Biosensory s nukleovými kyselinami detekce výskytu známé cílové sekvence ve vzorku Oxidace a redukce DNA O Oxidační místo O Redukční místo párování bazí Cyklická voltametrie DNA dsDNA -1.3 E (V) -0.5 Diferenční pulzní polarografie DNA III dsDNA AC polarografie DNA -1.6 -1.2 -0.8 E (V) -0.4 Chronopotenciometrie Princip: kontrolovaný konstantní proud je aplikován mezi pracovní a pomocnou elektrodu a měří se časová závislost napětí mezi pracovní a referentní elektrodou Odezva je vyvolána koncentračními změnami elektroaktivních látek v průběhu elektrolýzy. Instrumentace: potentiostat v galvanostatickém modu time Potenciometrická „stripovací" analýza Procedura 1. Imobilizace próby adsorpcí 2. Promytí, přenos do čistého pufru 3. Inkubace se vzorkem - hybridizace („stripování") 4. Chronopotenciometrické měření dt/dE (s/V) Electrochemická oxidace guaninu klesá po hybridizaci 0.6 0.8 1 E (V) 1.2 dsDNA I o -o-p=o I o Struktura „peptidových" nukleových kyselin (PNA) Výhody PNA: • nenabitá kostra • duplex PNA-DNA je stabilnější • zlepšená citlivost • zlepšená specificita • rychlejší hybridizace • širší hybridizační Vazba do malého žlábku Co[(2,2'-bipyridyl)3]3+, netropsin Elektrostatické interakce s fosfátovou / cukernou kostrou I nterka látory ethidium, propidium, proflavin, chloroquin, doxorubicin Kombinovaná interakce Co[(phen)3]3+, DAPI (4',6-diamidinofenyl indol) Indikátory hybrídizace HiMJOQCLnHi akridinová oranž j^yv^. Proflavin h2W-Q-Q-nh2 ethidium R = ethyl ~H Pr°PidiumR=4Ha2h5 ch h k^^Oňc^5 chloroquin ..XÓ Biosensory pro DNA po hybridizaci • imobilizace próby -1 min +0.5 v • hybrídizace - s min +0.5 v • interkalace -1 min, +0.5 v, 50 mM Co[(phen)3]3+ • měření (dE/dt)1 (S/V) E (V) 0.2 E (V) 0.4 Imobilizace nukleových kyselin a oligonukleotidů adsorce na celulosu ultrafialové světlo (kovalentní vazba na celulosu) zachycení uvnitř celulosy, agaru, polyakrylamidu aktivace: CNBr karbodiimidu diazotací kyanurchlorid epoxy oxidace jodistanem (pro RNA) reversibilní komplexace imobilizovanou kys. boritou 6 Aktivace DNA /w O-P-OH + H3C^I\r* 9H3 NH oligonukleotid s 5' fosfoskupinou imidazol /w í O-P-OH aktivní ester - intermediát ch3 - 1 ^ H3c NH NH isomočovina H,I\T^^^NH, O-P-OH 5'-aminoskup Nhk I NH2 | Značení / imobilizace DNA 5c N^2^o- p OH NH2 biotin-14-dATP p p (podobně biotin-11-dUTP, spojení v C-5 pozici) DNA polymerasa a terminálni transferasa 8-aminohexyl-dATP terminálni transferasa o- p p p 7 Genová analýza s biosensory Cílová DNA přidání vhodných primem amplifikace pomocí PCR fluorescenční značení inkubace s próbami hybridizace naskenování fluorescence konverse údajů o fluorescenci na informaci o sekvenci Kits reaktanty Průtočná stanice Skener Software PCR - polymerasová řetězová reakce vv \ Denaturace dsDNA 93°C \ Vazba primerů ^_ 37 - 55°C \ Prodloužení primerů _70°C Taq polymerasa \ Denaturace dsDNA 93°C Opakování cyklu 8 Dva přístupy I. cDNA (500~5000 bází) je imobilizována na pevný povrch (sklo) a exponována souboru cílových sekvencí buď separátně nebo ve směsi Vyvinuto Stanford University, „DNA microarray" II: používá se soubor oligonukleotidů (20~80-merů) nebo peptidových NA (PNA) prób precizní technologie, srovnatelnost výsledků krátké