vnebo specificky váážže =e = bioafinitnbioafinitníí reakcereakce::
vazba protilvazba protiláátek s antigeny (tek s antigeny (haptenyhapteny))
hybridizace nukleových kyselinhybridizace nukleových kyselin
vazbavazba ligandligandůů na receptoryna receptory
interakce sacharidinterakce sacharidůů ss lektinylektiny
3
FyzikFyzikáálnlněě--chemický pchemický přřevodnevodnííkk
ppřřevevááddíí biorekognbiorekogniiččnníí reakci na signreakci na signáál vhodný prol vhodný pro
daldalšíší zpracovzpracováánníí, lze je rozd, lze je rozděělit do nlit do náásledujsledujííccííchch
skupin:skupin:
elektrochemickelektrochemickéé ((potenciometriepotenciometrie,, amperometrieamperometrie,,
konduktometrie,konduktometrie, voltametrievoltametrie))
optickoptickéé (fotometrie,(fotometrie, fluorimetriefluorimetrie,, luminometrieluminometrie,,
nelinenelineáárnrníí optikaoptika))
piezoelektrickpiezoelektrickéé a akusticka akustickéé
elektromagnetickelektromagnetickéé
kalorimetrickkalorimetrickéé
nanomechanicknanomechanickéé
HistorickHistorickáá východiskavýchodiska
popoččáátek 20. stolettek 20. stoletíí: formulace koncepce: formulace koncepce redoxnredoxnííhoho potencipotenciáálu a prvnlu a prvníí
mměřěřeneníí pHpH..
1922:1922: HeyrovskHeyrovskééhoho objev polarografieobjev polarografie -- zlom na poli elektrochemiezlom na poli elektrochemie
1935: pokusy m1935: pokusy měřěřit koncentrace kyslit koncentrace kyslííku v biologických tekutinku v biologických tekutinááchch
pomocpomocíí rturtuťťovovéé kapkovkapkovéé elektrody (elektrody (MMüüllerller aa BambergerBamberger))
1938: m1938: měřěřeneníí spotspotřřeby kysleby kyslííkuku žživými organismyivými organismy -- sinice, kvasinky asinice, kvasinky a
krevnkrevníí bubuňňky,ky, PeteringPetering aa DanielsDaniels); tyto pokusy vy); tyto pokusy vyžžadovaly pradovaly prááci seci se
rtutrtutíí a poma poměěrnrněě komplikovanou polarografickou aparaturu.komplikovanou polarografickou aparaturu.
40. l40. lééta: vyuta: využžititíí katodickkatodickéé redukce kyslredukce kyslííku na uku na uššlechtilých kovechlechtilých kovech
(Au,(Au, PtPt); hol); holéé elektrody velektrody vššak v biologickak v biologickéém materim materiáálu postupnlu postupněě
ztrztráácely citlivost.cely citlivost.
4
SpolehlivSpolehlivéé mměřěřeneníí koncentrace Okoncentrace O22
1956: revolu1956: revoluččnníí zmzměěnu provedlnu provedl
ClarkClark: p: přřededřřadil elektrodovadil elektrodovéémumu
systsystéémumu membrmembráánu propustnou pronu propustnou pro
plynyplyny, a tak elektrody (pracovn, a tak elektrody (pracovníí AuAu
nebonebo PtPt katoda zatavenkatoda zatavenáá ve skle ave skle a
AgAg//AgClAgCl referentnreferentníí) fyzik) fyzikáálnlněě
izoloval od mizoloval od měřěřenenééhoho
prostprostřřededíí..
