1 ElektrochemickElektrochemickéé ppřřevodnevodnííkyky eelektrochemicklektrochemickýý mměřěřííccíí systsystéémm tvotvořříí nejmnejméénněě dvdvěě elektrodyelektrody -- pracovnpracovníí (m(měřěřííccíí) a) a referentnreferentníí imobilizacimobilizacíí biorekognibiorekogniččnníí vrstvy vznikvrstvy vznikáá bioelektrodabioelektroda, nej, nejččastastěěji se jednji se jednáá oo enzymovou elektroduenzymovou elektrodu potenciometrickpotenciometrickéé biosensorybiosensory amperometrickamperometrickéé biosensorybiosensory konduktometrickkonduktometrickéé biosensorybiosensory PracovnPracovníí elektrodyelektrody propro biosensorybiosensory zahrnujzahrnujíí velmivelmi šširokouirokou šškkáálu materilu materiáállůů i konfiguraci konfiguracíí: u: uššlechtillechtiléé kovy (kovy (PtPt, Au), skelný, Au), skelný uhluhlíík, grafit a nejrk, grafit a nejrůůznzněějjšíší kompozitnkompozitníí smsměěsi, vodivsi, vodivéé polymerypolymery a organicka organickéé vodivvodivéé soli.soli. Rozsah pracovnRozsah pracovníího potenciho potenciáálu je tlu je třřeba volit tak, aby nedoeba volit tak, aby nedoššlolo k elektrochemickk elektrochemickéému rozkladu materimu rozkladu materiáálu elektrody nebo klu elektrody nebo k interfereninterferenččnníím reakcm reakcíím (rozklad vody nebo jiných slom (rozklad vody nebo jiných složžekek pracovnpracovníího roztoku, redukce rozpuho roztoku, redukce rozpuššttěěnnéého kyslho kyslííku).ku). DDůůleležžititáá je pje přřííprava povrchu elektrody pprava povrchu elektrody přřed vlastned vlastníímm mměřěřeneníím nebo imobilizacm nebo imobilizacíí biomolekulbiomolekul. Prov. Provááddíí se lese leššttěěnníí povrchu brusnými prpovrchu brusnými prášášky (ky (diamandiaman--tovýtový nebo oxid hlinitý),nebo oxid hlinitý), nnáásleduje oplsleduje oplááchnutchnutíí a pa přříípadnpadněě ozvuozvuččeneníí ultrazvukem.ultrazvukem. NNěěkdy je tkdy je třřeba odeba od--stranit povrchovstranit povrchovéé neneččistoty (oxidy kovistoty (oxidy kovůů)) bubuďď pomocpomocíí kyselin nebokyselin nebo anodizacanodizacíí.. PomocnPomocnéé elektrodyelektrody musmusíí být tvobýt tvořřeny dobreny dobréého vodiho vodičče se s dostatedostateččnou plochou a elektrochemicky neaktivnnou plochou a elektrochemicky neaktivníí. Pou. Použžíívváá se platina (drse platina (dráátek, pltek, plíšíšku, sku, sííťťka), uhlka), uhlííkovkováá tytyččinka, mnohdyinka, mnohdy stastaččíí i nerezový dri nerezový dráátt.. 2 ReferentnReferentníí elektrodyelektrody slousloužžíí jako srovnjako srovnáávacvacíí bodbod kk mměřěřeneníí nebonebo nastavnastaveenníí potencipotenciáálu pracovnlu pracovníích elektrod. Jejich potencich elektrod. Jejich potenciáál je pl je přřesnesněě definovaný a pokud modefinovaný a pokud možžnono ččasovasověě ststáálý.lý. Typ Zkratka ENHE (V) ESCE (V) Normální vodíková elektroda Pt, H2 (1 atm) | H + (a=1) NHE 0 0.2412 SCE 0.2412 0 NCE 0.2801 0.0389 Kalomelové elektrody Hg | Hg2Cl2 | KCl (. . .) nasycená (sat.) normální (1 M) nasycená NaCl (sat.) SSCE 0.2360 0.0052 0.197 -0.045 0.2042 0.037 0.2362 -0.005 Argentchloridové elektrody Ag | AgCl | KCl (. . .) nasycená (sat.) (3 M) normální (1 M) Ag | AgCl | LiCl (sat. v EtOH) 0.140 -0.101 Merkurosulfátová elektroda Hg | HgSO4 | K2O4 (sat.) 0.655 0.414 ReferentnReferentníí elektrodyelektrody MiniaturnMiniaturníí AgAg//AgClAgCl 3 PotenciometrickPotenciometrickéé bioelektrodybioelektrody zzááklademkladem potenciometriepotenciometrie je zmje změěnana potencipotenciáálu vyvolanlu vyvolanáá akumulacakumulacíí nnááboje na rozhranboje na rozhraníí elektrodyelektrody ss roztokemroztokemA - A - A - A - K + K + ppřřevodnevodnííkem je iontovkem je iontověě selektivnselektivníí elektroda (ISE) v kombinacielektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou. Rozsah ms enzymovou vrstvou. Rozsah měřěřitelných koncentracitelných koncentracíí je dje dáánn ISE: 10ISE: 10 µµM aM ažž 0.10.1 M, pro koneM, pro koneččnnéé biosensory typicky 0.1 abiosensory typicky 0.1 ažž 10 mM, odezva je logaritmick10 mM, odezva je logaritmickáá. M. Měřěříí se potencise potenciáál pracovnl pracovníí elektrody proti referentnelektrody proti referentníí elektrodelektroděě -- ta musta musíí být kvalitnbýt kvalitníí ((ččasovasověě ststáálláá), p), přřitom vitom v systsystéému netemu netečče proude proud -- je tje třřeba meba měřěřííccíí ppřříístroj sstroj s velkým vstupnvelkým vstupníím odporem (operam odporem (operaččnníí zesilovazesilovačč).). PotenciometrickPotenciometrickéé enzymovenzymovéé elektrodyelektrody )+ln(+= / 0 yz jiji aka zF RT EE PotenciPotenciáál ISE pro sledovaný iont (aktivita al ISE pro sledovaný iont (aktivita aii) v p) v přříítomnostitomnosti ruruššivivéého iontu (aktivita aho iontu (aktivita ajj)) sklenskleněěnnáá elektrodaelektroda -- H+H+ -- mměřěřeneníí pH, bpH, běžěžnněě dostupndostupnáá pevnpevnéé ISE (solid state)ISE (solid state) -- tenktenkáá vrstva iontovvrstva iontovéého vodiho vodičče:e: monokrystal nebo smmonokrystal nebo směěs krystals krystalůů, precipit, precipitáát; homogennt; homogenníí nebo heterogennnebo heterogenníí (mnohon(mnohonáásobnsobněě levnlevněějjšíší, vlastn, vlastníí materimateriááll dispergovdispergováán v inertnn v inertníí matrici (PVC, silikon, ...)matrici (PVC, silikon, ...) na bna báázi oxidzi oxidůů kovkovůů pro mpro měřěřeneníí pH:pH: MMxxOOyy + 2y(e+ 2y(e-- + H+ H++)) ——————→→ xM + yHxM + yH22OO nebo dva oxidanebo dva oxidaččnníí stavy:stavy: 2MO2MOyy + 2H+ 2H++ +2e+2e-- ——————→→ (2y(2y--1)M1)M22O + HO + H22OO antimonovantimonováá elektroda Sb/Sbelektroda Sb/Sb22OO33,, ddáále Ir/le Ir/IrOIrO22 nebonebo Pd/Pd/PdOPdO22 4 ISEISE ukukáázkazka pHpH, NH, NH33 a COa CO22 ISEISE CryturCrytur PPřřííklady potenciometrickýchklady potenciometrických enzymových elektrodenzymových elektrod pHpH : penicilin (: penicilin (penicilinpenicilinasasaa),), acetylcholinacetylcholin ((cholinestercholinesterasasaa),), esteresterasasy, nukleovy, nukleovéé kyseliny (nuklekyseliny (nukleasasy)y) NHNH33 / NH/ NH44 ++ : mo: moččovina (ureovina (ureasasa), aminokyseliny (oxidaa), aminokyseliny (oxidaččnníí deaminacedeaminace -- glutamglutamáátt DH,DH, oxidoxidasasaa LL-- // DD--aminoaminokkyselin;yselin; αα,,γγ-- eliminace amoniakueliminace amoniaku –– LL--methioninmethionin γγ--lylyáázaza), nitr), nitráát a nitritt a nitrit (bakterie)(bakterie) COCO22 : mo: moččovina (ureovina (ureasasa), aminokyseliny (lysina), aminokyseliny (lysin dekarboxyldekarboxylasasaa,, tyrosintyrosin dekarboxyldekarboxylasasaa), lakt), laktáát (laktt (laktáátt monooxygenmonooxygenasasaa -- dekarboxylujdekarboxylujííccíí oxidoxidasasaa)) II-- : potenciometrick: potenciometrickáá detekce peroxidu voddetekce peroxidu vodííku v pku v přříítomnostitomnosti peroxidperoxidasasyy FF-- : peroxid vod: peroxid vodííku (ku (peroxidperoxidasasaa -- oxidaceoxidace fluorofenolufluorofenolu)) CNCN-- :: amygdalinamygdalin ((ββ--glukosidglukosidasasaa)) 5 PolovodiPolovodiččovovéé sensorysensory výhodou jsou miniaturnvýhodou jsou miniaturníí rozmrozměěry, masovry, masováá produkce a tudprodukce a tudíížž nníízkzkáá cena vecena ve srovnsrovnáánníí s klasickými ISE.s klasickými ISE. zzáákladnkladníím