proteomika
GENOMIKA PROTEOMIKA
jan havliš
: masarykova univerzita :: středoevropský technologický institut ::: mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin
:: přírodovědecká fakulta, ústav experimentální biologie ::: oddělení funkční genomiky a proteomiky
O)
Creative Commons: Uveďte autora-Neužívejte dílo komerčně-Zachovejte licenci 3.0 Česko License
1
proteiny (II.)
: vznik proteinů a jejich složení
: vlastnosti proteinů :: velikost a tvar, polarita, náboj, reaktivita :: základní hierarchie struktury proteinu
: transport a lokalizace
: zánik proteinů
expresní a diferenční proteomika (III.)
: jak studovat proteom? : z čeho se proteom skládá? : kolik tam toho je? : a co na to má vliv?
proč proteiny?
: stojí mezi genotypem a fenotypem
: oddřou většinu práce v živém organizmu! :: metabolizmus, regulace, obrana, transport, struktura a pohyb
genom
: v zásadě statická entita
:: změny spise nežádoucí : relativně jednoduchý
proteom
: dynamický systém
:: radikální změny se změnou času a podmínek : složitý systém
F-aktin
nukleozom
DNA
oooo
aktivátor
hemoglobin
buňka § (erytrocyt)
4
protein/peptid ~ bio(hetero)polymer
: monomer - aminokyselina :: biogenní aminokyseliny (L-formy)
a-amino-skupina
bocni řetězec
a-karboxy- H skupina
HJM
obojetný ion
(zwitter-iorí)
vztah mezi pKa a pH u aminokyselin (a peptidů/proteinů)
pí, izoelektrický bod celkový náboj
aminokyseliny (AK) : bežne
:: Ala/A, Arg/R, Asp/D, Asn/N, Cys/C, Glu/E, Gln/Q, Gly/G, His/H, Ile/I, Leu/L, Lys/K, Met/M, Phe/F, Pro/P, Ser/S, Thr/T, Trp/W, Ty r/Y, Val/V
: zvláštni značky
Asx/B asparagin nebo asparagová kyselina Glx/Z glutamin nebo glutamová kyselina Xle/J leucin nebo izoleucin
C( M)
. T h3n-c-h
r>_ H
coo coo
.1 .1
H,N-C-H H,N-C-H
A  ČH*   v /°"
V chs ch,
COO
. T
H»N-C-H
<fH>
CHa CH3
coo coo H*n-c-H     H3Ň—c—H
Mh—Č—ch3
L. I
<fH2
r
CH,
K
COO
. i
HjN-C-H g CH,OH
COO ll N c fl	COO . 1 H3N-C-H
ÉH ch, ch, r. <j;-nha nh,	r r* H
COO i	coo
H.N-C-H HjŇ-C-H h-c-oh j&h, T     Ah,       C sh	
c
hm' ^ch,
h,c-ch,
N
coo			COO	
-C-H	H	3N-	C-H CH2 *	
CH2				
COO		E	CH2	
			j m COO	
	coo		coo	
11 x	C-H		IUN-C-H	
	CH,			;h,
HjN'	K		í	:h, 1
		Q	y % h,n O	
c< >o
• I
HaN-C-H CH,
Ô
klasifikace AK
:: kyseliny a jejich amidy ::: Asp/D (pK = 3.7), Asn/N, Glu/E (pK = 4.3), Gln/Q
:: alifatické :::Gly/G, Ala/A, Leu/L, Ile/I, Val/V
:: aromatické ::: Tyr/Y, Trp/W, Phe/F
:: báze
::: His/H (pK = 6.0), Lys/K (pK = 10.5), Arg/R (pK = 12.
:: cyklické ::: Pro/P (pK = 11.0)
:: hydroxyderiváty ::: Ser/S, Thr/T + Tyr/Y (pK = 10.0)
:: sirné
::: Cys/C (pK = 8.2), Met/M
vzácné
:: Sec/U selenocystein, Pyl/O pyrrolyzin (prokaryota) :: AK vzniklé posttranslační modifikací (PTM) ::: hydroxyprolin a selenomethionin
abiogenní aminokyseliny :: genetický kód 2.0 ::: syntetické aminokyseliny do syntetických proteinů ::: bioinženýrství
alifatické
multifunkční struktura aminokyselin
: C-konec; kyselý
:: =^> záporný náboj/polární : N-konec; zásaditý
:: =^> kladný náboj/polární : boční řetězec
:: široký rozsah vlastností
ovlivnění fyz.-chem. vlastností
a struktury proteinů a peptidů
vysoká variabilita
: složité chování : širší spektrum metod studia absorbance (UV), fluorescence náboj, polarita, Mr 3D struktura reaktivita, interakce
velmi malé
malé
nepolární aromatické
polární
nabité
kladně nabité
10
vznik peptidů/proteinů
: proteiny :: biosyntéza
::: transkripce (DNA > mRNA)
::: translace (mRNA > protoprotein)
::: posttranslační změny (protoprotein > funkční protein)
5'-UTR | začátek transkripce
DNA
ukončení | T-UTR
31
exon 1     intron 1
exon 2
intron 1
exon 3
transkripce I
pre-RNA
1 GU
AG
GU
AG
sestřih RNA
mRNA
5^-čepička (^J) 1 2
poly(A) konec
a biosyntéza
::: in vitro syntéza (NCL - native chemical ligation)
íi
schéma transkripce
negativníř.