Leland C. Clark, Jr.
s první enzymovou elektrodou
1962: na symposiu1962: na symposiu NewNew YorkYork AcademyAcademy ofof SciencesSciences ClarkClark popsalpopsal
jakjak „„ududěělat elektrochemicklat elektrochemickéé sensorysensory ((pHpH, polarografick, polarografickéé,,
potenciometrickpotenciometrickéé nebonebo konduktometrickonduktometricéé) inteligentn) inteligentněějjšíšími pmi přřididáánníímm
enzymových penzymových přřevodnevodnííkkůů uzavuzavřřených jako sendviených jako sendvičč v membrv membráánnááchch““
tento koncept ilustroval experimentem s glukosatento koncept ilustroval experimentem s glukosa oxidasouoxidasou
zachycenou na povrchu kyslzachycenou na povrchu kyslííkovkovéé elektrody pomocelektrody pomocíí dialyzadialyzaččnníí
membrmembráányny -- mměřěřený pokles koncentrace kyslený pokles koncentrace kyslííku bylku byl úúmměěrnýrný
koncentraci glukkoncentraci glukóózyzy
ClarkClark ss LyonsemLyonsem v publikaci poprvv publikaci poprvéé uvedli termuvedli termíín enzymovn enzymováá
elektroda (elektroda (ččasto nesprasto nespráávnvněě ppřřipisovanýipisovaný UpdikoviUpdikovi aa HicksoviHicksovi , kte, kteřříí
propracovali experimentpropracovali experimentáálnlníí detaily potdetaily potřřebnebnéé k zk zíískskáánníí funkfunkččnníí
enzymovenzymovéé elektrody pro glukosu)elektrody pro glukosu)
5
50.50.--60. l60. lééta: prvnta: prvníí enzymovenzymovéé elektrodyelektrody
1969: potenciometrick1969: potenciometrickáá enzymovenzymováá elektroda (elektroda (GuilbaultGuilbault))
1974: enzymový termistor (1974: enzymový termistor (MosbachMosbach))
1975: komer1975: komerččnníí biosensorbiosensor pro glukosu (fa. YSI, Ohio)pro glukosu (fa. YSI, Ohio)
70. l70. lééta: objevuje se pojemta: objevuje se pojem „„biosensorbiosensor““ (byla snaha pou(byla snaha použžíítt
""bioprobebioprobe", tento n", tento náázev vzev vššak byl chrak byl chráánněěn).n).
zavzavááddíí se pojemse pojem „„optodaoptoda““ propro sensorysensory na bna báázi optických vlzi optických vláákenken
((LubbersLubbers aa OpitzOpitz))
1976: na trhu um1976: na trhu uměělý pankreaslý pankreas BiostatorBiostator (fa.(fa. MilesMiles),), biosensorbiosensor propro
laktlaktáát (fa. Lat (fa. La RocheRoche))
1982: pops1982: popsáánn implantovatelnýimplantovatelný glukosovýglukosový biosensorbiosensor –– jehlovjehlováá
enzymovenzymováá elektroda (elektroda (SchichiriSchichiri))
výzkumvýzkum imunochemickýchimunochemických biosensorbiosensorůů ((imunosensoryimunosensory))
1990: na trh uveden BIAcore (fa.1990: na trh uveden BIAcore (fa. PharmaciaPharmacia))
~2000:~2000: nnáástup DNAstup DNA biobioččipipůů
BiosensorBiosensor pro glukosupro glukosu
dosud nejdosud nejúúspspěěššnněějjšíší biosensorbiosensor je zaloje založžen naen na
ferrocenuferrocenu -- ppřřenaenaššeečči elektroni elektronůů zz oxidoreduktasoxidoreduktas nana
elektrodu (fa.elektrodu (fa. MedisenseMedisense).).
Levný osobnLevný osobníí biosensorbiosensor pro dompro domááccíí mměřěřeneníí krevnkrevníí
glukosy diabetiky.glukosy diabetiky.