konstrukm konstrukččnníím materim materiáálem je klem je křřememíík. Jeho vodivost je velmi nk. Jeho vodivost je velmi níízkzkáá,, avavššak pak přříídavkem vhodných stopových pdavkem vhodných stopových přříímměěssíí lze jeho vodivost zvýlze jeho vodivost zvýššitit -- zzíískskáá sese polovodipolovodičč. Podm. Podmíínkou vodivosti je monkou vodivosti je možžnost volnnost volnéého pohybuho pohybu elektronelektronůů.. u ku křřememííku je zku je záákladnkladníí valenvalenččnníí hladina Ehladina EVV plnplněě obsazena, ale elektrony se naobsazena, ale elektrony se na nníí nemohou pohybovat. Na vodivostnnemohou pohybovat. Na vodivostníí hladinhladiněě EECC je mje míísto pro pohyb, alesto pro pohyb, ale nejsou zde elektrony. Kineticknejsou zde elektrony. Kinetickáá energie elektronenergie elektronůů na Ena EVV je za bje za běžěžnýchných podmpodmíínek kolem 0.04 eV, taknek kolem 0.04 eV, takžže nemohou pe nemohou přřeskoeskoččit na vodivostnit na vodivostníí hladinu Ehladinu ECC 1.1 eV1.1 eV EECC EEVV EnergetickEnergetickéé hladiny elektronhladiny elektronůů uu ččististéého kho křřememííku (nevodivý)ku (nevodivý) ZZvývýššeneníí vodivosti se dosvodivosti se dosááhne dopovhne dopováánníímm -- ppřříídavkem atomdavkem atomůů zz V. (P, As, negativnV. (P, As, negativníí -- n) nebo ze III. (B,n) nebo ze III. (B, AlAl, pozitivn, pozitivníí -- p)p) skupiny periodickskupiny periodickéé tabulky. Tak ptabulky. Tak přři ni n dopovdopováánníí se vytvose vytvořříí donorovdonorováá hladina elektronhladina elektronůů EEDD ttěěsnsněě podpod vodivostnvodivostníí hladinou,hladinou, taktakžže pe přřenos elektronenos elektronůů zz EEDD na Ena ECC je snadný. Opaje snadný. Opaččnněě ppůůsobsobíí ppřřididáánníí atomatomůů ss volnými pozice elektronvolnými pozice elektronůů (d(dííry, pozitivnry, pozitivníí dopovdopováánníí), vytvo), vytvořříí se takse tak akceptorovakceptorováá hladina Ehladina EAA.. EECC EEVV EnergetickEnergetickéé hladiny elektronhladiny elektronůů po ppo přřididáánníí ppřříímměěssíí ee-- ee-- EEDD EEAA UU polovodipolovodiččových materiových materiáállůů se pak hladina, na kterse pak hladina, na kteréé jeje pravdpravděěpodobnost obsazenpodobnost obsazeníí elektrony 50%elektrony 50%,, nazývnazýváá FermihoFermiho (E(EFF). Nach). Nacháázzíí se mezi Ese mezi EVV a Ea ECC, jej, jejíí poloha odpovpoloha odpovííddáá mnomnožžstvstvíí dopujdopujííccíích atomch atomůů.. 6 ISFETISFET ionion--sensitivesensitive fieldfield effecteffect transistortransistor N-NG gate S source D drain Křemík Pizolace - epoxypryskyřice R e f Membrána SiO2 SchSchééma zapojenma zapojeníí ISFETuISFETu VVGG VVDD OOdpor mezi S (dpor mezi S (sourcesource) a D () a D (draindrain) se zm) se změěnníí, kdy, kdyžž se na hradlose na hradlo G (G (gategate) p) přřivede napivede napěěttíí (zm(změěnníí sese elektrickelektrickéé polepole). Povrch). Povrch ISFETuISFETu mimo Smimo S a D je poa D je pokrytkryt oxidem koxidem křřemiemiččitým, oblast hradlaitým, oblast hradla GG ((gategate) je pota) je potažžena selektivnena selektivníí membrmembráánou, kternou, kteráá je vje v kontaktukontaktu ss okolnokolníím roztokem; ostatnm roztokem; ostatníí ččáásti jsou izolovsti jsou izolováányny epoxypryskyepoxypryskyřřicicíí. Potenci. Potenciáál hradla se url hradla se urččuje vzhledemuje vzhledem kk referentnreferentníí elektrodelektroděě.. JakoJako iontoviontověě--selektivnselektivníí membrmembráányny lze poulze použžíítt řřadu materiadu materiáállůů.. NejbNejběžěžnněějjšíší jsoujsou solidsolid--statestate membrmembráány pro sledovny pro sledováánníí zmzměěnn pHpH,, materimateriáál Sil Si33NN44, Al, Al22OO33, Ta, Ta22OO55. Odezva t. Odezva těěchtochto ISFETISFETůů jeje logaritmicklogaritmickáá (52(52--5959 mVmV//pHpH), masov), masováá produkceprodukce vede k nvede k níízkzkéé cenceněě.. PolymernPolymerníí membrmembráány mohou býtny mohou být napnapřř.. valinomycinvalinomycin/PVC/PVC pro stanovenpro stanoveníí drasldraslííku.ku. HeterogennHeterogenníí membrmembráány tvony tvořříí AgClAgCl,, AgIAgI,, AgCNAgCN krystalky vkrystalky v PNF (PNF (polyfluorovanýpolyfluorovaný fosfazinfosfazin). P). Přři výrobi výroběě ISFETISFETůů se pouse použžíívváá litografielitografie -- postupnpostupnéé nannanášášeneníí jednotlivýchjednotlivých vrstev, vytvvrstev, vytváářřeneníí struktury pomocstruktury pomocíí masek.masek. 7 ISFETISFET –– ukukáázkazka LAPSLAPS biosensorybiosensory Tento polovodiTento polovodiččový pový přřevodnevodníík je konstrukk je konstrukččnněě jednodujednoduššíšší nenežž ISFETyISFETy, nav, navííc je moc je možžnnéé ppřřipojenipojeníí kontaktkontaktůů ze stranyze strany kterkteráá nenneníí v kontaktu s roztokem.v kontaktu s roztokem. ZZáákladem je kkladem je křřememííkovýkový ččip potaip potažžený vrstvami oxiduený vrstvami oxidu kkřřemiemiččititéého a nitridu kho a nitridu křřememííku. Navku. Navííc je na povrchuc je na povrchu rozdrozděělen na nlen na něěkolik aktivnkolik aktivníích oblastch oblastíí pomocpomocíí daldalšíší vrstvyvrstvy SiOSiO22. Celý. Celý ččip mip máá pouze jeden kontakt.pouze jeden kontakt. V neosvV neosvěětlentlenéém stavu jem stavu je sensorsensor neaktivnneaktivníí. Pokud se z. Pokud se z druhdruhéé strany osvstrany osvěětltlíí (infra(infraččervenervenáá LED, pLED, přři 940i 940 nmnm pronikne svpronikne svěětlo do ktlo do křřememííku 50ku 50 nmnm hluboko), dojde khluboko), dojde k loklokáálnlníí aktivaci a zaktivaci a zíískskáá se signse signáál odpovl odpovíídajdajííccíí zmzměěnnáámm pHpH v aktivovanv aktivovanéé ((„„adresovanadresované”é”) z) zóónněě.. Výhodou je jednoduchVýhodou je jednoducháá momožžnost vnost víícekancekanáálovlovéého mho měřěřeneníí.. 8 LAPSLAPS potenciostat LAPS struLAPS strukturaktura pracovnpracovníí roztok seroztok se substrsubstráátemtem biomembrbiomembráánana VýmVýměěnnýnný ppááskový sensorskový sensor s biovrstvous biovrstvou ppřříítlaktlak LEDLEDky proky pro ““adresadresovováánníí”” LAPS biosensor ThresholdLAPS biosensor Threshold „light addressable potentiometric sensor“ referenreferenččnníí aa pomocnpomocnáá electrodelectrodaa CytosensorCytosensor CytosensorCytosensor microphysiometermicrophysiometer ((MolecularMolecular DevicesDevices) se pou) se použžíívváá pro testovpro testováánníí toxicitytoxicity nebo fyziologickýchnebo fyziologických úúččinkinkůů llééččiv. Doiv. Do komkomůůrek se imobilizujrek se imobilizujíí bubuňňky (bakteriky (bakteriáálnlníí nebo tknebo tkááňňovováá kulturakultura -- fibroblastyfibroblasty,, keratinocytykeratinocyty, rakovinn, rakovinnéé bubuňňky, 10ky, 1044 aažž 101066 ).). PPřři mi míírnrnéém prm průůtokutoku mmééddííaa sese ččáást bunst buněěkk zachytzachytíí na povrch a v pna povrch a v přříítomnostitomnosti substrsubstráátu vyvoltu vyvoláávajvajíí ururččitou zmitou změěnunu pHpH,, kterkteráá jeje úúmměěrnrnáá metabolickmetabolickéé aktivitaktivitěě;; napnapřř. respirac. respiracíí glukglukóózy vznikzy vznikáá kyselinakyselina mlmlééččnnáá a oxid uhlia oxid uhliččitý.itý. Po pPo přříídavku testovandavku testovanéé lláátky se paktky se pak zaznamenzaznamenáá odezva jakoodezva jako ččasovasováá zmzměěnana dpHdpH//dtdt. Na konci pokusu