Technologické aspekty biosensorů ■ imobilizace biomolekul na povrch sensorú - uchování aktivity a specificity - robustní spojení - dobrý převod signálu - povrchová hustota bioreceptoru - reprodukovatelná a snadná procedura Membrány a biosensory ■ membrány v biosensorech plní několik funkcí: ■ imobilizace biorekogničních molekul - nosná funkce. ■ řízení transportu látek buď prostřednictvím difúzni kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferenční) ■ zlepšení mechanické stability ■ biokompatibility. Rozdělení membrán ■ membrána = porézní prostředí, rozdělení: ■ hrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje (pokud polymer membrány neinteraguje s rozpouštědlem); permselektivita je velmi špatná až žádná (prochází všechny látky) ■ jemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek ■ neporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí Příprava membrán ■ je potřeba pečlivě kontrolovat podmínky (vlhkost, teplota), které silně ovlivňují vlastnosti vznikajících membrán ■ fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla - polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) - vyšší vlkost a nižší teplota okolí - vznikají větší póry - nalití roztoku polymeru v org. rozpouštědle nemísitelném s vodou na vodní hladinu, zde se na rozhraní utvoří asymetrická membrána ■ polvmerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ") - vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody ■ dodatečná tvorba pórů - tzv. nukleární membrány (Nucleopore) - vrstva polymeru se „prostřílí" urychlenými nukleony, lokálně narušená struktura polymeru se naleptá a vzniknou póry - velmi dobrá reprodukovatelnost a homogenita pórů o poměrně přesně definovaném průměru - lokální změny lze vyvolat mechanickým natahováním (polyenové membrány, obsahující krystalické a amorfní oblasti, v amorfních pak následně vzniknou póry) 2 Úpravy membrán Nucleopore membrána ■ velikost pórů membrány lze dodatečně změnit: ■ zvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů - alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů ■ zmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů - např. organosilanů nebo lipidických látek ■ symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná ■ asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází Biokompatibilita ■ při použití biosensorů v živém organismu (in vivo) nebo v klinické praxi při kontaktu zejména s krví (in vitro) ■ při kontaktu povrchu membrán s prostředím dochází k adsorpci proteinů - zejména albuminu a fibrinogenu na povrch ■ pak se vytváří další vrstva krevních destiček (koagulační trombóza) ■ při dlouhodobé implantaci dochází k zarůstání biosensorů tkání ■ postupné snižování citlivosti důsledkem snížené prostupnosti ■ biosensor může vyvolávat rušivé reakce u živého organismu - srážení krve, zánětlivé procesy ■ je potřeba povrch biosensorů povléknout vhodnými polymery - silikon, polytetrafluorethylen a zejména polyurethany) ■ modifikovat povrchní obal (hydrofilizace, konverze aminoskupin na hydroxyskupiny) ■ do vnější vrstvy vpravit látky omezující rušivé reakce fosforylcholin, fosfolipidy, heparin 3 Mechanické zachycení biomolekul • převodník ^-^)-krouzek jdialyzační . membrána 1 nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány Zachycení v gelu inkluze biomolekul uvnitř struktury membrány při její tvorbě polyakrylamid (PAG) příprava