6
BiosensorBiosensory vy v BrnBrněě
19501950 -- zalozaložžena Katedra biochemie naena Katedra biochemie na PPřřFF MUMU
19701970 -- Prof.Prof. LumLumíírr MacholMacholáánn -- enzymovenzymovéé elektrody (inhibiceelektrody (inhibice
tyrosinasytyrosinasy,, konduktometrickkonduktometrickéé mměřěřeneníí momoččoviny,oviny, diaminoxidasadiaminoxidasa))
19901990 –– inhibiceinhibice cholinesterasycholinesterasy pro detekcipro detekci organofosforganofosfááttůů -- spoluprspolupráácece
s arms armáádou (VTUO Brno)dou (VTUO Brno)
19931993 –– piezoelepiezoelekktrictrickkéé sensorsensoryy (prvn(prvníí experimenty s Prof.experimenty s Prof. MarcoMarco
MascinimMascinim)) aa studiestudie afinitafinitnnííchch interainterakckcíí pomocpomocíí biosensorbiosensorůů
19951995 –– poupoužžíívváánníí ssíítotiskovýchtotiskových sensorsensorůů ((KrejKrejččíí EngineeringEngineering, dnes, dnes
BVT Technologies)BVT Technologies)
19991999 –– mikrorammikroraméénkanka jako afinitnjako afinitníí sensorysensory (University v(University v MainzuMainzu aa
JanovJanověě, Dr., Dr. RobertoRoberto RaiteriRaiteri))
~~20022002 –– aktivity na poli elektrochemickýchaktivity na poli elektrochemických imunosensorimunosensorůů propro
biologickbiologickáá agens (agens (F. tularensisF. tularensis))
BiosensorBiosensoryy vv BrnBrněě
20052005 –– ppřřesun do novesun do novééhoho kampusukampusu vv BrnBrněě -- BohunicBohunicííchch
zpozpoččáátku v rtku v ráámci ILBIT (mci ILBIT (integratedintegrated laboratorieslaboratories ofof biomedicalbiomedical
technologiestechnologies))
20062006 –– inicioviniciováán výzkumn výzkum nanobiotechnologinanobiotechnologiíí -- pod Npod Náárodnrodníímm
centrem pro výzkumcentrem pro výzkum biomolekulbiomolekul
v souv souččasnosti aktivity realizovasnosti aktivity realizováány vny v::
-- A5 /A5 / ÚÚstav biochemiestav biochemie -- ppřřednednášášky a výukaky a výuka
zamzaměřěřenenáá nana biosensorybiosensory,, „„traditradiččnní“í“ oblastioblasti
výzkumuvýzkumu ((eleelekktrochemictrochemickkéé,, piezoelepiezoelekktrictrickkéé,,
opticoptickkéé,, ……))
-- A4 /A4 / NNáárodnrodníí centrum pro výzkumcentrum pro výzkum biomolekulbiomolekul --
nanobiotechnologienanobiotechnologie –– AFMAFM NtegraNtegra Vita aVita a
SolarisSolaris,, biointerakcebiointerakce –– BiacoreBiacore 30003000))
7
BiosensorBiosensoryy v Brnv Brněě ppřříšíšttíí rokrok
European Structural FundsEuropean Structural Funds -- regionregionáálnlníí podporapodpora
Central European Technological Institute (CEITEC)Central European Technological Institute (CEITEC)
-- hlavnhlavníí partnepartneřři MU a VUT ai MU a VUT a řřada dalada dalšíších brnch brněěnskýchnských
institucinstitucíí
-- nanašše skupina soue skupina souččááststíí programu 4programu 4
StrukturnStrukturníí biologiebiologie
-- NanobiotechnologieNanobiotechnologie aa biointerakcebiointerakce
VýzkumnVýzkumnáá skupinaskupina
odbornodborníí pracovnpracovnííci:ci:
JanJan PPřřibyl, Jiibyl, Jiřříí ŽŽeraveravííkk
doktoranddoktorandii:: 1010
ZdenkaZdenka FohlerovFohlerováá, Milan J, Milan Jíílek, Zuzana Svozilovlek, Zuzana Svozilováá, Anton, Antoníínn
HlavHlavááčček, Karel Lacinaek, Karel Lacina,, KateKateřřinaina FrnkovFrnkováá,, ŠáŠárka Novotnrka Novotnáá, Martin, Martin
