Imunosensory V1 Vn J1-5 C *-MIM I I- L (k) Chromosom 6 n=2 .. 300 V1 Vn D1-n J1-4 Ci a etc. -IZhHZklll //HIM LJOO— H Chromosom 12 n=2 .. 300 n ~ 12 1 C geny pro podtřídy Immunoglobuliny Y igG igA igM Vlastnosti protilátek (myší třídy) Třída IgA IgD IgE IgG IgM M (kDa) 170 180 190 160 900 H řetězec a 8 e y (i Sacharid (%) 7-11 12-15 12 2-3 9-12 Spojení s nosnou bílkovinou Mimo determinantu vysoká specifita Ab Polyklonální protilátky 1. Imunizce Příprava imumizací experimentálních zvířat (koně, kozy, ovce, králíci, myši,...) antigény lze použít přímo, hapteny se musí spojit s nosnou bílkovinou Afinita vzniklých protilátek je obvykle velmi vysoká; polyklonální antiserum obsahuje populaci různých protilátek s odlišnými afinitami Monoklonální protilátky 1. Imunizovaná myš nebo krysa 2. Fúze buněk 3. Selekce - kultivace v HAT mediu nezfúzované hybridomy nezfúzované myelomy slezinné buňky nepřežijí v HAT mediu nepřežijí v kultuře , ,. 4. Klonovani (limitní redeni) O A Ob Oc Od klony prdukující různé protilátky 5. Produkce protilátek jako ascitická tekutina (5-15 mg/mL) 3 převedení výroby ascitické tekutiny (produkce protilátky in vivo v myších) do in vitro podmínek (produkce v tkáňových kulturách) výroba velkých šarží (gramová množství) v kontinuálních fermentačních systémech (ověření procesu, výběr vhodných médií) Rekombinantní protilátky buňky produkující protilátky extrakce mRNA ^ V Cl transformace na cDNA amplifikace variabilních částí spojení, další amplifikace linker DNA scFv fragmentu Příprava vložena do plasmidu či fága, exprese scFv v buňkách 4 Formy scFv molekul rAb z fágových knihoven fágová knihovna: semisyntetická scFv V,.+VL, kolekce scFv phagemidů připravenou ze syntetických v-genových segmentů exprimovaných na povrchu filamentózního fága selekce scFv protilátek konjugát analytu s nosným proteinem se smíchá s polyklonální populací rekombinantních fágů, po inkubaci se komplexy analyt-rekombinantní fág zachytí na povrch magn. částic (např. interakce avidin-biotin), nenavázané fágy se odstraní promytím navázané, tedy antigen-specifické fágy se uvolní z mg. částic a použijí poté k infikování buněk E. coli specifickými fágy infikované E. coli buňky jsou poté namnoženy a infikovány helperfágem (spustí replikaci rekombinantních fágů) namnožené fágy jsou poté koncentrovány precipitací polyethylen glykolem a použity v dalším kole selekce uvedné výše (4 kola) ELISA testem se vyberou monoklonálními fágy s reaktivitou výhradně proti molekule analytu Formáty imunostanovení ♦ ♦ kompetitivní sendvičové Analyt Značka (enzym, fluorofor,...) Imunostanovení Kompetitivní Sendvičové 6 Parametry imunostanovení o měřený signál... Y ■ ""^^ Limit detekce ^rel = (Y - Yb|ank) / (Ymax - Yb|ank) j \ střed křivky křížová reaktivita = xA50/xB5o'100% i \ kalibrační závislost = i V, (A-D)/(1+(x/x50)b) + D nízká 0.1 1 10 100 1000 osa x - logaritmická skala Optické imunostanovení změna tloušťky vrstvy vede ke změně barvy Strong Positive Moderately Weak Positive n Weak Positive analyt biovrstva optická vrstva Negative Invalid Přímé vizuální hodnocení 7 ELISA-on a strip Absorption ,^ pad SignaJ generation pad r Control / antibody ^^^^^^ Capture antibody Conjugate----" release pad 0 ,1 1 Detection antibody-HRP conjugate Sample-—— application Ü 0.25 2.5 25 Front Side • imunostripy - samovolný pohyb roztoků v membránovém systému prostřednictvím kapilárních sil • záchytné zóny, zviditelnění pomocí barvotvorné enzymové reakce, případně zlaté nanočástice (červené) • vizuální vyhodnocování ELISA-on a chip • plastový