próby - menší specifita a citlivost; vysoká cena Vyvinula firma Affymetrix, „GeneChip" 9 GeneChip oligonukleotidové próby soubor o známých sekvencích navázaný na skleněný čip zapouzdření do plastu (snadná manipulace) kombinatorická syntéza souboru přímo na čipu výrobce: Affymetrix Rozměry elementů plátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm) z něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm) na každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 um) v každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidové próby s danou známou sekvencí Výroba sensoru kombinace chemické reakce a UV ozařování fotolitografie, fotosenzitivní imobilizační procedura i i i i □ oooo Llgrrt {deproiectioiil ■.■■TT¥ M i i i i i ►ooooo <><>*><><, Water GATCG I I I ► OHOHOOO I I I I I ■ TTOOO iiíii I I I I I TTCCOi 2S-rr»ríCA TA T A G C TG SUU Reptat SSSSS GeneCriip* Micrparray II I „ I I I I I TTOHOHO^ TTOOO lilii iiili ■ ukázka masky pro celý wafer (vlevo) ■ vpravo pak výsek pro 20x20 elementů 11 Probe Synthesis Probe Synthesis A 3 x 3 array array probes CD ü < tu o CT CD c/j o Q_ CD Q CD Probe Synthesis A 3 x 3 array array probes A Nucleotide Deposition Sequence defines the order of nucleotide deposition A Probe Embedding specifies the steps it uses in the sequence to get placed CD c/i o CD Q CD U—' O _CD O 2(5 -> Mask 3 Výroba DNA čipu b L b É i - * I I _!_!_ silanizovaný povrch sensoru, každý atom Si je zárodkem próby navázání spojovací části „linkeru", ten zakončený fotocitlivou blokovací skupinou ■ — H — ■ - H — * - ozáření přes masku - odstranění blokujících skupin (deprotekce) ■ navázání prvního nukleotidu (A) i i i i i i i i i i i i i r". . . j r... .. j,r =--■,- LZ1 maska č. 4 Výroba (3) 4 N t* tt T p f( i « _ další (T), ale výskyt chyby! i ľ i i ■ Ti T , ■ III zabránění dalšího růstu chybné sekvence - ukončovací báze („capping agent") po každém kroku ..■ ■ ■ - ■ ■ ■ ■: . : ■ ^ ■ . T* I * T* ■ ■ B B ■ T* T, T« mm B . 'eklté-j-^ÍTÍiľ-[--1-TSHí-f-1 c c c c c Hotovo! T T T r Hl n ■ T T r í "ď "c T T T ľ C C C C L l L L, ■ s- a - L L I I s - s - L L. ■ a - a ■ S - S - S - Si ■ konečný stav po odstranění „capping agents" a postranních protektivních skupin, následuje zabalení („packaging") do výměnné „cartridge" ■ pro 25-mer potřeba obvykle méně než 100 masek (teor. maximum) ■ problém: přesahy na hranicích mezi jednotlivými zónami (odrazy, rozptyl, vnitřní ozáření, ...) Ink-jet printing piezoelektrický element skleněná membrána -► • ústí mi kro kapka (100 pl) mikropumpa (struktura vyleptána v k řemíku) I nk-jet tisková hlava ■ alternativní metoda přípravy dna čipů - „tisk" reagencií na podklad - obdoba inkoustových tiskáren ■ základem je struktura rezervoáru vytvořená v křemíku (micromachining), překrytá velmi tenkou skleněnou membránou, na kterou přiléhá piezoelektrický element (aktuátor) ■ rezervoár se naplní reagentem, poté nad ústí pumpy posune žádaná pozice čipu, a na piezoelektrický aktuátor se přivede puls napětí ■ piezoelement se mechanicky deformuje, zatlačí na membránu, čímž dojde k vystříknutí mikrokapky reagentu ■ rychlost „tisku" je 1 až 6 kHz Ink-jet printing rozptýlení kapky na povrchu brání předcházející modifikace