Technologické aspekty biosensoru ■ miniaturizace ■ nanotechnologie ■ nanobiotechnologie ■ nanobiosensory Co to je nanobiotechnologie Nanotechnologie zkoumá a vyvíjí struktury, které alespoň v jedné z dimenzí mají velikost od desetin po stovky nanometrů (nanočástice, nanodráty, nanovrstvy) Nanobiotechnologie využívá biologické nanosystémy (biomolekuly, proteiny, nukleové kyseliny, vícemolekulární komplexy, viry, buněčné komponenty,...) v technických systémech. Používá nanotechnologické postupy při zkoumání biologických systémů, s cílem získat informace obtížně dostupné „klasickými" technikami. 1 Studium biopovrchů I 10 N 103 I 10»- H TEM i 10 1 1 E SIMS SPM ÄES-SAM I NRA RBS TOF- I SIMS . XRFA XPS GD-MS + ISS 10 100nm 1 10 100|jm laterální rozlišení (x-y) 10mm SPM TEELS AES Auger electron spectroscopy EPXMA Electron probe X-ray microanalysis GDMS Glow discharge masss pectrometry ISS Ion scattering spectroscopy PIXE Proton-induced X-ray emission RBS Rutherford back-scattering spectrometry SAM Scanning Auger microscopy XPS SIMS Scanning probe microscopy Transmission electron energy-loss spectroscopy TEM Transmission electron microscopy TOF-SIMS Tlme-of-fllght secondary Ion mass spectrometry X-ray photoemlsslon spectroscopy Secondary Ion massspectrometry XRFA X-ray fluorescence spectroscopic analysis Principy SPM a AFM Scanning tunneling microscopy 1982 (G. Binnig, H. Roher) tunelování elektronů mezi hrotem próby a vodivým povrchem I ~ V exp(-A01/2d) Atomic force microscopy 1986 (G. Binnig, C. Quate, C. Gerber) Lenard-Jonesův potenciál vhodné pro nevodivé povrchy a měření přímo v kapalinách aplikace V —> I kantilever y s hrotem 2 SPM (scanning probe microscopies) í SCMV meziatomové síly tunelový efekt W/ metali Yw/ insulate SThlVKY metaio metali nsulator optic. metal2 vláknd SNOM kapacitance D vodivost (ionty) termočlánek 3 STM scanning tunelling microscopy H ]; i Áa i \

Phase Imaging mode s Semicontact Error mode Usage of SFM with oscillating cantilever was firstly anticipated by Binnig. Relatively small shift of cantilever oscillating frequency with sensing repulsive forces means that contact of cantilever tip with sample surface under oscillation is not constant. Only during . small part of oscillating period the tip "feels" contact repulsive force. Scanning sample surface with cantilever oscillated in this manner is not non-contact, but intermittent contact (semicontact). Non-Contact techniques: a Non-Contact mode s Frequency Modulanion mode The Non-Contact AFM (NC AFM), invented in 1987, offers unique advantages over other contemporary scanning probe techniques such as contact AFM and STM. The absence of | repulsive forces (present in Contact AFM) in NC AFM permits it use in the imaging "soft" samples and, unlike the STM, the NC AFM does not require conducting samples. Porovnání obou modů ■ kontaktní {- velká rychlost skenování - relativně snadné dosažení „atomárního" rozlišení ' - účinkem laterálních sil může docházet k deformaci zobrazovaných objektů - ve vzduchu se mohou projevit výrazně kapilární síly (kolmé na směr interakce hrot-vzorek) - zhoršené rozlišení - poškození měkkých povrchů „poškrábáním" (u bioobjektů) > ■ nekontaktní (semikontaktní) - vyšší laterální (xy) rozlišení (1 až 5nm) - menší síly a menší poškození měkkých objektů na vzduchu - eliminace laterálních interakcí - nízká rychlost skenování Au nanočástice ■ slída (mica) silanizovaná thiol-modifikovaným silanem AFM DNA BioScope (zvětšení až 107x) EcoRI v komplexu AFM bakterie celulosa napadená bakterií Pseudomonas putida 8x8 um 5x5 um max. výška 500 n m AFM nukleových kyselin ■ DNA z telecího brzlíku na slídě modif. Mg 16 kolagen typu l-lll, vpravo zvětšeno a přebarveno IgG detaily Atomární rozlišení jednotlivé vrstvy atomů uhlíku v orientovaném pyrolytickém grafitu Difrakčni limit optických tecnik R / > < ~~1 n •/ 2 n ■ světlo má vlnovou povahu, díky difrakci je bod zobrazován ne jako bod, ale jako soubor koncentrických kruhů s vyšší a nižší intenzitou ■ minimální vzdálenost R pro rozlišení dvou blízkých bodů je asi polovina vlnové délky světla ■ reálně to je kolem 150-200 nm pro viditelné světlo Efekty blízkého pole předchozí neplatí, pokud se zobrazovaný objekt nachází v blízkosti štěrbiny mnohem menší než je vlnová délka světla - vzniká tzv. blízké pole - SNOM technika (scanning near field optical microscopy, nebo taky NSOM) Základy SNOM "sub-wavelength" štěrbina se přiblíží na několik nm k povrchu vzorku generované fotony jsou zachyceny detektorem bod po bodu se skenuje 2D obraz povrchu s rozlišením kolem 1 nm. Optické vlákno jako štěrbina high intensity light is being transported for long distance within an optical fiber due to total internal reflection between the core and the cladding. Tip etching followed by metal coating forms aperture-like structure with a width of tens nm. Shear-force feed-back control probe vibrates at resonance frequency of quartz tuning-fork. Amplitude and phase of such vibration significantly change when the probe tip arrives the closest proximity of the object surface. Feed-back control mechanism fixes parameters of new state providing precise height positioning of the tip. Thus