se rychlým. Na konci pokusu se rychlým prprůůtokem butokem buňňky z komky z komůůrek vyplrek vyplááchnou achnou a lze zalze začčíít dalt dalšíší cyklus.cyklus. VhodnVhodnéé úúččinek rinek růůstových regulstových reguláátortorůů,, hormonhormonůů,, lymfokinlymfokinůů, vir, virůů nebonebo virostatikvirostatik.. křemík (P nebo N) ( 9 AmperometrickAmperometrickéé sensorysensory jsou zalojsou založženy na heterogenneny na heterogenníím pm přřenosu elektronenosu elektronůů mezi elektrodou amezi elektrodou a redoxnredoxníímm ppáárem molekulrem molekul poskytujposkytujíí jako signjako signáál proud, který jel proud, který je úúmměěrnýrný koncentracikoncentraci analytuanalytu. Proud I se obvykle m. Proud I se obvykle měřěříí ppřřii konstantnkonstantníím napm napěěttíí (potenci(potenciáál E) pracovnl E) pracovníí elektrodyelektrody velikost proudu provelikost proudu proššlláá za danýza daný ččas t v systas t v systéémumu ududáávváá nnááboj Q, který odpovboj Q, který odpovííddáá molmoláárnrníímumu mnomnožžstvstvíí lláátky ptky přřememěěnněěnnéé na elektrodna elektrodáách:ch: Q = I t = n F m /Q = I t = n F m / MMrr F = 96487 C/mol znaF = 96487 C/mol značčíí FaradayovuFaradayovu konstantukonstantu k elektrochemickk elektrochemickéé oxidaci loxidaci láátek dochtek docháázzíí na anodna anoděě (I > 0), reduk(I > 0), redukččnníí dděěje (I < 0) probje (I < 0) probííhajhajíí na katodna katoděě.. smsměěr proudu je totor proudu je totožžný se smný se směěrem tokurem toku pozitivnpozitivníích ekvivalentch ekvivalentůů (n(náábojbojůů)) Xred Xox eAmperometrickAmperometrickéé mměřěřeneníí je moje možžnnéé provprováádděět v dvout v dvou-- nebo tnebo třřííelektrodovelektrodovéém uspom uspořřááddáánníí;; pro prvnpro prvníí systsystéém se napm se napěěttíí na pracovnna pracovníí elektrodelektroděě W (W (workingworking) nastavuje) nastavuje proti pomocnproti pomocnéé elektrodelektroděě A (A (auxiliaryauxiliary, resp., resp. countercounter)) v tv třřííelektrodovelektrodovéém uspom uspořřááddáánníí se navse navííc pouc použžije referenije referenččnníí elektroda R,elektroda R, vvůčůči kteri kteréé se nastavuje potencise nastavuje potenciáál pracovnl pracovníí AA VV - + AA VV - + Aux Work Ref 22--E 3E 3--EE 10 PotenciostatPotenciostat je zaje zařříízenzeníí, kter, kteréé udrudržžuje konstantnuje konstantníí potencipotenciáál pracovnl pracovníí elektrody velektrody vůčůčii referentnreferentníí neznezáávisle na prochvisle na procháázejzejííccíím proudum proudu _ + _ + _ + _ + UUoutout = R= RMMII rozsahrozsah -- RRMM II UUinin PPřřííklad konstrukceklad konstrukce potenciostatupotenciostatu zpracovzpracováánníí mměřěřených signených signáállůů lze provlze prováádděět pomoct pomocíí zapisovazapisovačče, nebo le, nebo léépepe poupoužžititíím pom poččíítatačče vybavene vybavenéého analogovho analogověě--digitdigitáálnlníím pm přřevodnevodnííkem (A/D);kem (A/D); pomocpomocíí digitdigitáálnlněě--analogovanalogovéého pho přřevodnevodnííku (D/A) lzeku (D/A) lze řříídit pracovndit pracovníí napnapěěttíí.. PotenciostatPotenciostat modernmoderníí digitdigitáálnlníí konstrukcekonstrukce -- analogový obvodanalogový obvod řříízený A/Dzený A/D (sb(sběěr dat) a D/A (nastavenr dat) a D/A (nastaveníí excitaexcitaččnníího potenciho potenciáálu)lu) ppřřevodnevodnííkyky obr.obr. -- mikroprocesoremmikroprocesorem řříízený osmikanzený osmikanáálový potenciostat, výstup dat nalový potenciostat, výstup dat na externexterníí popoččíítatačč ppřřes RS232 rozhranes RS232 rozhraníí POTENCIOSTAT POČÍTAČ W R A A/DD/A Měřící uspořádání 11 MMěřěřííccíí technikytechniky dledle ččasovasovéého prho průůbběěhuhu potencipotenciáálu na pracovnlu na pracovníí elektrodelektroděě nejjednodunejjednoduššíšší jeje amperometrieamperometrie chronoamperometriechronoamperometrie umoumožňžňuje zuje zíískat informace oskat informace o ppřřechodných elektrodovýchechodných elektrodových jevech po skokovjevech po skokovéé zmzměěnněě potencipotenciáálulu pulsnpulsníí amperometrieamperometrie zvyzvyššujeuje podpodííl signl signáálu vlu vůčůčii ššumuumu linelineáárnrníí a zejma zejmééna cyklickna cyklickáá voltametrievoltametrie majmajíí ddůůleležžitouitou úúlohu plohu přři vývojii vývoji amperometrickýchamperometrických biosensorbiosensorůů pulsnpulsníí voltametrickvoltametrickéé technikytechniky jijižž vyvyžžadujadujíí pompoměěrnrněě drahdrahéé ppřříístrojovstrojovéé vybavenvybaveníí, i kdy, i kdyžž potpotřřebnebnéé pulsy lze relativnpulsy lze relativněě snadno generovat pomocsnadno generovat pomocíí popoččíítatačče s D/A pe s D/A přřevodnevodnííkem.kem. čas E Amperometrie chronoamp. pulsní Voltametrie lineární cyklická normální square diferenciální pulsní wave pulsní Techniky založené na měření proudu ElektrochemickElektrochemickéé mměřěřííccíí zazařříízenzeníí „„laboratornlaboratorníí verzeverze““ enzymovenzymováá elektrodaelektroda v mv mííchanchanéé nnáádobcedobce potenciostat s LCD apotenciostat s LCD a zapisovazapisovaččemem jednojednoúúččelový systelový systéémm v biochemickv biochemickéémm praktikupraktiku 12 AnalyzAnalyzáátorytory MetrohmMetrohm PolarecordPolarecord EGG PAR 173EGG PAR 173 EGG PAR 263EGG PAR 263 AutolabAutolab AmperometrickAmperometrickéé detektorydetektory ABD (ABD (UniversalUniversal SensorsSensors)) ADLC2 (ADLC2 (LabLab. P. Přříístroje)stroje) 13 RuRuččnníí systsystéémymy PalmSensPalmSens UnivUniv. Florence. Florence MEBMEB (MU)(MU) iStatiStat KapesnKapesníí systsystéémymy spolehlivost a robustnostspolehlivost a robustnost velmi jednoduchvelmi jednoduchéé ovlovlááddáánníí 14 KonektoryKonektory…… opravdu ropravdu růůznorodznorodéé MMěřěřeneníí kyslkyslííku a Hku a H22OO22 ClarkClarkůůvv sensorsensor Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCl elektroda elektrolyt membrána propustná pro O2 ElektrodovElektrodováá redukce kyslredukce kyslííku (ku (--750 mV) je750 mV) je ččtytyřřelektronový proces:elektronový proces: OO22 + 2 H+ 2 H22O + 2 eO + 2 e-- HH22OO22 + 2 OH+ 2 OH-- HH22OO22 + 2 e+ 2 e-- 2 OH2 OH-- ElektrodovElektrodováá oxidace peroxidu vodoxidace peroxidu vodííku (ku (>> 6600 m00 mVV):): 2 H2 H22OO22 2 H2 H22O + OO + O22 + 2 e+ 2 e-- + 2 H+ 2 H++ Velkou výhodou tohoto sensoru jeVelkou výhodou tohoto sensoru je prakticky absolutnprakticky absolutníí specifita pouze kespecifita pouze ke kyslkyslííkuku -- ruruššivivéé lláátky nemohou projtky nemohou projíítt ppřřededřřazenou membrazenou membráánou.nou. Konstrukce elektrody pro stanovenKonstrukce elektrody pro stanoveníí peroxidu vodperoxidu vodííkuku je podobnje podobnáá kyslkyslííkovkovéé ss ttíím rozdm rozdíílem,lem, žže nene neníí poupoužžitaita plynopropustnplynopropustnáá membmembáána a pouna a použžíívváá se pozitivnse pozitivníí polarizacepolarizace,, ppřři kteri kteréé nastnastáávváá anodickanodickáá oxidaoxidacce peroxidue peroxidu 15 KyslKyslííkovkováá elektrodaelektroda EnzymovEnzymovéé elektrody selektrody s oxidasamioxidasami tyto enzymy oxidujtyto enzymy oxidujíí molekulu substrmolekulu substráátu (tu (analytuanalytu) za) za úúččastiasti kyslkyslííku, pku, přřitom vznikitom vznikáá bubuďď peroxid vodperoxid vodííku nebo voda:ku nebo