čipu hydrofilní místa pro imobilizaci prób navzájem oddělené hydrofobními úseky (surface tension weils) nanášené kapky reagentů se nerozpíjí, povrchové napětí je drží uvnitř dané pozice ff^ pohyb pole —p řes pumpy ink-jet pumpy C A G T zásobníky aktivovaných bází Syntéza souboru DNA prób ■ reakční kroky probíhají naráz na všech pozicích čipu ■ promývání a pomocné reakce se provádí pro celý čip společně ■ pro 100000 pozic trvá prodloužení o jednu bázi asi 5 minut ■ syntéza souboru o délce 25 bázf zabere 2 hodiny. Primitivní postupy 4p „pin printing" - hrot se namočí v roztoku hotové proby a mikrokapka se přenese do žádané pozice na čipu 500-5,000 bází dlouhé PCR produkty se generují specifickými primery z cDNA knihoven velikost spotů je 100-300 um, až 10 tisíc prob na čipu horší reprodukovatelnost, pomalost nízká cena, laboratorní příprava 59 Průběh analýzy ■ příprava vzorku z buněk (2 dny), nanášení vzorků ■ hybridizace (až 16 hod) ■ promývání a fluorescenční značení - Fluidics Station 4-kanálová - různé pracovní protokoly (1.5 hod) automatizované přidávání reagentů, míchání, inkubace, promývání-zvýšená spolehlivost a reprodukovatelnost GeneArray Scanner ■ zasunutí cartridge ■ laserové skenování ■ zaznamenání fluorescenčního 2D-obrazu Výrobce: např. HP (Agilent) rozlišení: lepší než 10 um přes 106 pozic 17 Zpracování signálu ü ser nastavení skeneru - různé úrovně odpovídající stavu PM („perfect match") a MM („mismatch") změny poměru PM/MM v důsledku nastavení přístrojů mohou vést ke změně interpretace o přítomnosti genu technické komplikace - prachové částice, gradienty excitace, správné nastavení mřížky vymezující jednotlivé zóny statistické normalizování a vážení signálu, manipulace s rozhodovacími úrovněmi: Statistical Difference Threshold (SDT) = jak signifikantní je rozdíl mezi PM a MM při uvážení dané úrovně šumu? Statistical ratio threshold (SRT) = jak větší musí být PM než MM pro pozitivní výsledek? Zvýšené nastavení SRT dělá analýzu více stringentní (vliv uživatelského nastavení vyhodnocovacího programu) výsledek pro daný gen: Present / Marginal / Absent plus numerická hodnota odpovídající úrovni exprese PM MM Způsoby použití DNA čipů 19 AAA TA G G A T T G G C A T c ■ ■ ■■ I Resequencing Analýza genové exprese ■ Human Génom Project - 99.9% DNA u jednotlivých osob je identické sekvence ■ i minimálni sekvenční diference však mohou vést k ohromným rozdílům v úrovni exprese genů ■ různé druhy buněk daného organismu obsahují shodnou DNA, ale ne každý gen je exprimován v každém typu buňky ■ studium genové exprese se provádí měřením hladiny odpovídající přepisované RNA ■ na čipu je každý z asi 30 tisíc genů reprezentován unikátní sekvencí o délce 25 bází - próba (vybere se z několika tisíc bází celého genu tak, aby se nepřekrývalo s jinými geny) ■ provede se extrakce RNA z buněk (krev, sliny, tumor,...) ■ přepíše se na cDNA, zmnoží pomocí PCR, přitom se biotinylují konce jednotlivých kopií oligoArrays (Affymetrix) ■ absolutní data ■ cca 20 prob reprezentuje každý gen, výsledné „rozhodnutí" je statistickým zhodnocením dané kombinace Genová exprese ■ hybridizace na čipu, promytí, fluorescenční označení biotinylovaných konců PCR fragmentů ■ „zviditelnění" přepisovaných genů - intenzita fluorescence v dané pozici je úměrná úrovni exprese genu reprezentovaného v dané pozici ■ korelace genové exprese s fyziologickými projevy umožňuje v konečné fázi identifikaci genů ■ využití pro identifikaci genů spojených s nemocemi ■ pomoc při kombinatorickém hledání vhodných léčiv pro „vypínání" nebo naopak „zapínání" genů cDNA arrays (Stanford) Experimental Cell O 0 vzorek barvený CySR (red) Kontrola barvená Cy3G (green) RcveíBQ transcription, ^^■"""^ Hijorescenfly labeled jSt with Cy3 (Graen) and Cy5 (Red) překryvový signál (oba kanály) Combine equal amount and hybridize onto microarray problémy sekundární struktury dlouhých cDNA prob není absolutní signál cDNA arrays ■ nehomogennost natištěné cDNA - lze porovnat pouze relativní úrovně exprese - poměrový signál ■ poměr závisí na volbě referentního materiálu - vysoká úroveň tedy nemusí znamenat vysoký poměr ■ nemusí dojít k identifikaci každého genu ■ změna úrovně exprese mezi kontrolou a vzorkem nemusí znamenat závěr o přítomnosti genu ■ ukázka části oblasti proby po hybridizaci (AFM, šířka obrázku je 2 um) Analýza genotypu ■ studium polymorfismu genomu (SNP, „single nucleotide polymorphism") - výskyt bodových mutací ■ porovnávání genových podobností mezi nositeli daného onemocnění ■ výhoda DNA čipů - současné sledování desítek tisíc různých SNP ■ analyzuje se DNA, po zmnožení PCR se fragmentuje ■ detekce hetero / homozygotů Hybridizační sekvenace ■ klasická metoda sekvenování DNA - značení a postupné prodlužování řetězce ■ vzorek se rozdělí do čtyř zkumavek, v každé z nich je jeden z nukleotidů značený (radioaktivně či fluorescenčně) ■ při prodloužení řetězce se vždy na konec umístí značená báze a další prodlužování se tím zastaví ■ získá se směs označených fragmentů, jejichž délka odpovídá pozici dané báze ■ po rozdělení (elfo na gelu, HPLC, CE) se ze čtyř drah A,G, C, T (nebo čtyř barev) sestaví výchozí sekvence ■ kapacita této metody je malá, navíc zdlouhavé Hybridizační sekvenace ■ využívá kombinatorické postupy ■ analyzovaná sekvence se nechá hybridizovat se souborem krátkých prób (6 až 20 bází), který obsahuje všechny možné kombinace dané délky sestavitelné ze 4 bází ■ podle toho, se kterými próbami analyzovaná DNA hybridizuje, se usuzuje na přítomnost známé krátké sekvence v jejím řetězci ■ pomocí překrů se dá zrekonstruovat celá analyzovaná sekvence □□□□□□□ □□□□□□□ □□□□□□□ □□□□□□□ □□□□□□□ □□□□□□□ křemíkový čip se souborem oligonukleotidových prób analyzovaná sekvence próby, se kterými probíhá hybridizace ■ úplný soubor sekvencí: ■ 6 bází... 65000 oligonukleotidů ■ 10 bází... přes 1 milion Sekvenace2 ■ fluorescenční obraz úplného souboru hexamerových prób hybridizovaného se sekvenovaným fragmentem DNA (51-mer) ■ šipky spojují pozice v souboru odpovídající perfektně komplemtárním duplexům ■ dole je pak výsledná sekvence a jí odpovídající sekvence 46 komplementárních hexamerů s vyznačeným překrýváním 9------ 19------ 29------ 39- 10------ 20------ 3fl------ 40. (Re)sekvenace na čipu ■ pomocí čipu se určí sekvence DNA ve vzorku a porovná se se známými sekvencemi v databázi (resekvenace) ■ na čipu je úplný soubor všech kombinatoricky