ze směsi akrylamidu a methylen-bis(akrylamid) v přítomnosti enzymu, iniciace UV světlem, polymer obsahuje vysoký podíl vody (80 až 95%) CH2=CH-CO-NH2 (CH2=CH-CO-NH)2CH2 akrylamid + bis(akrylamid) OC-NH2 / "CHo~CH'CHo~CH"CHo"CH 2 I 2 2 I CO OC-NH2 I 2 NH iu bis - zesíťování Ono I Vznik PAG -NH 4 Zachycení v gelu ■ želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 °C) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána) ■ Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou - používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměnič - může zachycovat biomolekuly -[(CF2-CF2)m-CF-CF2]n- O Nafion CF2 CF3—CF--0-CF2-CF2—SO, Jp H Zachycení v PVA ■ polyvinylalkohol (PVA) je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer ■ radiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu y-zářenim (generuje 60Co) - vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování - výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizovaná ■ chemické síťování - triisokyanáty (TIC), spojí postranní hydroxyly ■ UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) - vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomocí PVA TIC —N=C=0 .HO--► —NH-C-O— + . II zesiteni o 5 Polyurethany ■ reprezentují velice širokou skupinu biokompatibilních polymerů s velmi dobrými adhezními vlastnostmi ■ vychází z oligomerů (kolem 50 kDa), které se v přítomnosti enzymu zesíťují např. difenylmethan diisokyanátem ■ kombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays ■ poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediator), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny ■ směs modifikovaného oligomerů, enzymu a bifunkčního činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu PU - Tecoflex Multifunkčni polymery M M PEGDE 6 Zesíťování biomolekul S 0=CH—(CH2)3-CH=0 ■ zdaleka nejčastěji se používá glutaraldehyd; jeho směs s roztokem bílkoviny v závislosti na koncentraci složek vytváří spontánně retikulum bud' přímo na povrchu sensoru, nebo na vhodném podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána) ■ reakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze, která se ještě může zredukovat na stabilnější aminovou vazbu Aktivace inertních povrchů ■ pracovní povrch sensorů tvoří malá skupina poměrně inertních materiálů: sklo, křemík, různé modifikace uhlíku (grafit, skelný uhlík, kompozitní směsi) a ušlechtilé kovy (zejména zlato a platina) ■ některé biomolekuly se na tyto materiály adsorbují s různou pevností, avšak spolehlivá a dlouhodobě stabilní imobilizace vyžaduje kovalentní vazbu mezi biomolekulou a povrchem ■ prvním krokem imobilizace jsou aktivační postupy, které na málo reaktivní povrch sensoru zavádějí reaktivní skupiny schopné pak kovalentní vazby s biomolekulami 7 Silanizace (C2HP)3SÍ—(CH2)3-NH2 APTES (CH30)3Si—(CH2)3-0-CH2-C|H-CH2 CH3 ° 1 3 GOPS C2H50-Si—(CH2)3-NH2 CH, APDMES metoda aktivace inertních povrchů částečně pokrytých vrstvou oxidu (sklo, křemík, kovy) kontaktní vrstvou silanu s vhodnou reaktivní skupinou nepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivní alkoxyderiváty Y-aminopropyltriethoxysilan (APTES nebo APTS) glycidoxypropyltriethoxysilan (GOPS) jejich účinkem se na povrchu vytvoří několik molekulárních vrstev Silanizace ■ lze provádět z organické fáze - 10% roztok silanu v toluenu, v něm se daný povrch refluxuje 12 až 24 hod, po promytí toluenem