voda: substrsubstráát +t + OO22 produkt +produkt + HH22OO22 substrsubstráát +t + OO22 produkt + Hprodukt + H22OO detekce peroxidu je obecndetekce peroxidu je obecněě citlivcitlivěějjšíší (nulov(nulováá výchozvýchozíí hladina)hladina) čas Proud O2 analyt H2O2 0 Rozsahy detektoru oxidace peroxidu vodoxidace peroxidu vodííku jeku je spojenspojenáá s nebezpes nebezpeččíím interferencem interference ze strany jiných oxidabilnze strany jiných oxidabilníích lch láátek,tek, napnapřř. v s. v sééru mohou vadit kyselinyru mohou vadit kyseliny askorbovaskorbováá a moa moččovováá ččii paracetamolparacetamol specifita se dspecifita se dáá zlepzlepššit pit přřededřřazenazeníímm kontrolnkontrolníí membrmembráány, kterny, kteráá omezomezíí ppřříístup interferujstup interferujííccíích lch láátektek 16 PPřřehledehled oxidasoxidas Substrát oxidasy Zkratka EC číslo koenzym H2O2 Alkohol AOD 1.1.3.13 FAD ano L-Aminokyseliny 1.4.3.2 FAD ano D-Aminokyseliny 1.4.3.3 FAD ano Askorbát 1.10.3.3 Cu ne Bilirubin BRO 1.3.3.5 ne Diaminy DAO 1.4.3.6 Cu ano Fenol (Tyrosinasa) 1.14.18.1 Cu ne Galaktosa 1.1.3.9 Cu ano Glukosa GOD 1.1.3.4 FAD ano L-Glutamát 1.4.3.11 FAD ano Cholin 1.1.3.17 FAD ano Cholesterol COD 1.1.3.6 FAD ano p-difenoly (Lakasa) 1.10.3.2 Cu ne L-Laktát LOD 1.1.3.2 FAD ano L-Laktát (dekarb.) LMO 1.13.12.4 FMN ne L-Lyzin 1.4.3.14 ano Monoaminy MAO 1.4.3.4 FAD ano NADH ano Oxalát 1.2.3.4 Fp ano Pyruvát 1.2.3.3 FAD ano Sulfit 1.8.3.1 Mo ano Urát(Urikasa) 1.7.3.3 Cu ano Xanthin XOD 1.1.3.22 Mo ano EnzymovEnzymovéé elektrody selektrody s dehydrogenasamidehydrogenasami nejvnejvěěttšíší skupinouskupinou oxidoreduktasoxidoreduktas jsoujsou dehydrogenasydehydrogenasy (existuje p(existuje přřes 250es 250 NADNAD++ a 150 NADPa 150 NADP++ dependentndependentnííchch enzymenzymůů), analyticky významn), analyticky významnéé druhy jsou shrnuty v tabulcedruhy jsou shrnuty v tabulce katalyzujkatalyzujííccíí redoxnredoxníí reakce sreakce s úúččastastíí NAD(P)NAD(P)++ / NAD(P)H:/ NAD(P)H: Substrát Zkratka EC číslo Alkohol ADH 1.1.1.1 3-Hydroxybutyrát 3-HBDH 1.1.1.30 Aldehyd AlDH 1.2.1.5 3-Hydroxysteroid 3-HSDH 1.1.1.50 Alanin Ala-DH 1.4.1.1 Isocitrát ICDH 1.1.1.42 Formiát FDH 1.2.1.2 Inositol IDH 1.1.1.18 Galaktosa Gal-DH 1.1.1.48 L-Laktát L-LDH 1.1.1.27 Glycerol Gly-DH 1.1.1.6 D-Laktát D-LDH 1.1.1.28 Glukosa GDH 1.1.1.47 L-Leucin L-LeDH 1.4.1.9 Glukosa-6-fosfát G6P-DH 1.1.1.49 L-Malát L-MDH 1.1.1.37 Glutamát GlDH 1.4.1.3 Sorbitol SDH 1.1.1.14 PPřřehledehled dehydrogenasdehydrogenas 17 Detekce NAD(P)HDetekce NAD(P)H elektrochemickelektrochemickáá detekce NADH jedetekce NADH je momožžnnáá amperometrickouamperometrickou reoxidacreoxidacíí vznikajvznikajííccíího NADH (Eho NADH (E°° --560560 mVmV/SCE);/SCE); ppřříímmáá oxidace vyoxidace vyžžaduje vysokýaduje vysoký potencipotenciáál (pl (přřes 1 V na uhles 1 V na uhlííku), nastku), nastáávváá dimerizacedimerizace a adsorpce produkta adsorpce produktůů nana povrch elektrodypovrch elektrody reoxidacereoxidace se mse můžůže prove provéést lst léépepe prostprostřřednictvednictvíím modifikujm modifikujííccíích lch láátek (Etek (E°° --200 a200 ažž --5050 mVmV) v) váázaných na povrchuzaných na povrchu elektrodyelektrody nejnejččastastěěji se pouji se použžíívajvajíí fenazinyfenaziny,, fenoxazinyfenoxaziny aa fenothiazinyfenothiaziny, oxidace, oxidace nastnastáávváá jijižž kolem 0 V/SCEkolem 0 V/SCE lze ulze užžíít takt takéé hexakyanohexakyanožželezitanelezitan nebonebo TTF.TCNQTTF.TCNQ prprůůbběěh reakce je homogennh reakce je homogenníí -- vznikvznikáá chargecharge transfer komplex CT, potransfer komplex CT, po rozpadu je pakrozpadu je pak reoxidovreoxidováánn medimediáátortor,, ppřřitom E > Eitom E > E°° lze pracovat plze pracovat přři nii nižžšíším potencim potenciáálulu N + N CH3 O N H2N N + R2 S NH3C XHN N+ Me2 CH3OSO3 PMS Fenazin methosulfát R: methyl Meldola Blue R: ethyl Nile Blue X: H Toluidine Blue O X: naphthoyl Naphthoyltoluidine Blue O Mox + NADH CT CT Mred + NAD+ Mred Mox + 2 e+ n + PPřřenos elektronenos elektronůů zz biomolekulbiomolekul PPřříímý pmý přřenos elektronenos elektronůů ppro konstrukciro konstrukci biosensorbiosensorůů je tento proces atraktivnje tento proces atraktivníí -- zjednoduzjednoduššilil byby konstrukkonstrukci;ci; bbohuohužžel, pel, přříímýmý ppřřenos elektronenos elektronůů zz biomolekulbiomolekul nna elektroda elektrodyy byl pozorovbyl pozorováánn uu malmalýchých redoxnredoxnííchch bbíílkovinlkovin ((cytochromcytochromyy cc aa bb,, azurinazurin,, ferredoxinferredoxin) a) a nněěkterkterýchých enzymenzymůů ((laklakáázaza,, peroxidperoxidáázaza).). substrsubstráátt EEoxox ee-- produktprodukt EEredred PPřříímý reversibilnmý reversibilníí ppřřenos elektronenos elektronůů z biomolekuly (bz biomolekuly (bíílkovina, nukleovlkovina, nukleováá kyselina) je obvykle ztkyselina) je obvykle ztíížženen řřadou faktoradou faktorůů. V b. V bíílkovinlkovináách se sicech se sice vyskytuje celvyskytuje celáá řřada redoxnada redoxněě aktivnaktivníích skupin (disulfidickch skupin (disulfidickéé mmůůstky, Festky, Fe--SS skupiny, flaviny, hem,skupiny, flaviny, hem, řřada iontada iontůů kovkovůů), ale nach), ale nacháázzíí se obvykle uvnitse obvykle uvnitřř molekuly. Kontakt redoxnmolekuly. Kontakt redoxníí skupiny s povrchem elektrody je moskupiny s povrchem elektrody je možžnýný pouze pro urpouze pro urččitým zpitým způůsobem orientovansobem orientovanéé molekuly, comolekuly, coýý výraznvýrazněě snisnižžujeuje proudovproudovéé odezvy. Velikost molekuly zase vede k velmi pomalodezvy. Velikost molekuly zase vede k velmi pomaléé difdifúúzi.zi. NavNavííc se biomolekulyc se biomolekuly ččasto adsorbujasto adsorbujíí pevnpevněě na povrch elektrod ana povrch elektrod a dochdocháázzíí ttíím soum souččasnasněě k jejich denaturaci.k jejich denaturaci. 18 PPřřenos elektronenos elektronůů zz biomolekulbiomolekul ppro usnadnro usnadněěnníí výmvýměěny elektronny elektronůů mezi enzymy a elektrodou semezi enzymy a elektrodou se poupoužžíívajvajíí nníízkomolekulzkomolekuláárnrníí redoxnredoxníí lláátkytky –– medimediáátorytory ppououžžititíí medimediáátortorůů urychluje aurychluje a obvykle vobvykle vůůbec umobec umožňžňuje výmuje výměěnunu elektronelektronůů mezi aktivnmezi aktivníím centremm centrem enzymu a elektrodou.enzymu a elektrodou. substrsubstráátt EEoxox MMredred ee-- produktprodukt EEredred MMoxox reaguje s biokomponentou a elektrodoureaguje s biokomponentou a elektrodou dostatedostateččnněě rychlý prychlý přřenos elektronenos elektronůů (m(měěla by být znla by být znáámama stechiometrie a postechiometrie a poččet pet přřenenášášených elektronených elektronůů)) stabilnstabilníí formy (redukovanformy (redukovanáá i oxidovani oxidovanáá) za podm) za podmíínek pounek použžititíí neneúúččastnastníí se postrannse postranníích reakcch reakcíí (nap(napřř. s kysl. s kyslííkem)kem) vhodný redoxnvhodný redoxníí potencipotenciáál (vl (věěttšíší rozdrozdííl redoxnl redoxníích potencich potenciáállůů EE°° mezimezi enzymem a medienzymem a mediáátorem sice zvtorem sice zvěěttšíší uužžiteiteččný proud, souný proud, souččasnasněě vvššakak naroste taknaroste