Souhrn předchozí přednášky •protein-proteinové interakce (ineraktom, příklady) • • • • • • • • •podobné síly/principy jako při skládání proteinů •interakce stabilní i dočasné … poriny Interakce mezi: šroubovicemi (coiled-coil) žlábkem a strunou komplementárními povrchy + polá hydrofob rní ní - –Proč skládat makromolekuly z menších (pod-)jednotek? –Velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací –Menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) –Skládání (i rozpad) komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí tj. nízká energie (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) –Komplexy mohou být – dynamičtější (flexibilita) 220px-Sucrose_porin_1a0s bakteriální toxin porin v mitochondrii gen -> protein -> interakce -> komplex -> superkomplex … (molekulární stroj) -> kompartment -> buňka … genom -> proteom -> interaktom -> komplexom -> … fenom (funkce v buňce -> funkční znak v mnohobuněčných organismech) ~800 komplexů v S.c. Bertero et al, Cell, 2010 File:Animal mitochondrion diagram cs.svg - vnější membrána představuje první bariéru s poriny (beta barely) a TOM komplexy - v mezimembránovém prostoru je zastoupen hlavně cytochrom C a kinázy - vnitřní membrána má kristy (velká plocha) s TIM komplexy, enzymy dýchacího řetězce a ATP syntázou - hustá matrix obsahuje enzymy Krebsova (citrátového) cyklu, ribozomy a mtDNA (kóduje pár vlastních enzymů) 220px-Sucrose_porin_1a0s porin Figure 12-24. Three protein translocators in the mitochondrial membranes. Figure 12-26. Protein import by mitochondria. Alberts MBoC, 2002 220px-Sucrose_porin_1a0s porin Soubor:Mitochondrial electron transport chain—Etc4.svg Kotvený komplex I: NADH-Q-oxidoreduktasa (ubichinon-reduktasa)- vstup NADH+H+ Kotvený komplex II: postranní vstup pro FADH2 ze sukcinátdehydrogenázy Kotvený komplex III: cytochrom-c-reduktasa (ubichinol:cytochrom c oxidoreduktáza) Kotvený komplex IV: cytochrom-c-oxidasa Soubor:NADH Dehydrogenase 2FUG Electron Carriers Labeled.png Komplex I víc jak 30 podjednotek (7 genů je na mtDNA) Cytochrome_bc1_complex Complex_III V komplexu III se nachází čtyři redoxní centra, cytochrom b562, cytochrom b566, cytochrom c1 a konečně tzv. Rieskeho protein (obsahující FeS centrum Fe2-S2) 11 podjednotek (dimer) (cytochrom b je na mtDNA) Cytochrom bc1 komplex (též komplex III, kód EC 1.10.2.2) je ubichinol:cytochrom c oxidoreduktáza, tedy oxiduje ubichinol (čili koenzym Q) a redukuje cytochrom c Cytochrome_C_Oxidase_1OCC_in_Membrane_2 Cytochrom c oxidáza (též COX, komplex IV, kód EC 1.9.3.1) tedy oxiduje cytochrom redukce kyslíku na vodu 8-12 podjednotek (3 nejhydrofobnější jsou syntetizovány přímo v mitochondrii) homodimer 290px-Complex_IV Soubor:Cmplx4.PNG V komplexu IV se nachází čtyři redoxní centra, 2x heme a, 2x Cu centra Soubor:Mitochondrial electron transport chain—Etc4.svg Kotvený komplex I: NADH-Q-oxidoreduktasa (ubichinon-reduktasa)- vstup NADH+H+ Kotvený komplex II: postranní vstup pro FADH2 ze sukcinátdehydrogenázy Kotvený komplex III: cytochrom-c-reduktasa Kotvený komplex IV: cytochrom-c-oxidasa Vytváří se gradient H+ ATPsynthase „ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor – „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 F0 je protonový motor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu. Tento rotor je spojen s druhým F1 chemickým motorem poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP). Oba motory jsou spojeny statorem. ? ? PDB: 1c17:A Image Rastogi & Girvin, Nature, 1999 pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. Přesný mechanismus není jasný ATP syntasa – ukázka kompletní struktury – ve skutečnosti se točí „modré“ části a modulují „červený“ generátor Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 F1-rasmol Při otočce osa tlačí na F1 motor (3 různé konformace) – levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP - pravý panel = ATP molekula byla vytlačena Alberts MBoC, 2002 + Mitochondrie od BioVisions gen -> protein -> interakce -> komplex -> superkomplex … (molekulární stroj) -> kompartment -> buňka … genom -> proteom -> interaktom -> komplexom -> … fenom (funkce v buňce -> funkční znak v mnohobuněčných