či acetonem a vysušení se dále zahřívá 2 až 4 hod při 110 °C ■ z vodné fáze se dosáhne menší vazebná kapacita, ale vrstva je stabilnější při použití ve vodném prostředí - povrch se hydratuje 30 min povařením ve vodě - zahřívá 3 až 4 hod při 75 °C v 10% vodném roztoku silanu, pH 4 - po usušení se zahřívá přes noc při 110 °C ■ odpařovací nanesení je nejjednodušší - povrch se inkubuje 1 hod v 1% silanu v acetonu - po opláchnutí acetonem a vysušení se zahřívá 1 hod při 110 °C ■ nanášení silanu z vodné fáze nebo z polárních rozpouštědel vede ke tvorbě složitějších struktur (4 až 5 vrstev silanu) Spontánní vznik monovrstev ■ monovrstvy (SAM, „self-assembled monolayers") mohou vzniknout samovolnou organizací na nosném povrchu nej běžnějším příkladem je velmi pevná adsorpce thiosloučenin na povrchu zlata vhodnou volbou dalších funkčních skupin thiolu nebo disulfidu lze získat reaktivní skupiny využitelné pro další imobilizační kroky SAMs vždy vzniká monomolekulární vrstva, která je prakticky elektricky izolován naopak adsorpce krátkých thioderivátů ča odezvy bílkovin a jiných látek (usnadněná výměn O- já, že povrch u L- ,)ř Au Ol Si<100) JAdsorpUoo Organization 200-i (nA) 0- X(CH2)„SH + Au' ^X(CH. Odezva ferrokyanidu lineami voltamogram -Au elektroda -modifikace SAM/MUA E(mV) Thiosloučeniny ■ nejčastěji se používají thioly obsahující v molekule aminoskupinu (cysteamin, cystamin, thiofenol), hydroxyskupinu (16-merkapto-hexadekanol) nebo karboxyskupinu (12-merkaptoundekan-karboxylová kyselina) ■ bis(N-hydroxysukcinimidester) kyseliny 3,3'-dithiopropionové (DSP) je speciální činidlo, které se váže na zlato - N-hydroxysukcinimidová skupina (NHS) je reaktivní a může být vyměněna za volnou postranní aminoskupinu z bílkoviny, přičemž vznikne amidová vazba CH2CH2-CO- CH2CH2-CO-O DSP Aktivace polyamidu ■ polyamidy se připravují polykondenzačními reakcemi - Nylon 66 - z 1,6-diaminohexanu a hexan-1,6-dikarboxylové kyseliny - Silon - kondenzací £ kaprolaktamu ■ jsou v oblasti biosensorů využívány ve formě membrán, sítek, kuliček a trubiček pro imobilizaci zejména enzymů ■ přirozený materiál má pro imobilizaci pouze velmi málo volných koncových skupin, takže je nutné jeho strukturu částečně narušit ■ štěpení amidových vazeb lze dosáhnout opatrnou hydrolýzou (3 M HCI, doba působení závisí na formě materiálu, 10 sec až 1 hod) ■ často se však polyamid mechanicky naruší ■ výhodnější jsou aktivační postupy, které amidovou vazbu nepřerušují Aktivace dimethylsulfátem ■ O-alkylace peptidové vazby oxoniovou solí (triethyloxonium tetrafluoroboritan) nebo dimethylsulfátem ■ vzniklý imidoester reaguje v slabě alkalickém prostředí s aminoskupinou (lyzin, 1,6-diaminohexan) za vzniku amidinu, kladný náboj zvyšuje polaritu polymeru ■ získá se mnohem větší povrchová hustota využitelných karboxy nebo aminoskupin C_NH— (CH3)2S04_c4äH_ R-NH2 —C=řk / n .I . I \ O " OCH3 .CH3OH * NH~R Aktivace polyamidu dimethylsulfátem Eiektropoiymerace ■ využívá elektrochemickou oxidaci k přípravě reaktivních monomerů, které pak spontánně vytváří polymerní film na povrchu elektrody ■ filmy se dají vytvořit i na členitém povrchu nebo na povrchu mikroelektrod ■ pokud jsou v průběhu eiektropoiymerace v roztoku přítomné biomolekuly, dochází k jejich zachycení uvnitř vznikající membrány; méně se může uplatnit také kladný náboj polymeru ■ vlastnosti membrány je možné ovlivnit