takéé ššum, nebezpeum, nebezpeččíí interferencinterferencíí a doba ustalova doba ustalováánníí pozadpozadíí)) bez vlivu pH na prbez vlivu pH na průůbběěh redoxnh redoxníí reakcereakce netoxický (napnetoxický (napřř. pro aplikace in vivo). pro aplikace in vivo) vhodný k imobilisaci (nerozpustnývhodný k imobilisaci (nerozpustný čči snadno adsorbovatelný)i snadno adsorbovatelný) PoPožžadavky na mediadavky na mediáátortor Název E° (V) tris-(2,2’-bipyridyl)ruthenium(III) 1.031 tris-(2,2’-bipyridyl)osmium(III) 0.603 ferrocen-1,1’-dikarboxylová kyselina 0.403 ferrocenylmethyltrimethylamonium 0.388 1,1’-bis(hydroxymethylferrocen] 0.224 ferrokyanid K4 [Fe(CN)6]4- 0.190 hydroxyethylferrocen 0.161 N,N‘-dimethyl-p-fenylendiamin 0.139 ferrocenoctová kyselina 0.124 p-benzochinon 0.039 N,N,N‘,N‘-tetramethyl-p-fenylendiamin 0.029 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) -0.016 1,2-naftochinon -0.090 fenazin methosulfát (PMS) -0.161 methylenová modř -0.230 tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) -0.191 2-hydroxy-1,4-naftochinon -0.378 fenosafranin -0.493 MediMediáátorytory Fe CN CN NC NC S SS S ferrocen Fc tetrathiafulvalen TTF tetrakyanochinodimethan TCNQ 19 PouPoužžititíí medimediáátortorůů ppřříímý pmý přřenos v roztokuenos v roztoku v micelv micelááchch v elektrodv elektroděě kovalentnkovalentněě nana 3D3D--polymernpolymerníí navnaváázaný nazaný na elektrodelektroděě medimediáátortor enzymenzym BiosensorBiosensor pro glukosupro glukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka 20 KonduktometrieKonduktometrie ststřříídavdavéé napnapěěttíí ((sinusoidsinusoidáálnlníí vlnvlněěnníí) se p) se přřivivááddíí nana dvouelektrodový systdvouelektrodový systéémm neuplatnneuplatníí sese faradaickfaradaickéé procesy,procesy, konckonc. polarizace,. polarizace, nabnabííjenjeníí dvojdvoj--vrstvyvrstvy mimo velikosti napmimo velikosti napěěttíí VmVm (b(běžěžnněě kolem 100kolem 100 mVmV) lze) lze mměěnit i frekvenci f (nit i frekvenci f (ωω=2=2ππff "spektroskopie")"spektroskopie") studuje se odezva syststuduje se odezva systéémumu (elektrody a prost(elektrody a prostřřededíí mezimezi nimi), mnimi), měřěříí se proud i a jehose proud i a jeho ffáázový posunzový posun θθ.. ω θ Vm Im čas ImpedanceImpedance ImpedanceImpedance ZZ je vektorovje vektorováá veliveliččina charakterisujina charakterisujííccíí chovchováánníí systsystéému vmu v ppřříítomnosti sttomnosti střříídavdavéého napho napěěttíí. Jako komplexn. Jako komplexníí veliveliččina mina máá velikost |velikost |ZZ| a| a úúhelhel θθ, nebo slo, nebo složžky reky reáálnoulnou RR (resistance) a imagin(resistance) a imagináárnrníí XX (reaktance). Plat(reaktance). Platíí pro ni npro ni náásledujsledujííccíí vztahy:vztahy: ZZ == RR ++ jjXX tgtgθθ == ––X/RX/R |Z||Z| == (R(R22+X+X22))1/21/2 |Z||Z| == VVmm/i/imm KonduktometrickKonduktometrickéé biosensorybiosensory ssledovledováánníí zmzměěn vodivosti pn vodivosti přři biochemických reakci biochemických reakcíích vych vyžžaduje produkciaduje produkci čči spoti spotřřebu iontebu iontůů nebo zmnebo změěny velikosti nabitýchny velikosti nabitých ččáástic. Produkce iontstic. Produkce iontůů je spojena sje spojena s úúččinkeminkem hydrolashydrolas aa amidasamidas, zm, změěna velikosti nabitýchna velikosti nabitých ččáásticstic probprobííhháá u reakcu reakcíí fosfatasfosfatas,, sulfatassulfatas ččii nukleas. Velmi pohodlnnukleas. Velmi pohodlněě taktak lze naplze napřř. prov. prováádděět stanovent stanoveníí neutrneutráálnlníích lipidch lipidůů, kter, kteréé popo nanaššttěěpenpeníí liplipasasou poskytujou poskytujíí ionty. Klasickým pionty. Klasickým přřííkladem je vkladem je vššak reakce ureak reakce ureasasy py přřii stanovenstanoveníí momoččoviny:oviny: NHNH22CONHCONH22 + 3 H+ 3 H22OO ⎯→⎯→ 2 NH2 NH44 ++ + HCO+ HCO33 -- + OH+ OH-- pproblrobléémem je vlastnmem je vlastníí vodivost pracovnvodivost pracovníího prostho prostřřededíí (pou(použžititíí mmáálolo vodivýchvodivých pufrpufrůů -- organickorganickéé, nap, napřř.. imidazolimidazol));; ttakakéé zmzměěnu vodivostinu vodivosti vyvolanou samotným pvyvolanou samotným přříídavkem vzorku je tdavkem vzorku je třřeba odlieba odliššit, jeit, je žžáádoucdoucíí zanedbat zmzanedbat změěny vodivosti v celny vodivosti v celéém roztoku a sledovat pm roztoku a sledovat přředevedevšíším tm těěsnsnéé okolokolíí elektrod selektrod s imobilisovanýmiimobilisovanými enzymy (vlastnenzymy (vlastníí signsignáál v dl v důůsledkusledku bbioreakceioreakce), proto se výhodn), proto se výhodněě poupoužžíívváá diferendiferenččnníí uspouspořřááddáánníí.. 21 KonduktometrickKonduktometrickéé ppřřevodnevodnííkyky detail elektrod interdigitated array enzymová referentní vrstva kontakty izolace ukukáázka dvojitzka dvojitééhoho konduktometrickkonduktometrickééhoho ppřřevodnevodnííkuku (s(síítotiskovtotiskováá technologie,technologie, rozmrozměěry 7 x 25 mm)ry 7 x 25 mm) OptickOptickéé ppřřevodnevodnííkyky zdroje svzdroje svěětla:tla: –– laserylasery –– svsvěětloemitujtloemitujííccíí diody (LED)diody (LED) –– výbojky (pro UV oblastvýbojky (pro UV oblast -- XeXe)) –– lampy (halogenovlampy (halogenovéé,, deuteriovdeuteriovéé)) detektory pro mdetektory pro měřěřeneníí intenzity svintenzity svěětla:tla: –– fotonfotonáásobisobiččee -- jsoujsou nejcitivnejcitivěějjšíší, nevýhodou je pot, nevýhodou je potřřebaeba vysokvysokéého napho napěěttíí –– fotodiodyfotodiody „„avalancheavalanche““ -- o no něěco mco méénněě citlivcitlivéé, v, věěttšíší ššumum –– obyobyččejnejnéé fotodiodyfotodiody (1000x m(1000x méénněě nenežž fotonfotonáásobisobiččee), vykazuj), vykazujíí vvěěttšíší ššum (malý vnitum (malý vnitřřnníí odpor), velmi levnodpor), velmi levnéé, mechanicky, mechanicky stabilnstabilníí a vhodna vhodnéé zejmzejmééna pro pna pro přřenosnenosnáá zazařříízenzeníí –– fotodiodovfotodiodováá polepole -- DADDAD „„diodediode arrayarray detectordetector““ -- linelineáárnrníí řřadaada fotodiodfotodiod vedle sebe (100vedle sebe (100 -- 1000), profil intenzity v z1000), profil intenzity v záávislosti navislosti na úúhlu dopadu (spektrum)hlu dopadu (spektrum) –– CCD prvky (videokamery)CCD prvky (videokamery) -- ploploššný profil intenzity,ný profil intenzity, „„imageimage““ technikytechniky 22 Princip laseruPrincip laseru LightLight AmplificationAmplification byby StimulatedStimulated EmissionEmission ofof RadiationRadiation ('zesilov('zesilováánníí svsvěětla pomoctla pomocíí stimulovanstimulovanéé emise zemise záářřeneníí')') svsvěětlo ve formtlo ve forměě úúzkzkéého svazku, jeho svazku, je polarizovanpolarizovanéé,, koherentnkoherentníí aa monochromatickmonochromatickéé slosložžky: aktivnky: aktivníí prostprostřřednedníí, rezon, rezonáátore, zdroj energietore, zdroj energie funkce: zdrojem energie je do aktivnfunkce: zdrojem energie je do aktivníího mho méédia pumpovdia pumpováána energie, vybudna energie, vybudíí elektrony, ty pelektrony, ty přři pi páádu na nidu na nižžšíší energetickou hladinu vyzenergetickou hladinu vyzáářříí fotony. Fotony nfotony. Fotony nááslednsledněě vrvráážžejejíí do daldo dalšíších elektronch elektronůů, zase je vybud, zase je