organismech) ~800 komplexů v S.c. Bertero et al, Cell, 2010 Replikace DNA (video): DNA helikasa “denaturuje” dvoušroubovici (modrá) – připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové) spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován (RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty). PCNA zvyšuje procesivitu DNA polymerás Kelch et al, BMC Biol, 2012 Clamp loader – RFC-PCNA Kelch et al, BMC Biol, 2012 150-SlidingClamps_3u5z_open Clamp sliding – PCNA-Pold click me click me Po skončení syntézy „lagging strand“ metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) odštěpí RNA primer (demetylace a fosforylace disocuje Fen1) Poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí cukrfosfátovou kostru Zheng L , Shen B J Mol Cell Biol 2011;3:23-30 PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1 150-SlidingClamps_1ul1 Model for post-translational modifications that mediate the interaction between FEN1 and PCNA, and thus regulate the dynamic actions of FEN1 in processing of Okazaki fragment maturation. The Pol δ/PCNA complex drives the gap filling and formation of the flap structure in Okazaki fragment mutation. Methylated FEN1 is recruited to the replication fork by interacting with PCNA, replacing Pol δ. Methylation of FEN1 ensures its interaction with and stimulation by PCNA to remove the flap structure. After DNA flap cleavage, FEN1 undergoes de-methylation and subsequent phosphorylation, leading to FEN1 dissociation from the DNA nick. DNA Lig I is then recruited by interaction with PCNA and seals the nicks between the two Okazaki fragments. Figure 3. PCNA – regulace buněčného cyklu p21 je upregulován nádorovým supresorem p53 Maga et al, FASEB J, 2004 Figure3E Freudenthal et al, NSMB, 2010 Pokud je DNA poškozená, pold se zastaví a je třeba poškození nejdříve opravit – jednou z možností je „zastoupení“ jinou polymerásou, která poškozené místo „toleruje“ a překopíruje (translesion synthesis) – přepíná se ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) - TLS polymerasy (h, i, k) obsahují PIP a UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA Bergink & Jentsch, Nature, 2009 Sale et al, JCS, 2012 Oprava DNA: PCNA-ptm TLS polymerasy (h, i, k) obsahují UBM (správně přečtou chybu a zařadí správnou bázi) Srs2 (antirekombinása) obsahuje SIM (nedovolí rekombinaci v průběhu replikace) Template switch The PCNA switchboard in S. cerevisiae: regulation of competition between bypass pathways. The DNA sliding clamp PCNA is a trimer, but for clarity only one subunit is shown as being modified. In practice, the PCNA trimer could have three different modifications simultaneously, either the same modification on all three subunits or any combination. PCNA can be modified at K164 with either ubiquitin, which is added by Rad6 and Rad18, or by SUMO, which is added by Ubc9 (the SUMO E2) and Siz1 (a SUMO E3 ligase) (Ulrich, 2009). Monoubiquitin facilitates the recruitment of the TLS polymerases to PCNA through interaction with the ubiquitin-binding domains found in Rev1 and Rad30 (polη) and hence promotes TLS (Bienko et al., 2005). Alternatively extension of the monoubiquitin with a K63-linked chain promotes template switching by a poorly understood mechanism (Hoege et al., 2002). SUMOylation of PCNA at K164 in S. cerevisiae, recruits the antirecombinogenic helicase Srs2 that displaces Rad51 from single-stranded DNA and prevents the initiation of classical recombination (Papouli et al., 2005; Pfander et al., 2005). SCJ, sister chromatid junction. fig2 Tsurimoto, FiBS, 1999 Maga et al, FASEB J, 2004 Naryzhny, CMLS, 2008 PCNA-pold fills gaps formed during DNA repair (BER, NER, MMR, HR) Shrnutí •Proteiny mohou být součástí jednoho nebo více komplexů (dynamické) • •Stabilní komplexy –Podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost) –stabilní komplexy disociují proteolyticky –pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles hladiny ostatních podjednotek •Dynamické komplexy –Interakce podjednotek dynamických komplexů jsou modulovány např. posttranslačními modifikacemi CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů (v jarním semestru) Doc. Jan Paleček