přídavkem dalších látek do elektropolymerační směsi ■ tloušťku membrány určuje velikost prošlého náboje, tak se dá snadno reprodukuvatelně ovlivnit množství imobilizované biomolekuly ■ některé elektropolymerní vrstvy mohou být navíc vodivé, což usnadňuje přenos elektronů mezi elektrodou a biomolekulami; tyto polymery jsou obvykle barevné 11 Polypyrrol (PPY) klasický příklad, provádí se oxidací 50 až 200 mM pyrrolu amperometrickou oxidací při potenciálu kolem 0.8 V, jako elektrolyt se přidává KCI, pracuje se v anaerobním prostředí tloušťka filmu je úměrná množství prošlého náboje (5 mC/cm2 odpovídá 13 nm), lze dosáhnout až 100 nm tlustých vrstev vzniklý PPy film je vodivý, vodivost dosahuje asi 500 S/cm - pro srovnání jsou vodivosti mědi 106, křemíku 104 a skla 1011 S/cm), obdobně probíhá elektropolymerace methylpyrrolu Polyfenylenoxid (PPO) velmi tenké a mechanicky stabilní filmy PPO na povrchu elektrod vznikají elektropolymerací fenolu nevodivé, takže elektropolymerace se samovolně zastaví, jakmile je povrch elektrody elektricky izolován průběžně se dá pozorovat pokles oxidačního proudu při vzniku filmu: | potenciál Elektropolymerace fenolu amperometricky a cyklickou voltametrií méně stabilní jsou polyanilinové (PANI) filmy vzniklé z anilinu: Kontrolní membrány ■ elektropolymerní vrstvy jsou také vhodné pro ovlivňování transportu látek jako kontrolní membrány - polyfenylendiaminové (PPD) filmy z 1,2 diaminobenzenu ■ nevodivé o tloušťce kolem 10 nm; snadno přes ně prochází peroxid vodíku, přitom jiné rušivé látky jsou odstíněny ■ protože zachycení bílkovin uvnitř polymeru je poměrně volné, dochází časem k uvolnění do roztoku a tím k poklesu aktivity ■ jiné postupy proto používají elektropolymerní film jen jako výchozí chemickou modifikaci povrchu elektrody, a film se pak dále upravuje chemickými reakcemi. Modifikace elektropolymerů Polypyrrol se dá nitrovat v p poloze a elektrochemickou redukcí nitroskupiny se získá aminoskupina vhodná pro další kovalentní vazbu biomolekul: H ~N I V. H CuN03 Derivatizace PPy jinou možností je reakce PPy s nitrobenzoylchloridem, nitroskupinu je pak možné redukovat také chemicky zinkem v kyselině octové: r H ~\ N ví p-nitrobenzoylchlorid ■ HCI NO, J 13 Elektropolymerace bílkovin elektropolymerovat se dají také vhodné deriváty biomolekul ve směsi např. s pyrrolem k postranním skupinám enzymů je možné připojit pyrrolová jádra, takže po skončení elektropolymerace je enzym nedílnou součástí řetězce polymeru: 1. karbodiimid -ss^N. O "N— (CH2)2COOH-► [ N—(CH2)2-cf Nhr© 2. enzym E podobně je možné využít i derivát s koncovou aminoskupinou Kovalentní vazba biomolekul ■ předpokládá se vazba zvolené biomolekuly na výchozí materiál (povrch sensoru, membrána,...) nesoucí některou z následujících skupin: amino karboxyl hydroxyl ■ dále jsou popsána vhodná činidla umožňující kovalentní vazbu biomolekul, zejména bílkovin ■ následující část je samozřejmě míněna pouze jako neúplný přehled základních postupů ■ neustále se objevují nová speciální činidla použitelná obecně nebo pro speciální aplikace; nové reagenty lze nalézt v katalozích firem (Pierce) Imobilizace na amlnoskuplnu nejjednodušší je aktivace aminoskupiny vhodným bifunkčním činidlem, pak reaguje svou druhou reaktivní částí s vhodnou povrchovou skupinou navazované biomolekuly (B) používá se glutaraldehyd, který je běžně dostupný a dostatečně