vybudíí = zesilov= zesilováánníí toku fotontoku fotonůů, jestli, jestližže toke tok dopadne na zrcadlo s odrazivostdopadne na zrcadlo s odrazivostíí 100% je zp100% je zpáátky odratky odražžen do zesilovacen do zesilovacíího procesu,ho procesu, nebo naraznebo narazíí na polopropustnna polopropustnéé zrcadlo, kterzrcadlo, kteréé paprsek propustpaprsek propustíí aktivnaktivníí prostprostřřededíí -- oddodděělenlenéé kvantovkvantovéé energetickenergetickéé hladiny elektronhladiny elektronůů –– plyn nebo smplyn nebo směěs plyns plynůů (plynov(plynovéé lasery)lasery) –– monokrystalmonokrystal -- hladiny vznikajhladiny vznikajíí dopovdopováánníím (m (pevnolpevnoláátkovtkovéé)) –– polovodipolovodičč s ps p--n pn přřechodem (diodových laserechodem (diodových laserůů)) –– polovodipolovodiččovovéé multivrstvymultivrstvy –– jsou zjsou záákladem kvantových kaskkladem kvantových kaskáádndníích laserch laserůů ppřřechod elektronechod elektronůů z vyz vyššíššího do niho do nižžšíšího stavu pho stavu přři soui souččasnasnéém vyzm vyzáářřeneníí fotonu:fotonu: –– spontspontáánnnníí emise (pemise (přři ni níízkzkéém stupni obsazenm stupni obsazeníí vyvyššíšší hladiny)hladiny) –– stimulovanstimulovanáá emise (generace laserovemise (generace laserovéého zho záářřeneníí)) -- je tje třřebaeba ččerperpáánníím dosm dosááhnout tzv.hnout tzv. populapopulaččnníí inverze, kdy vyinverze, kdy vyššíšší hladina je obsazena vhladina je obsazena vííce elektrony nece elektrony nežž ninižžšíší He-Ne laser LaseryLasery 23 FotonFotonáásobisobičč PMT,PMT, PhotoPhoto MultiplierMultiplier TubeTube citlivcitliváá el. souel. souččáástka k registracistka k registraci slabslabéého zho záářřeneníí princip:princip: –– zzáářřeneníí dopadajdopadajííccíí nana fotokatodufotokatodu z nz níí uvolnuvolníí nněěkolik primkolik primáárnrníích elektronch elektronůů –– v el. poli jsou tyto elektrony urychlovv el. poli jsou tyto elektrony urychlováány k dalny k dalšíším elektrodm elektrodáám (dynodm (dynodáám), nam), na kakažžddéé z nich uvolnz nich uvolníí daldalšíší sekundsekundáárnrníí elektronyelektrony –– vznikvznikáá ststáále silnle silněějjšíší proud elektronproud elektronůů, který vyvol, který vyvoláá v mv měřěřicicíích obvodechch obvodech fotonfotonáásobisobiččee elektrický impulzelektrický impulz kankanáálovlováá konstrukcekonstrukce DalDalšíší fotodetektoryfotodetektory FotorezistorFotorezistor –– principprincip -- vnitvnitřřnníí fotoelektrický jev, nelinefotoelektrický jev, nelineáárnrníí, pomalý (z, pomalý (záávisvisíí na osvna osvěětlentleníí),), snisnižžuje odpor suje odpor s rostoucrostoucíím ozm ozáářřeneníímm –– monokrystal polovodimonokrystal polovodičče neboe nebo polykrystalickpolykrystalickáá tenktenkáá vrstva (vrstva (CdSCdS) nanesen) nanesenáá na nosnna nosnéé destidestiččce, dva kontakty, hermetickce, dva kontakty, hermetickéé pouzdro zarupouzdro zaruččujujííccíím pm přříístupstup zzáářřeneníí FotodiodaFotodioda –– PN a PIN, foton vstupujPN a PIN, foton vstupujííccíí do polovodido polovodičče se s dostatedostateččnou energinou energiíí mmůžůže býte být absorpovabsorpováánn, p, přřiiččememžž vzniklý volný elektron a dvzniklý volný elektron a dííra vytvra vytváářříí vv polovodipolovodiččii napnapěěttíí ((fotovoltaickýfotovoltaický jev) nebo zvjev) nebo zvěěttššujujíí jeho vodivost (jeho vodivost (fotovodivostnfotovodivostníí jev)jev) –– lavinovlavinovéé ((avalancheavalanche) PIN) PIN fotodiodyfotodiody -- vykazujvykazujíí vlastnvlastníí zeszesíílenleníí. Toto. Toto zeszesíílenleníí fotoproudufotoproudu je zpje způůsobeno psobeno přřiloiložženeníím napm napěěttíí, kter, kteréé urychlujeurychluje dopadajdopadajííccíími fotony vzniklmi fotony vznikléé nosinosičče ne nááboje natolik,boje natolik, žže pe přři sri sráážžce s mce s mřříížžkoukou krystalu polovodikrystalu polovodičče dojde k vyrae dojde k vyražženeníí daldalšíších (sekundch (sekundáárnrníích) elektronch) elektronůů FototranzistorFototranzistor –– mmíísto bsto bááze dopadze dopadáá svsvěětlo, zestlo, zesíílenleníí 10 a10 ažž 100x100x 24 CCDCCD detektordetektor AvaSpecAvaSpec Focussing mirror Detector Collimating mirror Grating Slit, mode stripper SMA connector PorovnPorovnáánníí detekdetekččnníích elementch elementůů Detector TAOS 102 HAM256 HAM1024 SONY2048 Type Photo diode array CMOS linear array CMOS linear array CCD linear array # Pixels, pitch 102, 85 µm 256, 25 µm 1024, 25 µm 2048, 14 µm pixel width/height 77 x 85 µm 25 x 500 µm 25 x 500 µm 14 x 56 µm Sensitivity (HL2000, 8 µm fiber) 3400 counts @ 5ms int. time (AvaSpec-102) 3000 counts @ 100 ms int. time 3000 counts @ 200 ms int. time 13000 counts @ 2ms int. time Peak wavelength 750 nm 500 nm 500 nm 500 nm Signal/Noise 1000:1 10.000 :1 10.000 :1 1000 :1 Dark noise Ca. 11 counts Ca. 22 counts Wavelength range 360-1100 nm 200-1000 nm 200-1000 nm 200*-1100 nm Frequency 2 MHz 330 kHz 330 kHz 2 MHz 25 OptickOptickéé ppřřevodnevodnííkyky pomocnpomocnéé prvkyprvky –– zrcadla (normzrcadla (normáálnlníí, polopropustn, polopropustnáá), hranoly), hranoly –– mmřříížžky, filtryky, filtry –– ššttěěrbiny, zrbiny, záávvěěrkyrky –– polarizpolarizáátory,tory, depolarizdepolarizáátorytory –– lampy (halogenovlampy (halogenovéé,, deuteriovdeuteriovéé)) svsvěětlovodntlovodnéé prvkyprvky –– planplanáárnrníí (vrstvy)(vrstvy) –– cylindrickcylindrickéé (optick(optickáá vlvláákna)kna) ppřřesnesnáá výroba,výroba, nnáákladnkladnéé OptickOptickáá vlvlááknakna šíšířřeneníí paprsku ve svpaprsku ve svěětlovodutlovodu jjáádro (core)dro (core) -- index lomu nindex lomu n11 plplášášťť (cladding)(cladding) -- nn22,, nn22> If clkI f εΦ= MMěřěřííccíí konfiguracekonfigurace ppřřii tzv.tzv. intrinsicintrinsic sensingsensing optický vodioptický vodičč neslounesloužžíí jen pasivnjen pasivněě pro vedenpro vedeníí svsvěětla, aletla, ale chemickchemickéé zmzměěny v tny v těěsnsnéém okolm okolíí svsvěětlovodutlovodu se sledujse sledujíí na zna záákladkladěě vyvolanýchvyvolaných zmzměěnněěných podmných podmíínek pro vedennek pro vedeníí uvnituvnitřř svsvěětlovodutlovodu PPřři vedeni vedeníí svsvěětla uvnittla uvnitřř svsvěětlovodu dochtlovodu docháázzíí k interferenci mezi dopadajk interferenci mezi dopadajííccíím am a odraodražženým sveným svěětelným paprskem a ttelným paprskem a tíímm vznikvznikáá elektromagnetickelektromagnetickéé stojatstojatéé vlnvlněěnníí kolmkolméé k odrk odráážžejejííccíímu povrchu (mu povrchu (tlumentlumenáá vlna, evanescent wavevlna, evanescent wave)) V tenkV tenkéém svm svěětlovodu ptlovodu přřipadipadáá na jednotku dna jednotku déélky mnohem vlky mnohem vííce odrazce odrazůů.. SvSvěětlo se zatlo se začčíínnáá šíšířřit pouze v urit pouze v urččitých diskritých diskréétntníích modech, danýchch modech, daných pouze urpouze urččitýmiitými úúhly dopadu. Mody lze urhly dopadu. Mody lze urččit na zit na záákladkladěě prprůůmměěruru svsvěětlovodu, indextlovodu, indexůů lomu a vlnovlomu a vlnovéé ddéélky svlky svěětla. Za ttla. Za těěchto podmchto podmíínek senek se mimo jinmimo jinéé zachovzachováávváá ffáázovzováá koherence laserovkoherence laserovéého paprsku.ho paprsku. 