možných sekvencí ■ próby se vždy vyskytují ve čtveřicích, např. proba W: W1 - ATCGGGTAAACT AAGGCTACTGCCT W2 - ATCGGGTAAACTCAAGGCTACTGCCT W3 - ATCGGGTAAACTGAAGGCTACTGCCT W4 - ATCGGGTAAACTTAAGGCTACTGCCT ■ další soubor prób (X) pak je posunut o jednu bázi: X1 - TCGGGTAAACTGAAGGCTACTGCCTC X2- TCGGGTAAACTG AGGCTACTGCCTC X3- TCGGGTAAACTG AGGCTACTGCCTC X4 - TCGGGTAAACTGTAGGCTACTGCCTC ■ takto se pokračuje pro celou sekvenci DNA=================1 23 4=========================== W_1_ X_2_ Y_3_ Z 4_ 24 T T TAT f. T. J Cl A r. C. C, J A ■ perfektně komplementární hybridizující pozice vymezují hledanou sekvenci Oblasti diagnostiky PNA Testy rodičovství / kriminalistika HLA komplex, oblast D-smyčky (mitochondriální DNA), délkový polymorfismus (VNTR místa) Onkogeny / supresorové geny c-myb, c-myc, c-abl, c-sis, c-ras, G-protein, jun, p53, retinoblastoma geny Dědičné choroby cystická fibrosa, hypercholesterolemie, srpkovitá anemie, Huntingtonova choroba, Duchenneova svalová dystrofie, p-Thalasemie, polycystická ledvinová choroba dospělých, hemochromatosie, hemophilie A / Von Willebrandova choroba 25 Aplikace diagnostiky DNA Viry cytomegalovirus, papilloma viry, rotaviry (RNA), virus lidské imunodeficience (HIV), virus leukemických t-lymfocytů Bakterie Mycobacterium tuberculosis, Gonorrhea (RNA nebo DNA), Mycoplasma pneumoniae (RNA), Chlamydia, Escherichia coli (RNA), Bacillus subtilis (RNA), Bacillus burgdorferi Databáze informací •ArrayExpress - A public repository for microarray based gene expression data maintained by European Bioinformatics Institute. •ChipDB - A searchable database of gene expression •Gene Expression Atlas - A database for gene expression profile from 91 normal human and mouse samples across a diverse array of tissues, organs, and cell lines. •Gene Expression Database (GXP) - A database of Mouse Genome Informatics at the Jackson laboratory. •Gene Expression Omnibus - A database in NCBI for supporting the public use and disseminating of gene expression data. •MUSC DNA Microarray Database - MUSC DNA Microarray Database is a web-accessible archive of DNA microarray data. •NASCArrays - a repository for Affymetrix data generated by NASC's transcriptomics service. •Public Expression Profiling Resource (PEPR) - A web oracle data warehouse of quality control and standard operating procedure (QC/SOP) Affymetrix data. Reference. Komerční systémy •Affymetrix •Qiagen •Amersham Biosciences •MWG Biotech •Rosetta (Merck) •Agilent •Clontech, BD Biosci. •UHN MAC (Ontario) •Incyte Gene Album •Genomictree oligo arrays oligo arrays oligo arrays oligo arrays oligo arrays cDNA a oligo arrays cDNA arrays cDNA arrays cDNA arrays cDNA arrays Současný stav ■ problémem je analýza dat, nikoliv jejich získávání ■ k dispozici je řada microarray databází, software pro analýzu je veřejně přístupný ■ z důvodu výskytu chyb a šumu je typicky ze stovek rozdílně exprimovaných genů pouze několik úspěšně validováno ■ existuje velmi dobrá reprodukovatelnost měření na dané platformě, pokud jsou experimenty prováděny v téže laboratoři ■ interlaboratorní srovnání v rámci platformy jsou horší ■ srovnání dat mezi měřícími platformami obvykle schází nebo si výsledky příliš neodpovídají