reaktivní; inkubací (0.5 až 5% vodný roztok, 0.5 až 2 hod) s povrchem se vytvoří Schiffova báze a po promytí pak je druhá volná aldehydová skupina k dispozici pro stejnou reakci s aminoskupinou biomolekuly 0=CH—(CH2)3-CH=0 —NH2 NaBH4 —N=CH—(CH2)3-CH=N—(b) -► -NH-CH—(CH2)3-CH-NH- Imobilizace pomocí glutaraldehydu Další bifunkční činidla pro -NH2 ■ chloranil (tetrachlor-p-benzochinon), který mimo imobilizační funkci obsahuje redoxaktivní chinonové uspořádání využitelné pro přenos elektronů mezi enzvmem a elektrodou: ■ dianhydrid kyseliny benzentetrakarboxylové nebo DIDS, trans-stilben-(4,4'-diisothiokyanát)-2,2'-disulfonová kyselina: Aromatická -NH2 skupina ■ aromatické aminoskupiny lze velice snadno aktivovat diazotací kyselinou dusitou, biomolekula se naváže přes tyrozinový zbytek: Imobilizace na karboxyskupinu ^ ^—N=C=N- CH2CH2-N© O H3C/ \—/tosyr CH3CH2—N=C=N—(CH2)3-N(CH3)2 EDC pro aktivaci se užívá reakce s karbodiimidy, které působí vlastně vázání vody při vzniku amidové, esterové či thioesterové vazby dicyklohexylkarbodiimid DCC, nevýhodou je nerozpustnost ve vodě ve vodě rozpustný je EDC, 1 -ethyl-3-(3-dimethylamin opropyl)-karbodiimid, a CMC, 1-cyklohexyl-3-(2-morfolino-ethyl)-karbodiimid methoxy-p-toluensulfonát Vazba přes NHS Pro imobilizaci citlivějších bílkovin se neprovádí přímo reakce s CDI, ale pomocí CDI a N-hydroxysukcinimidu (NHS) se připraví reaktivní a stabilní NHS derivát karboxylu ten pak reaguje s aminoskupinou např. bílkoviny, proti reakci pouze s CDI je průběh mírnější a nevznikají nežádoucí meziprodukty q nh2 —cooh + ho-J-► —cs ^ » _c* nhs nh- o Aktivace pomocí NHS TSTU 0-(N hydroxy-sukcinimidyl)-N,N,N',N'- 9 tetramethyluronium tetrafluoroboritan ^Jl n(ch3)2 inkubací (vDMF) s ekvimolárním [ N—O—c',^ množstvím karboxylu poskytne ^/ nn(ch3)2 NHS derivát přímo \> TSTU Metoda směsných anhydridů využívá aktivaci pomocí isobutylchloroformiátu, který aktivuje karboxyskupinu na reaktivní anhydrid a ten pak umožňuje vznik amidové vazby: —COOH + Cl—C-O—iBu-► —c ——^—► —Cs 0- O No snh—^) co2 Aktivace přes směsný anhydrid NQ—iBu isoBuOH 0=C 0°2 Adsorpce biomolekul ■ jednoduchá a levná metoda probíhající za mírných pracovních podmínek ■ bílkoviny se adsorbují v náhodné orientaci, přitom může docházet ke konformačním změnám, které mohou (negativně) ovlivnit funkční vlastnosti ■ adsorpce bílkovin na pevný povrch bude záviset na: - vlastnostech proteinu: velikost, hmotnost, difúzni koeficient, rozložení nabitých / hydrofilních / hydrofobních / redoxaktivních skupin, konformační stabilitě - povrchovém napětí a náboji, hydrofobnosti / hydrofilnosti povrchu, stupni hydratace a struktuře hydratované vrstvy, přítomných funkčních skupinách - pH, iontové síle roztoku, přítomnosti interagujících aditiv - dalších parametrech - teplota, „inkubační geometrie" - poměr objemu přidaného roztoku a velikosti povrchu, hydrodynamice -míchání, třepání,... Sol-gel matrice ■ sol-gel proces - vznik „skla" hydrolytickou polymerací monomole-kulárních prekursorů (CH30)4Si tetramethyl-o-křemičitan (TMOS): (CH30)4Si + H20 (CH30)3Si-OH + CH3OH 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-0-Si(CH30)3 + H20 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-g+-Si(CH30)3 + OH" biomakromolekula gelovatění SixOy(p-OH)z(t-OH)4x.2y.2z gel sol zachycení v pórech J stárnutí a vysychání SixOy + zH+ + (2x-y-z) H20 xerogel (mech. stabilní) hydroxyskupiny