KKřříížž, David Kov, David Kováářř, Eva Kupsk, Eva Kupskáá
magistermagisterššttíí studentstudentii:: 4 (dal4 (dalšíší ppřřijdou vijdou v řřííjnu)jnu)
bakalbakaláářřššttíí studentsstudents:: 10 (10 (20102010 konkonččilo)ilo)
zahranizahraniččnníí studenti:studenti: 4 (letos)4 (letos)
8
DostupnDostupnéé vybavenvybaveníí ……
surface plasmon resonancesurface plasmon resonance -- Biacore 2000 and 3000,Biacore 2000 and 3000, SpreetaSpreeta
SPMSPM -- AFMAFM NtegraNtegra Vita, SNOMVita, SNOM NtegraNtegra SolarisSolaris
opticaloptical -- DAD spectrophotometer SCINCO, fiber optics spectrophotometerDAD spectrophotometer SCINCO, fiber optics spectrophotometer
Ocean Optics,Ocean Optics, fluorimetricfluorimetric detectordetector AvantesAvantes, var. light sources,, var. light sources,
multipurpose plate reader Synergy2 (abs /multipurpose plate reader Synergy2 (abs / fluofluo // lumilumi),), MultiscanMultiscan RCRC
electrochemistryelectrochemistry –– 22 PalmSensPalmSens, 4, 4 EmStatsEmStats, EIS techniques, many single /, EIS techniques, many single /
multimulti--channel amperometric detectorschannel amperometric detectors
flowflow--through techniquesthrough techniques –– FIAlabFIAlab 3000, 23000, 2 autoinjectorsautoinjectors , 5 MP3 pumps,, 5 MP3 pumps,
>1>155 miniperistalticminiperistaltic pumps, 4 electronic valves,pumps, 4 electronic valves, ……
piezosensorspiezosensors -- 55 piezodetectorspiezodetectors, hi, hi--freq. impedance analyzerfreq. impedance analyzer
microbial and mammalianmicrobial and mammalian cell culturescell cultures
fluorescence microscopyfluorescence microscopy
inin--house facilities:house facilities: NMR 600 MHz, MALDI TOF, ES MS, LC/MS, CE, CE/MS,NMR 600 MHz, MALDI TOF, ES MS, LC/MS, CE, CE/MS,
CE on chipCE on chip,, HPLCsHPLCs,, FPLCsFPLCs,, crystalizationcrystalization, proteomics,, proteomics, biomolecularbiomolecular
modellingmodelling, recombinant proteins,, recombinant proteins, microcalorimetrymicrocalorimetry,, RTRT--PCR,,PCR,, ……
VýzkumnVýzkumnéé projektyprojekty
electrochemical immunosensors for rapid detection of bioagents (electrochemical immunosensors for rapid detection of bioagents (FrancisellaFrancisella))
biosensor, detector, softwarebiosensor, detector, software –– Min. of Defense / MTIPMin. of Defense / MTIP
piezoelectric biosensorspiezoelectric biosensors –– applicationsapplications –– bacteria, pesticides, clinical markers,bacteria, pesticides, clinical markers,
glycatedglycated hemoglobin,hemoglobin, boronateboronate complexescomplexes
detection of DNAdetection of DNA aductsaducts withwith benzo[benzo[aa]pyrene]pyrene (SPR, AFM,(SPR, AFM, nanoparticlesnanoparticles)) –– NPVIINPVII
bioelectronicbioelectronic tongue for wine quality controltongue for wine quality control –– NPVIINPVII
biosensors with mammalian cell culturesbiosensors with mammalian cell cultures –– adhesion, apoptosis, effect ofadhesion, apoptosis, effect of
immunomodulatorsimmunomodulators (PZ, EIS)(PZ, EIS)
combined studies of affinity and function ofcombined studies of affinity and function of biomoleculesbiomolecules –– simultaneoussimultaneous
information on binding and enzyme activity ofinformation on binding and enzyme activity of bioconjugatesbioconjugates (PZ(PZ--elchemelchem., PZ., PZ--