sear-force topography image of the surface can be obtained simultaneously with near-field optical one. SNOM B NT-MDT SNOM: a Shear Force Microscopy cd Transmission mode S3 Reflection mode sd Luminescence mode Scanning Near-Field Microscopy (SNOM) The resolving power of classical optical microscopes is restricted by Abbe's diffraction. However, it is possible to overcome this limit. If a subwavelength hole ; in a metal sheet is scanned close to an object, a super-resolved image can be built up from the detected light that passes through the hole. Scanning near-field microscopy based on this principle was first proposed by Synge in 1928. Sledování biointerakcí Nanobiosensor SPM biosensor raménko biorekogniční prvek analyt charakterizace povrchů biosensorů hrot je možné modifikovat imobilizací vhodných biorekogničních molekul, čímž dostáváme biosensor teoreticky schopný detekovat jednotlivé molekuly analytu tento postup byl použit pro přímé měření síly potřebné k přerušení některých bioafinitních interakcí „roztržením" existující vazby; některé výsledky jsou shrnuty v tabulce. „Force-distance" křivky hrot se pohybuje pouze vertikálně v ose Z bez skenování v X-Y ploše výchylka je zaznamenávána jako funkce posunu Z měří se přibližovací a odda-lovací fáze: A kantileverse nedotýká povrchu, pohybuje se volně a necítí žádnou sílu bez deflekce B přibližuje se k povrchu a dochází ke „kontaktnímu saltu" při nástupu přitažlivých sil C došlo ke kontaktu s povrchem, zvětšuje se výchylka D po dosažení konečné stabilní síly je proces obrácen. V průběhu oddalování je nutné překonat adhezi a hysterezní síly E v tomto bodě jsou překonány adhezivní síly a kantilever je volně nad povrchem. - Tato vzdálenost je důležitým parametrem křivky. Ligand-receptor vazebné probe tip spacer e.g. PEG ligand receptor KM approach binding force retraction V Tip-sample distance y y y y y y Specific binding ki ki kJ S y> s> y> S S Non-specific binding v přítomnosti specifické interakce je pro "přetržení" vazby potřeba přídavná síla takto změřená síla charakterizuje danou biointerakci Spectroskopické techniky I NT-MDT tip-sfmple interaction model Approach Retraction Spectroscopies: e> Force-distance curves CD Adhesion Force microscopy CD Amplitude-distance curves s Phase-distance curves s Frequency-distance curves s Full-resonance Spectroscopy SFM can be used not only as tool for topography acquisition. SFM can also be used as a tool for force spectroscopy -measuring forces as a function of distance. For oscillating cantilever tip-sample force can affect some other characteristics of cantilever oscillation - amplitude, frequency, phase, dissipation etc. Correspondingly dependence of these characteristics upon tip-sample distance can j also be regarded as spectroscopic data. AFM - biotinylovaný hrot MAC Mode AFM and TREC images with biotin modified tip of (a) topography and (b) recognition of avidin on mica. (c) topography and (d) recognition images of the same sample taken after streptavidin was added to the solution. The avidin molecules are not recognized because the biotin tip is blocked Interakční síly změřené AFM Interakce Síla AG (pN) (kJ/mol) AH (kJ/mol) avidin - biotin 160 ±20 60 90 streptavidin - biotin 260 ± 120 77 134 anti biotin IgG - biotin 240 ± 20 variabilní variabilní (ACTG)5 - (CAGT)5 1500 ±200 117 430 Intermolekulové adhesní síly změřené pomocí AFM porovnané s volnou energií a reakční entalpií pro typické afinitní interakce Mikrokantilevry jako biosensory mechanický převodník - ohýbá se v důsledku rozdílného povrchového napětí na protilehlých stranách Diferenciální měření kantilevry modifikované albuminem a Proteinem A Integrovaný mikrobiosensor ■ piezorezistivní kantilevry -bez optického systému ■ průtočná cela s několika integrovanými kantilevry ■ multikanálové měření ■ miniaturizace ■ masová produkce ■ pohled dovnitř cely před zakrytím horním těsnícím dílem zboku a shora Scanning Probe Lithography Self assembled monolayer of PTCDA (3,4,9,10-perylenetetracarboxylic dianhydride) ______ AFM dip pen lithography AFM Tip Molecular transport Writing direction Molecular Patterns generated via Dip-Pen Nanolithography Specific binding of nanostructures o $ $ $ $ $ $ $ i! i! il I I |! i! a a a a a a a if if if if if if if 28 CDU ■ iáki E NT-MDT Lithographies: = AFM Oxidation Lithography s STM Lithography Q ATM Lithography - Scratching E AFM Lithography - Dynamic Plowing AFM atomy atomy xenon na Ni (110) substrátu ■ D.M. Eigler, E.K. Schweizer. Positioning single atoms with a scanning tunneling microscope. Nature 344, 524-526 (1990) 29 SPM - Interdisciplinární aplikace ■ molekulární a buněčná biologie, virologie ■ studium polymerů ■ mikro- a nanoelektronika ■ základní výzkum ve fyzice a chemii povrchů ■ nanotechnologie ■ nanobiosensory ■ navštivte nás: A4 laboratoř O.60 (suterén) http://biosensor.chemi.muni.cz/nanobio Proba = mikroelectroda měřící elektroaktivní látky, pohybuje se přes skenovaný povrch (X -Y) v konstantní vertikální vzdálenosti (Z ~ 15 um) SECM Scanning electrochemical microscopy Způsoby činnosti: generující substrát (např. oxidasa --> H202) indikátory - Ru[(NH3)6]2+ II Red U O Ox zpětná difúze --> nárůst I