pro imobilizace na povrchy modifikované sacharidovou vrstvou (nejčastěji dextran), která dodává hydrofilní vlastnosti zvyšující biokompatibilitu epichlorhydrin - na oxiranový cyklus se mohou adovat biomolekuly prostřednictvím amino či hydroxyskupiny: Cl CH2-CH2-CH2 Epichlorhydrin —OH ---► -0-CH2-CH2-CH2 O triazinová metoda využívá kyanurchlorid a zejména jeho méně reaktivní deriváty (X substituent 0-CH,-COOH či NH-CH2-COOH) Cl Cl H2N—(bS N—< N- .x —OH +CI—N —K)—^ N N=^ N= X Aktivace kyanurchloridem Bromkyanová metoda klasickým činidlem aktivace polysacharidových materiálů je použití bromkyanu, jeho nevýhodou je vysoká jedovatost reakce s hydroxyly probíhá v alkalickém prostředí, rozsah aktivace je úměrný koncentraci činidla meziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou biomolekuly za vzniku různých derivátů: -OH -OH BrCN r -CN -OH v. NH —o C=NH H2N— _^ —O-C-NH— —O —O —OH >=N-0 —O-C-NH—^) derivát isomočoviny + —O N-substituovaný imidokarbonát —OH N-subst. karbamát Aktivace brom kya nem Oxidace jodistanem ■ sacharidové materiály obsahující diolové uskupení je možné za mírných podmínek oxidovat jodistanem, přitom vzniklé aldehydové skupiny reagují s aminoskupinami biomolekul za vzniku Schiffových bází ■ tato reakce je použitelná i pro aktivaci bílkovin nesoucích postranní sacharidové zbytky, ale například také pro RNA Oxidace diolového uskupení jodistanem ■ lze využít i pro aktivaci hydroxylu po připojení glycidolu: Amidoskupina ■ především v polyakrylamidu ■ alkalickou hydrolýzou (zahřívání 60 °C, pH 10.5, NaHCOs a Na2COs) lze převést na karboxylovou skupinu ■ hvdrazinolvza vedoucí k hydrazidu kyseliny, který se kyselinou dusitou převede na reaktivní azid kyseliny ■ zahřívání polyakrylamidu v bezvodém ethylendiaminu povede k substituci a získá se koncová aminoskupina Thioskupina ■ umožňuje reverzibilní imobilizaci bílkovin s volnými cysteinovými zbytky, vazba vznikne oxidací a přeruší se redukcí: —^ ferri kyanid —sh(b)-sh 4 ► __s_s__^b) cystein Imobilizace přes affinitni komplexy ■ nevzniká kovalentní vazba, ale navázání cílové biomolekuly se děje prostřednictvím velmi pevné nebo jinak výhodné afinitní interakce: ■ biotin - avidin (streptavidin) ■ protein A (G, L) - molekula imunoglobulinu ■ boronátové komplexy ■ metaloafinitní komplexy s histidinovými zbytky Biotin / Avidin D-biotin X hn nh ho velmi pevná interakce, KD = 1.3 x 1015 M odolnost komplexu - stabilní v 8 M guanidinu při pH 5, disociuje až při pH sníženém na 1.5 avidin - tetramer (4x16.4 kDa), každá podjednotka má vazebné místo pro biotin, glykoprotein, pl 10, izoluje se z vaječného bílku streptavidin - obdobná struktura (tetramer 4x15 kDa), strukturně odlišný od avidinu, pl 5-6 - menší celkový náboj - méně nespecifických interakcí, ze Streptomyces avidinii široce používáno pro přípravu konjugátů, značení a imobilizace Reverzibilita komplexu ■ interakce mezi biotinem a avidinem za normálních podmínek nelze přerušit ■ imobilizace různých biotinylovaných biomolekul na avidinovaný povrch ■ nitroavidin - připraví se nitrací tyrosinových zbytků v avidinu (volný nebo imobilizovaný) pomocí tetranitromethanu ■ interakci mezi biotinem a nitroavidinem lze narušit nadbytkem biotinu nebo při pH 10 Biotinylace - lysin, ev. jiné -NH2 1.35 nm x 2.24 nm Biotinylace -SH R-SH maleimido-propionylbiocytin o K HN' NH R-S