28 ExponenciExponenciáálnlníí vlnavlna elektromagnetickelektromagnetickáá vlna sevlna se šíšířříí do okoldo okolíí mimomimo svsvěětlovodtlovod, p, přřitom jejitom jejíí intenzita klesintenzita klesáá exponenciexponenciáálnlněě se vzdse vzdáálenostlenostíí od rozhranod rozhraníí ((„„exponenciexponenciáálnlníí vlnavlna““)) na vnna vněějjšíším povrchum povrchu svsvěětlovodutlovodu mmůžůže doche docháázet k interakczet k interakcíím s pm s přříítomnými ltomnými láátkamitkami energetickenergetickéé profily exponenciprofily exponenciáálnlníí vlny jsou pro tvlny jsou pro třři zi záákladnkladníí mody ukmody ukáázzáány nany na obrobráázkuzku pro vypro vyššíšší mody narmody narůůststáá podpodííll „„vnvněějjšíší energieenergie““ a zva zvěěttššuje se penetrauje se penetraččnníí hloubka.hloubka. mod: 0 1 2 z E EnzymovEnzymovéé optodyoptody PPřříímméé typytypy -- opticky mopticky měřěřenenáá lláátka (nejtka (nejččastastěějiji fluoroforfluorofor) se p) se přříímo vyskytuje vmo vyskytuje v biokatalytickbiokatalytickéé reakci.reakci. NADHNADH -- pompoměěrnrněě „„slabýslabý““ fluoforfluofor ((ΦΦff = 0.02), extink= 0.02), extinkččnníí a emisna emisníí maxima jsoumaxima jsou ppřři 350 a 450i 350 a 450 nmnm.. BiorekogniBiorekogniččnníímm elementem jsouelementem jsou dehydrogenasydehydrogenasy imobilisovanimobilisovanéé ppřřed koncem opticked koncem optickéého vlho vláákna. Aby se i koenzym dal zachytit vkna. Aby se i koenzym dal zachytit v systsystéémumu biosensorubiosensoru, pou, použžíívváá se jehose jeho konjugkonjugáátt ss polyethylenglykolempolyethylenglykolem, který, který neprochneprocháázzíí dialysadialysaččnníí membrmembráánou. Výhodnnou. Výhodnáá je konstrukceje konstrukce sensorusensoru pro alkohol,pro alkohol, kde je vzorek oddkde je vzorek odděělenlen mikropormikroporééznzníí teflonovou membrteflonovou membráánou, NADH se nachnou, NADH se nacháázzíí ve vnitve vnitřřnníím roztokum roztoku sensorusensoru.. ExistujeExistuje řřada pokusada pokusůů vyuvyužžíít fluorescencit fluorescenci flavinovýchflavinových koenzymkoenzymůů (FADH(FADH22,, FMNHFMNH22) v) váázaných pevnzaných pevněě v molekule mnohav molekule mnoha oxidasoxidas. P. Přři vyi vyššíšší koncentracikoncentraci substrsubstráátu se zpomaluje zptu se zpomaluje zpěětntnáá oxidace redukovanoxidace redukovanéé formy kyslformy kyslííkem a intensitakem a intensita „„vnitvnitřřnní“í“ ((intrinsicintrinsic) fluorescence redukovan) fluorescence redukovanéého koenzymu narho koenzymu narůůststáá. Výhodou je. Výhodou je reversibilita takovreversibilita takovéého systho systéémm UU sensorsensorůů vyuvyužžíívajvajííccíích celch celéé bubuňňkyky se sleduje vnitse sleduje vnitřřnníí fluorescence NADH (jefluorescence NADH (je úúmměěrnrnáá metabolickmetabolickéé aktivitaktivitěě).). ChlorofylovChlorofylovéé optickoptickéé sensorysensory se konstruujse konstruujíí pro detekci toxicity ppro detekci toxicity půůsobensobenéé lláátkami inhibujtkami inhibujííccíímimi fotosystfotosystéémm u rostlin.u rostlin. 29 EnzymovEnzymovéé optodyoptody NepNepřříímméé ((„„mediovanmediovanéé““,, extrinsicextrinsic) optick) optickéé biosensorybiosensory vyuvyužžíívajivaji optickoptickéé indikindikáátory. Nejtory. Nejččastastěějjšíší jsou optickjsou optickéé sensorysensory pro mpro měřěřeneníí kyslkyslííku aku a pHpH.. sledovsledováánníí kyslkyslííkuku vyuvyužžíívváá zhzhášášeneníí fluorescence indikafluorescence indikaččnníí molekuly, poklesmolekuly, pokles intensity fluorescence je dintensity fluorescence je dáán Sternn Stern--VolmerovýmVolmerovým vztahem:vztahem: IndikIndikáátor se obvykle nachtor se obvykle nacháázzíí vv silikonovsilikonovéé vrstvvrstvěě ppřředed ččelem optickelem optickéého vlho vláákna.kna. NejNejččastastěěji se pouji se použžíívváá kyselinakyselina pyrenmpyrenmááselnselnáá ((pyrenebutyricpyrenebutyric acidacid, PBA, PBA),), excitace pexcitace přři 350 ai 350 ažž 400400 nmnm;; ddalalšíší momožžnosti jsounosti jsou perylenperylen aa dekacyklendekacyklen,, organokovovorganokovovéé komplexy rutheniakomplexy ruthenia lzelze výhodnvýhodněě excitovat pexcitovat přři 460i 460 nmnm, tak, takžže jakoe jako zdroj mzdroj můůžže sloue sloužžit modrit modráá LED.LED. ])[+1/(= 20 OKII SVff (CH2)3COOH PBA pH zmpH změěny lze sledovat pomocny lze sledovat pomocíí acidobasickýchacidobasických indikindikáátortorůů. Z fluorescen. Z fluorescenččnníích lze pouch lze použžíít napt napřř.. 11--hydroxypyrenhydroxypyren--3,6,83,6,8--trisulfonovou kyselinutrisulfonovou kyselinu (HPTS, pH p(HPTS, pH přřechod 5 aechod 5 ažž 8) nebo 48) nebo 4--methylmethyl-- umbelliferon. Absobumbelliferon. Absobččnníích indikch indikáátortorůů je celje celáá řřada, kresolovada, kresolováá zelezeleňň a bromthymolova bromthymolováá modmodřř.. LuminiscenceLuminiscence jeje toto emise svemise svěětla ztla z molekuly vmolekuly v excitovanexcitovanéém stavu, který vzniklm stavu, který vznikl jako djako důůsledek chemických reakcsledek chemických reakcíí kkvantovývantový výtvýtěžěžek luminiscence odpovek luminiscence odpovííddáá podpodíílu polu poččtutu vyzvyzáářřených fotonených fotonůů a excitovaných molekula excitovaných molekul, u, u ppřříírodnrodnííchch systsystéémmůů mmůžůže dosahovat ae dosahovat ažž 90%90% iintenzitantenzita II vyzavyzařřovanovanéého svho svěětla je ztla je záávislvisláá nana ččase, vase, v ururččititéémm okamokamžžiku prochiku procháázzíí maximem (maximem (ttmaxmax)) vztah mezi luminiscencvztah mezi luminiscencíí a la láátkovým mnotkovým množžstvstvíímm analytuanalytu se urse urččíí kalibrackalibracíí aktivaceaktivace rozpadrozpad hνXBA 21 * +⎯→⎯⎯→⎯ kk )exp()[exp(]A[ 21 21 21 0 tktk kk kk I −−− − ≈ 12 1 2 max ln kk k k t − = 30 ChemiluminiscenceChemiluminiscence úúččinnost luminiscence zinnost luminiscence záávisvisíí na chemickna chemickéém výtm výtěžěžku reakce poskytujku reakce poskytujííccíí aktivovanýaktivovaný meziprodukt (B*), podmeziprodukt (B*), podíílu excitovaných molekul a konelu excitovaných molekul a koneččnněě na fluorescenna fluorescenččnníímm výtvýtěžěžku (ten by se mku (ten by se měěl bll blíížžit 1)it 1) aktivovaný meziprodukt je výhodnaktivovaný meziprodukt je výhodněějjšíší vv singletovsingletovéémm stavu; delstavu; delšíší žživotnostivotnost tripletovtripletovééhoho stavu zvystavu zvyššuje pravduje pravděěpodobnostpodobnost„„zhasnutzhasnutí“í“ ve vedlejve vedlejšíší reakci.reakci. pro citlivou detekci peroxidu vodpro citlivou detekci peroxidu vodííku se pouku se použžíívváá luminolluminol (5(5--aminoamino--2,32,3-- dihydroftalazindihydroftalazin--1,41,4--diondion); intensita sv); intensita svěětla jetla je úúmměěrnrnáá koncentraci Hkoncentraci H22OO22, jako, jako katalyzkatalyzáátor se mtor se můžůže uplatnite uplatnit ferrikyanidferrikyanid,, heminhemin nebo v neutrnebo v neutráálnlníím prostm prostřřededíí peroxidasaperoxidasa, v, v nevodnnevodnéémm prostprostřřededíí vyvolvyvoláá luminiscenci jen kyslluminiscenci jen kyslíík a bk a báázeze celkový výtcelkový výtěžěžek je pouze 0.01 (ek je pouze 0.01 (ššpatnpatnáá fluorescence)fluorescence) NH NH NH2 O O COO - COO - NH2 N2 * +H2O2 +OHkatalyzátor -N2 hν + 3-aminoftalát BioluminiscenceBioluminiscence emise