přípravek („čip") pro vložení úzkého imunostripu - zlepšená reprodukovatelnost transportu látek • pohyb vzorku jedním směrem, pohyb substrátové směsi v kolmém směru 8 ELISA-on a chip vyhodnocovací systém na bázi CCD zlepšená reprodukovatelnost díky srovnání odezvy kontrolní a měřící zóny Charging cquipincni 0 » /Enzym í •o C ^nžym^ Elektrochemická imunostanovení 1. Inkubace se vzorkem a s „tracerem" 2. Separace, promytí 3. Přídavek substrátu (inkubace) 4. Změření signálu Enzym 1 Enzymové „tunelové" imunostanovení Pseudohomogenní stanovení - bez separace a promývacích kroků Zvýšená reakční odezva vzniká na povrchu důsledkem těsného kontaktu dvou kooperujících enzymů Enzym 2 konjugovaný s analytem FCFD fluorescence capillary fill device • je optický afinitní imuno/biosensor, využívá k detekci fluorescentní značku (fluorofor) • značka emituje světlo do planárního světlovodu, nesoucího imobilizovaný bioligand • základem jsou dvě paralelní skleněné destičky vytvářející pracovní prostor o tloušťce pouze 0.1 mm ("kapilární" rozměr), což umožňuje samovolné naplnění definovaným objemem vzorku. I I • po afinitní interakci je část * f luoroforu volně v roztoku a část je vázána v komplexu s bioligandem na povrchu světlovodu • emitované světlo (fluorescence) z roztoku vstupuje do světlovodu jen pod omezenými úhly (větší než kritické), svetlo z vázaných fluoroforů může vstupovat i pod menšími úhly (fluorofor je vázán v Odlišení volného a vázaného fluoroforů penetrační oblasti exponenciální vlny). FCFD po výstupu světla z konce světlovodu pak lze podle výstupního úhlu odlišit fluorescenci z volného roztoku a z povrchové oblasti, tím lze kvantitativně určit podíl vázaného fluoroforu bez separačního kroku -homogenní stanovení Výstupní úhly světla emitovaného vázaným a volným fluoroforem (např. fluorescein), se liší, což umožňuje jednoduše rozlišit vázanou a volnou formu fluoroforu, a tak vyhodnotit průběh homogenního imunochemického stan ovení,- LA /M\ -90 o a fluofory volné v roztoku 90 90 -90 0 f fluofory vázané na povrch sv ětlovodu Úhly paprsků na výstupu světlovodu FCFD světlovod A filtr štěrbina čočka \l / FCFD sensor zdroj světla (výbojka) pro excitaci fluoroforu • zdroj světla - výbojka fotoblesku, omezení výstupních úhlů se provede pomocí štěrbiny, další součásti filtry, čočky a detektor • zařízení je jednoduché, levné, snadná masová výroba, na jedno použití • malé vzdálenosti v systému sensoru zkracují dobu odezvy, kterou pak primárně určuje kinetika vazebné interakce, ne transportní pochody (5 min kompetitivní, 15 sendvičové stanovení • není třeba odměřovat vzorek (přímo krev, sérum, moč), nejsou nároky na manipulaci. Excitace fluoroforů evanescentní vlnou Cladding Core 1 7 • imunoreakce probíhá na povrchu světlovodné vrstvy • evanescentní vlna se šíří mimo světlovod, kde excituje tam přítomné fluorescentní značky, navázané v průběhu imunostanovení • světlovod pak dále slouží jako „sběrač" záření emitovaného při fluorescenci • peroxidasa (HRP) - substráty - vždy peroxid vodíku plus další oxidovatelné látky: - 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) měření fotometrický při 450 nm - 2,2'-azino-di(3-ethyl)benzthiazolin sulfonová kys. (ABTS) při 650 nm - 5-aminosalicylová kyselina (ASA) při 450 nm - elchem: jodid, hydrochinon, ferrocen, ASA, ... • la kasa - obdobná HRP, ale stačí jí kyslík místo peroxidu vodíku • alkalická fosfatasa (ALP) - p-nitrofenylfosfát (PNPP), hydrolysou vznikající p-nitrofenol se stanovuje fotometrický v alkalické prostředí kolem 405 nm - p-aminofenylfosfát (PAPP), vzniklý aminofenol se oxiduje na elektrodě • (3-galaktosidasa - o-nitrofenyl-P-D-galaktosid (ONPG), hydrolysou vzniklý o-nitrofenol se měří při 420 • ureasa - močovina, změna pH vyvolaná hydrolysou se měří pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm, nebo potenciometricky (LAPS) • glukosa oxidasa - velmi stabilní, měří se generovaný peroxid vodíku • acetylcholinesterasa - vysoké číslo přeměny Imunosensory - enzymové značky nm Imunosensory - fluorescenční značky • fluorescein, tetramethylrhodamin - klasické, dostupné v aktivované formě (NHS, biotin, ...) • Cy5, Cy3 - cyaniny, NIR 650/667 nm - levná instrumentace • QD „quantum dots" - anorganické nanočástice obsahující volné elektrony, s velikostí narůstá vlnová délka emise, stabilita a vysoké výtěžky, velké Stokesovy posuny Imunosensory - fluorescenční značky cheláty lanthanidů (Eu, Srn, Dy) - dlouhá životnost excitovaného stavu - Time Resolved Fluorescence Excilalion Decay lime 400 800 1000 Time (us) SlOhíťíhitl ÍOr aurůjjilinl 350 490 450 500 550 600 63 -Tb* -Dy* -Eli* -Sm* 13 Elektrochemiluminiscence kulička (zvětšeno) značka analyt mg. kuličky potažené streptavidinem BioVeris™ technologie: rychlý "mix and measure " homogenní formát ECL značka ruthenium(ll) tris(bipyridin) NHS ester Stabilní neizotopická značka, různé formy pro různé biomolekuly: BV-Tag-NHS-ester BV-Tag-f osf Oram id BV-Tag-maleimid BV-Tag-hydrazid BV-Tag-amin aminy (bílkoviny) fosfoskupiny (nukleové kyseliny) thioly sacharidy karboxyly ECL reakce UGHT Luminiscence emise světla Chemi- předání chemické energie Elektro- elektrochemická iniciace Ru(bpy)3!+(1) = BV-TAG" TPA = Tripropylamine • ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu • TPA+ ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu • Ru se nespotřebovává - recykluje - zesilovací mechanismus -zvýšení citlivosti stanovení Různé formáty stanovení 15 Homogenní formát stanovení BioVeris7' II ELISA •Shorter Incubation Times • Reduced Assay Seps mi 10 12 14 Hours KEY: I I Coat Plate I I Wash I I Block Plate |_| Primary Ah |_J fecondary Ab HRP Anti-rat Ab I I Substrate - Development I I Read Moving BioVeris™Technology Forward M-SERIES" 384 Analyzer BioVeris Detection System M-SEFHESM1R Analyzer M-SEFHESM1M Analyzer MIM System in Transport Cases Enzymatic Assays for Toxins Streptavidm Coated Magnetic Bead Protease 17 Enzymatic Assays for Screening Drug Targets A) Protease binds to substrate »in drug J&hrf^ _ . ognizes substrate S Jl^Rřb B) Compound library reco and binds, preventing toxin from binding Protease or toxin A) Substrate is cleaved, no signal B) Compound inhibits protease activity of toxin, signal is generated and viable drug candidate identified! Imunosensory - co lze měřit • teoreticky každý analyt, pro který ... -jsou k dispozici příslušné protilátky - případně již existuje ELISA stanovení - lze připravit protilátky klasickými postupy - lze připravit rekombinantní protilátky pomocí genetické knihovny 18 Imunosensory - příklady stanovení klinická oblast - markery: albumin, apolipoprotein, hCG, hl_H, thyroxin, fetoprotein, hlgE, troponin, FAB P, PSA, HBsA, ... - léčiva: amfetamin, digoxin, fenytoin, theophylin, ... - drogy: kokain, heroin, ... životní prostředí - pesticidy: triaziny (atrazin), fenoxyalkanové k. (2,4-D), organochlorové (acetochlor, DDT) - toxické látky: mikrocystiny, polychlorované bifenyly (PCB) potravinářství - bakterie: Listeria, Cryptosporidium, Salmonella, E. coli 0157H7 - kontaminanty: antibiotika (penicilin), aflatoxiny vojenství - bakterie, viry, toxiny