optical)optical) –– Research Center (local)Research Center (local)
biosensors forbiosensors for mycotoxinsmycotoxins –– feasibility studyfeasibility study –– Min. of IndustryMin. of Industry
nanomechanicalnanomechanical biosensorsbiosensors –– microcantileversmicrocantilevers as transducers, effect of porousas transducers, effect of porous SiSi,,
model study (model study (E. coliE. coli, albumin), albumin) –– NATONATO SfPPSfPP
biosensors for pesticidesbiosensors for pesticides –– EU FP6 SSAEU FP6 SSA BioDetBioDet
biomimeticbiomimetic sensorssensors –– EU FP7 IRSES BIOMIMICEU FP7 IRSES BIOMIMIC
9
ČČasopisyasopisy oo biosensorechbiosensorech
BiosensorsBiosensors andand BioelectronicsBioelectronics –– vvššechny aspekty oboru, novechny aspekty oboru, novéé trendytrendy
SensorsSensors andand ActuatorsActuators BB ChemicalChemical -- zejmzejmééna fyzikna fyzikáálnlněě--chemickchemickéé
ppřřevodnevodnííkyky
ElectroanalysisElectroanalysis // JournalJournal ofof ElectroanalyticalElectroanalytical ChemistryChemistry //
BioelectrochemistryBioelectrochemistry andand BioenergeticsBioenergetics -- elektrochemickelektrochemickéé biosensorybiosensory
AnalyticalAnalytical ChemistryChemistry // AnalyticaAnalytica ChimicaChimica Acta /Acta / AnalyticalAnalytical BiochemistryBiochemistry //
AnalyticalAnalytical LettersLetters // AnalystAnalyst // TrendsTrends inin AnalyticalAnalytical ChemistryChemistry -- ččististěě
analytickanalytickéé, mnoho, mnoho ččlláánknkůů oo biosensorechbiosensorech a jejich aplikaca jejich aplikacííchch
EnzymeEnzyme andand MicrobialMicrobial TechnologyTechnology -- mikrobimikrobiáálnlníí sensorysensory
JournalJournal ofof BiotechnologyBiotechnology -- aplikace paplikace přři biotechnologických procesechi biotechnologických procesech
JournalJournal ofof ImmunologicalImmunological MethodsMethods –– imunochemickimunochemickéé sensorysensory
LangmuirLangmuir // ThinThin SolidSolid FilmsFilms -- nněěkterkteréé aspekty imobilizaaspekty imobilizaččnníích postupch postupůů..
Knihy oKnihy o biosensorechbiosensorech
MosbachMosbach K.K. ImmobilizedImmobilized EnzymesEnzymes andand CellsCells,, MethodsMethods inin EnzymologyEnzymology, Vol. 137,, Vol. 137,
AcademicAcademic PressPress,, SanSan DiegoDiego, 1988., 1988.
Turner A. P. F.,Turner A. P. F., KarubeKarube I.,I., WilsonWilson G. S.G. S. BiosensorsBiosensors: Fundamentals: Fundamentals andand ApplicationsApplications,,
Oxford UniversityOxford University PressPress, Oxford, 1987., Oxford, 1987.
CassCass A. E. G.A. E. G. BiosensorsBiosensors: A: A PracticalPractical ApproachApproach, IRL, IRL PressPress, Oxford, 1990., Oxford, 1990.
SchellerScheller F., Schubert F.F., Schubert F. BiosensorsBiosensors,, ElsevierElsevier, Amsterdam, 1992., Amsterdam, 1992.
BuerkBuerk D. G.D. G. BiosensorsBiosensors,, TheoryTheory andand ApplicationsApplications,, TechnomicTechnomic,, LancasterLancaster, 1993., 1993.
BuckBuck R. P.,R. P., HatfieldHatfield W. E.,W. E., UmanaUmana M.,M., BowdenBowden E. F.E. F. BiosensorBiosensor Technology,Technology,
FundamentalsFundamentals andand ApplicatiApplicati--onsons, M., M. DekkerDekker,, NewNew York, 1990.York, 1990.