svemise svěětla ptla přři (bio)chemicki (bio)chemickéé reakci vreakci v žživivéém organismu (cca 1000 druhm organismu (cca 1000 druhůů) se) se úúččastnastníí enzymyenzymy luciferasyluciferasy; tyto enzymy; tyto enzymy ššttěěppíí substrsubstráát luciferin (rt luciferin (růůznznéé druhy dledruhy dle organismu), porganismu), přřiiččememžž dochdocháázzíí k emisi svk emisi svěětlatla svsvěětlutlušškaka ((fireflyfirefly,, PhotinusPhotinus pyralispyralis)) luciferasaluciferasa (EC 1.13.12.7) oxiduje(EC 1.13.12.7) oxiduje ppřřííslusluššný luciferin zaný luciferin za úúččasti ATP,asti ATP, emise pemise přři 560i 560 nmnm, výt, výtěžěžek asi 0.88 !:ek asi 0.88 !: HO S N S N COOH H Luciferin ATP + luciferin + O2 AMP + PP + oxyluciferin + CO2 + hν momořřskskéé bakteriebakterie ((Vibrio fischeriVibrio fischeri,, VV.. harveyiharveyi,, PhotobactPhotobact.. phosphoreumphosphoreum)) luciferasa (EC 1.14.14.3) aluciferasa (EC 1.14.14.3) ažž 5% obsahu bu5% obsahu buňňky, oxiduje aldehydy (ky, oxiduje aldehydy (>>CC88,, dekanal, tetradekanal);dekanal, tetradekanal); v buv buňňce obsahujce obsahujíí i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu:i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu: cocožž umoumožňžňuje napojenuje napojeníí na dehydrogenasyna dehydrogenasy -- spolu s bakt. luciferasou jsouspolu s bakt. luciferasou jsou imobilisovimobilisováány na konec optickny na konec optickéého vlho vlááknkn NAD(P)H + FMN + H+ NAD(P)+ + FMNH2 FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + hν NADH oxidoreduktasa Luciferasa 31 AplikaceAplikace bioluminiscencebioluminiscence citlivcitliváá detekce ATPdetekce ATP -- 1010––1212 M, stanovenM, stanoveníí biomasybiomasy stanovenstanoveníí ss úúččastastíí ATP (kreatinATP (kreatin kinasakinasa,, ATPasaATPasa,, pyruvpyruváátt kinasakinasa,, ...)...) specifickspecifickáá detekce druhu mikroorganismdetekce druhu mikroorganismůů pomocpomocíí bakteriofbakteriofáággůů nesoucnesoucííchch luxlux gen (z Vibria, u svgen (z Vibria, u svěětlutluššekek lucluc geny)geny) citlivcitliváá detekce tdetekce těžěžkých kovkých kovůů (rtu(rtuťť, arsen): genový, arsen): genový konjugkonjugáátt mermer-- luxlux ((mermer je promotor aktivovanýje promotor aktivovaný HgHg) je vpraven do) je vpraven do plasmidplasmidůů vv E.E. colicoli, v p, v přříítomnosti rtuti se aktivuje, probtomnosti rtuti se aktivuje, proběěhne expresehne exprese luciferasyluciferasy aa nnáásleduje luminiscence, citlivost 200sleduje luminiscence, citlivost 200 nMnM rtutirtuti stanovenstanoveníí CaCa2+2+ -- ppůůsobsobíí rozpad a luminiscencirozpad a luminiscenci fotoproteinufotoproteinu ((peroxoformaperoxoforma luciferinu vluciferinu váázzáánnáá v komplexu sv komplexu s luciferasouluciferasou,, AequoreaAequorea)) ZhodnocenZhodnoceníí optodoptod Výhody:Výhody: nenneníí ttřřebaeba referentnreferentníí prvekprvek imobilizovanimobilizovanáá ffááze nemusze nemusíí být ve fyzikbýt ve fyzikáálnlníím kontaktu s optickýmm kontaktu s optickým systsystéémem (snadnmem (snadnáá výmvýměěnana biovrstvybiovrstvy)) stabilnstabilníí kalibrace (zvlkalibrace (zvlášášttěě ppřři poui použžititíí dvou vlnových ddvou vlnových déélek)lek) sousouččasnasněě mohou reagovat na nmohou reagovat na něěkolikkolik analytanalytůů (r(růůznznéé reagentyreagenty, r, růůznznéé vlnovvlnovéé ddéélky)lky) -- vysokvysokáá hushus--totatota ppřřenosu informacenosu informacíí nemajnemajíí vliv interference elektromagnetickvliv interference elektromagnetickéé povahy (lze provpovahy (lze prováádděět mt měřěřeneníí nana velkvelkéé vzdvzdáálenosti)lenosti) ppřři poui použžititíí vv žživivéém organismu nehrozm organismu nehrozíí elektrickýelektrický ššok (pok (přři zkratu)i zkratu) Nevýhody:Nevýhody: nenneníí reference preference přři mi měřěřeneníí intenzity svintenzity svěětla (svtla (svíítivost zdroje koltivost zdroje kolííssáá), proto je), proto je ttřřeba kalibrace ve dvou bodecheba kalibrace ve dvou bodech dynamický rozsah je omezený (prodynamický rozsah je omezený (pro pHpH 2 a2 ažž 66 řřááddůů, elektrochemicky 12!), elektrochemicky 12!) odezvy jsouodezvy jsou ččasto pomalasto pomaléé dlouhodobdlouhodobáá stabilita je limitovstabilita je limitováána vyna vyččerperpáánníím indikm indikáátoru (toru (fotorozkladfotorozklad,, radraděěji "svji "svíítit" mtit" méénněě intenzivnintenzivněě)) vadvadíí svsvěětlo z okoltlo z okolíí 32 KalorimetrickKalorimetrickéé biosensorybiosensory vyuvyužžíívajvajíí zmzměěny teploty v prny teploty v průůbběěhu enzymových reakchu enzymových reakcíí (n(něěkterkteréé typicktypickéé ppřřííklady jsou uvedeny v tabulce). Pklady jsou uvedeny v tabulce). Přři konstrukcii konstrukci biosensorbiosensorůů to je spto je spíšíšee okrajovokrajováá zzááleležžitost, ale existujitost, ale existujíí nněěkterkteréé analytyanalyty, pro kter, pro kteréé mohou býtmohou být kalorimetrickkalorimetrickéé ppřřevodnevodnííky zvlky zvlášášttěě výhodnvýhodnéé. Meze detekce bývaj. Meze detekce bývajíí do 10do 10 µµM, rozliM, rozliššeneníí 0.0010.001 °°C; vývoj tepla pC; vývoj tepla přři biochemických reakci biochemických reakcíích (ch (––kJkJ/mol):/mol): KatalasaKatalasa GODGOD HexokinasaHexokinasa LaktLaktáát DH Ureasat DH Ureasa UrikasaUrikasa HH22OO22 glukosaglukosa glukosaglukosa pyruvpyruváátt momoččovinaovina kyskys. mo. moččovováá 100100 8080 2828 6262 6161 4949 pokud vlastnpokud vlastníí reakce sreakce s analytemanalytem neuvolneuvolňňuje teplo, lze zauje teplo, lze zařřadit nadit nááslednýsledný krok uvolkrok uvolňňujujííccíí teplo:teplo: oxidasaoxidasa ⎯⎯⎯⎯→→ HH22OO22 ⎯⎯⎯⎯→→ katalkataláázaza hydrolasyhydrolasy ⎯⎯⎯⎯→→ anion + Hanion + H++ ⎯⎯⎯⎯→→ hydratace na Hhydratace na H33OO++ hydratahydrataččnníí teplo protonuteplo protonu ččininíí vv TrisTris pufrupufru ∆∆HH == ––4848 kJkJ/mol, ve fosf/mol, ve fosfáátu jetu je ∆∆HH == ––4.74.7 kJkJ/mol/mol recyklarecyklaččnníí pochody umopochody umožňžňujujíí produkci tepla nprodukci tepla něěkolikankolikanáásobnsobněě zvýzvýššitit TermistorTermistor ppřřevodnevodnííkem je obvykle termistor, jehokem je obvykle termistor, jeho odpor R zodpor R záávisvisíí na teplotna teplotěě T:T: 1/T = a + b1/T = a + b lnln R + c (R + c (lnln R)R)22 ččasto se pracuje v prasto se pracuje v průůtotoččnnéém sytm sytéému smu s enzymovým reaktorem tepelnenzymovým reaktorem tepelněě izolovaným od okolizolovaným od okolíí poupoužžititíí diferencidiferenciáálnlníího uspoho uspořřááddáánníí umoumožňžňuje pracovat puje pracovat přři teploti teplotěě mmíístnostistnosti mměřěřeneníí odporu termistoru se provodporu termistoru se provááddíí pomocpomocíí WheatstoneovaWheatstoneova mmůůstkustku jiný pjiný přřevodnevodníík mk můžůže být termoe být termoččllááneknek (CMOS)(CMOS) Enzymový reaktor s termistorem Výhodou je,Výhodou je, žže nevade nevadíí ččáástice ve vzorku, interferujstice ve vzorku, interferujííccíí lláátky nebo zbarventky nebo zbarveníí.. NNěěkdy takkdy takéé jinjinéé metody mohou být dost tmetody mohou být dost těžěžkopkopáádndnéé, nap, napřř. stanoven. stanoveníí triglyceridtriglyceridůů liplipáázou se sleduje kalorimetricky velmi výhodnzou se sleduje kalorimetricky velmi výhodněě