N-[6-(biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid 9 R SH biotin-HPDP HN NH R S S ■ ■ ■ Biotinylace sacharidů biocytin-hydrazid o II po oxidaci jodistanem hn nh na aldehvd s CDI účinkuje i na Asp a Glu Biotinylace Tyr, His diazobenzoyl-biocytin U hn nh cooh 24 Boronátové komplexy HO OH A HO OH HO HO HOn kyselina boritá je schopna vytvářet komplexy se sloučeninami obsahujícími diolové uskupení - sacharidy, qlykoproteiny možnost využití pro reversibilní imobilizaci biomolekul pomocí kyseliny m-aminofenylborité (APBA): OH ■ nejznámější je možnost měření hladiny glykosylovaného hemoglobinu Boronátové komplexy (Versal inx) velmi silnou komplexaci mezi kyselinou fenylboritou (PBA) a salicylhydroxamovou (SHA) využívá firma Prolinx pro generický způsob imobilizace biomolekul či tvorbu biokonjugátů: ho. /oh -oh b SHA je obvykle kovalentně navázána na povrch sensoru a PBA (nebo diboritá varianta PDBA) je dostupná v preaktivované formě pro modifikaci biomolekul: oh o o ho ho oh PDBA-X-NHS Imobilizace IgG přímá kovalentní imobilizace IgG můž vést díky nevhodné orientaci k málo aktivním povrchům: <^ É ^ Fab Fab Fc Protein A end-on side-on top-on orientované Protein A - isolován z buněčné stěny Stafylokoka, Mr = 42 kDa má silnou afinitu k Fc části imunoglobulinů (do jisté míry závisí na původu Ig) - 4 vazebná místa pro Fc orientovaná imobilizace IgG zvyšuje vazebnou kapacitu povrchu podobně fungují i protein G a protein L Metaloafinitni interakce ■ komplexotvorná reakce nitrilotrioctové kyseliny (NTA) s vhodným iotem kovu (Ni2+, Cu2+) a imidazolovým kruhem histidinových Metaloafinitni interakce ■ rekombinantní proteiny - na N nebo C konci nesou velmi často několik (5-6) histidinových zbytků - „oligohistidine tag" ■ využití při purifikaci a při imobilizaci na povrch sensorů ■ snadná obměna ligandů - komplex se rozruší EDTA nebo imidazolem ■ „přidání" povrchových His skupin k bílkovinám - např. oxidace sacharidových zbytků jodistanem a pak navázání His, stabilizace Schiffových basí redukcí Langmuir-Blodgett technika amfifilní molekuly (surfaktanty, fosfolipidy) utváří orientovanou monovrstvu na rozhraní vody a vzduchu (Langmuirův film) uhlíkatý řetězec (CH2)n Air - pro n«12 vznikají micely - pro n»12 vznikají krystaly struktura filmu se ovlivní kompres Trougli ■.vith subphase Area/molecule (A1) \ť\i\<\\/\\ mm Přenos LB filmů typ LB filmu určují: složení subfáze, teplot povrchové napětí při depozici rychlost depozice typ povrchu, doba inkubace ve vzduchu a v subfázi způsob nanášení: - up (vynořování) - down (ponořování) irwnollyer wi llquid Hjrfa:! W \ \ \ P-SäJ-'ŕ-lili ■a, hcjd-io-h«J X*ype on i hydroptitibit V-LfiJt an i bydrophihc t-r"_-c LB filmy ■ lze použít prakticky pro jakýkoliv typ pevného substrátu ■ přesná kontrola tloušťky nanášené vrstvy ■ homogenní struktura i pro rozměrné plochy ■ možnost vytvářet multivrstevné struktury s různými typy jednotlivých vrstev Lipidové membrány (BLM) hydrofilní protein zakotvený přes hydrofobní část integrální struktura biomembrány lipidová dvojvrstva amfifilní molekuly 29 Biochemický spínač Princip: volná disociace podjednotek gramicidinu v lipidové dvojvrstvě umožňuje jejich asociaci, vedoucí k funkčnímu iontovému kanálku Afinitní převodník afinitní komplex (bez pohybu) nový komplex vzniky. - horní podjednotka\/ je uvolněna OFF + volný analyt ON Příklad kompetitivního stanovení na bázi biochemického spínače