WiseWise D. L.D. L. BioinstrumentationBioinstrumentation:: ResearchResearch,, DevelopmentDevelopment andand ApplicationsApplications,,
ButterworthButterworth, Boston, 1990., Boston, 1990.
WiseWise D. L.D. L. BioinstrumentationBioinstrumentation andand BiosensorsBiosensors, M., M. DekkerDekker,, NewNew York, 1991.York, 1991.
Blum L. J.,Blum L. J., CouletCoulet P. R.P. R. BiosensorsBiosensors:: PrinciplesPrinciples andand ApplicationsApplications, M., M. DekkerDekker,, NewNew
York, 1991.York, 1991.
Turner A. P. F.Turner A. P. F. AdvancesAdvances inin BiosensorsBiosensors, JAI, JAI PressPress, London, Vol. 1, 1991; Vol. 2, 1992;, London, Vol. 1, 1991; Vol. 2, 1992;
Vol. 3, 1994.Vol. 3, 1994.
SchellerScheller F.,F., SchmidSchmid R. D.R. D. BiosensorsBiosensors: Fundamentals, Technologies: Fundamentals, Technologies andand ApplicationsApplications,,
GBFGBF MonographsMonographs 17, VCH,17, VCH, WeinheimWeinheim, 1992., 1992.
WiseWise D. L.,D. L., LemuelLemuel B.B. BiosensorsBiosensors andand FiberopticsFiberoptics,, HumanaHumana,, CliftonClifton, 1991., 1991.
AlcockAlcock S. J., Turner A. P. F. InS. J., Turner A. P. F. In VivoVivo ChemicalChemical SensorsSensors,, RecentRecent DevelopmentsDevelopments,,
CranfieldCranfield PressPress,, BedfordBedford, 1993., 1993.
Wagner G.,Wagner G., GuilbaultGuilbault G.G.G.G. FoodFood BiosensorBiosensor AnalysisAnalysis, M., M. DekkerDekker,, NewNew York, 1993.York, 1993.
ScottScott D. A.D. A. BiosensorsBiosensors forfor FoodFood AnalysisAnalysis,, RoyalRoyal SocietySociety ofof ChemistryChemistry, London, 1996., London, 1996.
10
BiosensoryBiosensory nana internetuinternetu
HypertextovHypertextový uý uččebnebníí text (HTML Help):text (HTML Help):
http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.chmhttp://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.chm
Elektronický textElektronický text –– AcrobatAcrobat PDF:PDF:
http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdfhttp://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdf
ZZáákladnkladníí pojmypojmy
CitlivostCitlivost je koneje koneččnnáá ustustáálenlenáá
zmzměěna výstupnna výstupníího signho signáálulu
biosensorubiosensoru (S) v(S) v ddůůsledku zmsledku změěnyny
koncentracekoncentrace analytuanalytu (c), tj.(c), tj. ∆∆S/S/∆∆c,c,
nebonebo dSdS//dcdc. P. Přři provi prováádděěnníí
kinetických mkinetických měřěřeneníí (sleduje se(sleduje se
ččasovasováá zmzměěna signna signáálulu dSdS//dtdt) se) se
citlivost vypocitlivost vypoččííttáá jakojako
∆∆((dSdS//dtdt)/)/∆∆c.c.
KalibraceKalibrace spospoččíívváá ve vystavenve vystaveníí
biosensorubiosensoru rrůůzným standardnzným standardníímm
roztokroztokůům om o znznáámméé koncentracikoncentraci
analytuanalytu. Kalibra. Kalibraččnníí body by mbody by měělyly
uzavuzavíírat pracovnrat pracovníí oblastoblast
biosensorubiosensoru, aby nebylo t, aby nebylo třřebaeba
provprováádděět nespolehlivt nespolehlivéé
extrapolace.extrapolace.
pozadí
přídavek
analytu
ustálený
signál
∆S
dS/dt
čas
Průběh měření s biosensory.
S
c
∆S/∆c
oblast
linearity
limit
detekce
Kalibrační závislost
11
Limit detekceLimit detekce (LOD)(LOD) biosensorubiosensoru jeje
nejninejnižžšíší stanovitelnstanovitelnáá koncentracekoncentrace
analytuanalytu. Ide. Ideáálnlněě je dje dáán rozlin rozliššeneníímm
mměřěřííccíího pho přříístroje, obvykle je vstroje, obvykle je vššakak
zhorzhorššovováán vedlejn vedlejšíšími procesy. Promi procesy. Pro
definici se poudefinici se použžíívváá velikostvelikost ššumu (N,umu (N,
noisenoise) sign) signáálu a limit detekce se bere prolu a limit detekce se bere pro
pompoměěrr S/NS/N == 33..
S = 3 N
N
analyt
Stanovení limitu detekce
• Signál pozadí (background) je signál v nepřítomnosti analytu, obvykle se
odečítá od měřeného signálu: S = S(měřený) - S(pozadí). Někdy je
výhodnější použít referentní koncentraci analytu a vůči ní vztáhnout měřený
signál. Pro semilogaritmický případ dostaneme S/S(ref) =
(měření-pozadí)/(reference-pozadí).
• Dlouhodobá stabilita (drift) je podmíněna změnami citlivosti biosensoru v
čase. Citlivost obvykle klesá, ale může i přechodně vzrůst (změna biovrstvy ztenčení,
nabobtnání). Postupný pokles citlivosti může být vyvolán oxidaxí
povrchu kovových elektrod, usazováním vrstev proteinů či jiných biomolekul
(měření in vivo), otrava biovrstvy těžkými kovy. Skokové změny jsou
vyvolány mechanickými vli-vy, mohou často uniknout pozornosti.
• Selektivita (vliv interferencí). Odezva biosensoru by měla být vyvolána
pouze přítomností stanovované látky. Prakticky je často nutné rušivé látky
eliminovat (zře-dění, konverse na nerušící sloučeniny, předřazení selektivní
bariéry) nebo jejich příspěvek na měřený signál paralelně určit jiným
sensorem (diferenciální uspořádání).
Rychlost odezvyRychlost odezvy je urje urččovováána zejmna zejmééna fyzikna fyzikáálnlníími vlastnostmimi vlastnostmi
biosensorubiosensoru (velikost). Z(velikost). Záávisvisíí na rychlosti difna rychlosti difúúzeze analytuanalytu zz okolnokolnííhoho
prostprostřřededíí kk povrchupovrchu biosensorubiosensoru aa ddáále pak vnitle pak vnitřřnníí difdifúúzzíí uvnituvnitřř
systsystéémumu biosensoru.biosensoru.
Doba odezvyDoba odezvy se obvykle urse obvykle urččuje jakouje jako ččas potas potřřebný kebný k dosadosažženeníí ururččititéé
velikosti signvelikosti signáálu vlu v konekoneččnnéém ustm ustáálenlenéém stavu (tm stavu (t →→ ∞∞), nap), napřř.. ττ9595 propro
dosadosažženeníí 95%.95%.
TeplotnTeplotníí zzáávislostvislost ppřři mi měřěřeneníích sch s biosensorybiosensory ppůůsobsobíí jednak najednak na
difdifúúznzníí jevy, jednak na probjevy, jednak na probííhajhajííccíí chemickchemickéé reakce. Proto sereakce. Proto se
obvykle pracuje za isotermických podmobvykle pracuje za isotermických podmíínek, pounek, použžíívváá se vodnse vodníí
cirkulujcirkulujííccíí termostat nebo vyhtermostat nebo vyhřříívaný kovovývaný kovový blok.blok.
ŽŽivotnostivotnost biosensorubiosensoru jeje obykleobykle limitovlimitováána neslabna neslabšíším prvkem, com prvkem, cožž jeje
biorekognibiorekogniččnníí ččáást. Pst. Přřitom je titom je třřeba odlieba odliššitit stabilitu pstabilitu přři skladovi skladováánníí ((shelfshelf
lifelife) od) od operaoperaččnníí stabilitystability, kter, kteráá mmůžůže být ze být záávislvisláá na pona poččtu a druhutu a druhu
analysovanýchanalysovaných vzorkvzorkůů. Pro dlouhodob. Pro dlouhodobéé ulouložženeníí biosensorubiosensoru jeje
obecnobecněě vhodnvhodnáá ninižžšíší teplota (chladniteplota (chladniččka, mraznika, mrazniččka), z praktickka), z praktickééhoho
hlediska je pohodlnhlediska je pohodlněějjšíší skladovskladováánníí v suchv suchéém stavu.m stavu.
12
PodmPodmíínky mnky měřěřeneníí ss biosensorybiosensory
BiosensorBiosensor se nachse nacháázzíí ppřříímo vemo ve
sledovansledovanéém prostm prostřřededíí ((řřeka, tkeka, tkááňň,,
krevnkrevníí řřeeččiiššttěě,, fermentorfermentor, ...)., ...). JJehoeho
ččinnostinnost byby nemneměěla okolnla okolníí prostprostřřededíí
ovlivnitovlivnit -- vyvyččerperpáávváánníí analytuanalytu
ddůůsledkem msledkem měřěřeneníí, ovlivn, ovlivněěnníí tokutoku
jiných ljiných láátektek, ..., ...
BiosensorBiosensor je umje umííststěěn ve vhodnn ve vhodnéé
nnáádobce (dobce (ččasto opatasto opatřřenenáá vodnvodníímm
plplášášttěěm prom pro temperacitemperaci aa magnemagne--tickýmtickým
mmííchadlem). Nejprve se vychadlem). Nejprve se vyččkkáá ustavenustaveníí
pozadpozadíí signsignáálu v plu v přříítomnostitomnosti
pracovnpracovníího roztoku (ho roztoku (pufrpufr obsahujobsahujííccíí
dle potdle potřřeby daleby dalšíší pomocnpomocnéé reagentyreagenty).).
PPřřididáá sese vzorek a po ustvzorek a po ustáálenleníí se odese odeččtete
signsignáál. Pl. Přříídavky vzorku lzedavky vzorku lze ččastoasto
nněěkolikrkolikráát opakovat.t opakovat.
Přímý kontakt se vzorkem
S
čas
přídavky
vzorků
Měření v nádobce
PodmPodmíínky mnky měřěřeneníí ss biosensorybiosensory
BiosensorBiosensor je umje umííststěěn ve vhodnn ve vhodnéé prprůůtotoččnnéé cele. Jsou mocele. Jsou možžnnéé dva zpdva způůsobysoby
ččinnosti. Systinnosti. Systéémem se nechmem se necháá ststřříídavdavěě protprotéékat zkat zóóna zna záákladnkladníího roztoku aho roztoku a
zzóónyny vzorkvzorkuu (A). M(A). Měřěřený signený signáál je tedy vyvoll je tedy vyvoláán pn přříímo nemo neřřededěěnýmným vzorkem.vzorkem.
PPřřii druhdruhéém zpm způůsobu systsobu systéémem neustmem neustáále protle protéékkáá pracovnpracovníí roztok, doroztok, do
kterkteréého se nastho se nastřřikujikujíí vzorky (FIA,vzorky (FIA, flowflow injectioninjection analysisanalysis). P). Přřitom vitom vžždydy
dojde k definovandojde k definovanéému namu nařřededěěnníí vzorku a signvzorku a signáál ml máá charakteristický tvarcharakteristický tvar
ppííkkůů (B); vyhodnocuje se bu(B); vyhodnocuje se buďď jejich výjejich výšška nebo plocha. Prka nebo plocha. Průůtotoččnnáá
uspouspořřááddáánníí umoumožňžňujujíí automatizovat mautomatizovat měřěřeneníí..
IN OUT
A
B
průtočnácela
s biosensorem
čas
S
Průtočné měření s biosensory