HTTTTT I I I I I I I I > ^^^^^^^^^^ 7
transkripce-► 3*
RNA polymeráza
dvoušroubovice DNA
splétání pozitívníř.
rozpletaní
12
vznik peptidové vazby
peptidová vazba
H
i
0
H I
+H3N-C-C
I \
+H3N-C-[CJ-
0
O
N
aminokyselina 1
R2 O" aminokyselina 2
dipeptid
H
I //
c-C
i \
y ŕ_<L
význam peptidové vazby
: primární sekvence proteinů (oligopeptidy, polypeptidy) : podílí se významně na sekundární a terciární struktuře :: rotace kolem jednoduchých vazeb
Oligopeptid
Rx - Rn : tzv. aminokyselinové zbytky {amino acid residues) i-li-li-1 I-
N-konec
(N-terminus)
hhN
	H 1	H	0 n				H 1	H	0 II	
	N		c.	N 1	1 1 H		N.	\-		** . .s"
c II		C 1				C II		C 1		N 1
0		R2		H		0		R4		H
H
coo
C-konec
(C-terminus)
vliv peptidové vazby
na sekundární strukturu proteinů
cp = -139°, i|j = -135c
cp - rotace okolo vazby N-Ca cp = 0°, y = 180( qj - rotace okolo vazby Ca-C
ar - skládaný list a, - skládaný list   pa - šroubovice   pp - šroubovice (a nti para lei ní)        (paralelní) (pravotočivá) (levotočivá)
14
další formy sek. struk.
smyčka {loop) ohyb {turrí)
náhodné klubko grandom co/7)
15
formování terciární struktury proteinu
16
utváření aktivních center v rámci terciární struktury proteinu
17
polární fční skupiny disulfidový " Povch
vodíkové můstky
stabilizace struktury
: + coulombické interakce
terciární struktura proteinu a její význam
allosterie
: změna primární struktury :: jen v genu (ne vždy)
: změna vyšších struktur :: snadno změnou prostředí
kvartérní struktura proteinu a její funkce
ß-skladany list
nefunkční monomer proteinu
a-šroubovice
funkční tetramer proteinu
formování
: kooperativní vazba : allosterie
holoenzym
: různé fee podjednotek
kvartérní struktura
vs
proteinový komplex
19
strukturní motiv a proteinová doména
: specifická strukturní podjednotka : usouvztažnění struktury a funkce
:: doména je funkční podjednotka : topologie proteinu
:: celkový tvar a napojení domén; rodiny a nadrodiny
(fylogenetické)
20
neribozomální peptidy
: bakterie, houby a nahožábří
: syntéza nezávislá na mRNA :: cyklické, větvené :: neproteinogenní AK :: časté PTM
::: N-metylace, N-formylace, glykosylace, acylace, halogenace nebo hydroxylace :::: dehydratace serinu na dehydroalanin
::: cyklizace
:::: oxazoliny a thiazoliny
: často dimery a trimery identických sekvencí :: lineární, cyklické, větvené
: toxiny (antibiotika), siderofory nebo pigmenty
21
neribozomální peptidové syntetázy (NRPS)
(nonribosomalpeptide synthetases)
: patrně odvozeno od syntézy polyketidů a mastných kyselin
: několik domén :: A - aktivační (adenylace) :: PCP - peptidový přenašeč :: C - kondenzační, bývá jich až několik (Cl, C2, C3...) :: Cy - cyklizační (často namísto domény C) :: E - epimerace na D-formy
:: R- redukce terminálního thioesteru na aldehyd nebo alkohol :: TE - thioesterová terminační doména _
22
aktivace adenylací
ATP) PP
NHo NH2
-AMP
doména A NRPS
kondenzace PCP nebo cyklizace
přenos na PCP
peptidový přenašeč
{protein carried protein)
O
PCP
aminoacyl-S-PCP
I
O HN
re-aktivace PCP 0=\
SH
S
přenos RXR2 na R3
elongace ->
PCP C     A PCP
doména C (Cy) NRPS
PCP
C A PCP peptidyl-S-PCP
23
posttranslační modifikace (PTM) proteinů
: chemická modifikace aminokyseliny :: změna bočního řetězce nebo jeho derivatizace
::: deaminace Gin, racemizace Pro, hydroxylace Phe : modifikace primární sekvence protoproteinu
::: aktivace {trimming)
::: sestřih {splicing)
: význam PTM
:: zacílení (lipoproteiny) :: stabilita (glykoproteiny) :: funkce (fosfoproteiny) :: řízení aktivity (kaspázy)
24
chemická modifikace aminokyseliny
: velké množství (> 200)
: nese funkci, ale nemusí (oxidace Met, Trp)
(CH2) 3
zesíťo vá n í (cross-linking) : vznik můstků (S-S) : stabilitní funkce
N
(CH.)
4x Lys
elastin
4xTyr pulcherosin
3x Lys kolagen
25
pyroglutamyl-acetyl-formyl-myristoyl-
V
H3N
®
eooc
oligosacharid (O-glykosylace)
V
OH
i
Ser, Thr
oligosacharid (N-glykosylace)
CONH2 Asn, Gin
A
4-hydroxy-(> Tyr)
fosforyl-
metyl-
y-karboxy-
Y
COO0
Asp, Cl li
\=/
acetyl-metyl-y-hydroxy-
v
pyridoxal
liponat
biotin
retinal
ubiquitin
®NH3 Lys
Cys
SH
Pro
3- hydroxy-
4- hydroxy-
aktivace protoproteinu
: odstranění signálních pep. : odstranění nefunkčních č.
preproenzym >
proenzym > enzym
27
proteinový sestřih
: podobné jako u RNA (pre-RNA > mRNA)
i-1
N-extein
N > O/S přesun acyl
inteirTp^
■lí
HX = HS-, HO-
hx
I^nii.. C-extein
iix
trans-thioesterifikace
1
tvorba sukcinimidu 0/S>N přesun acyl
o HX
transport a lokalizace proteinů
cytoplazmatická dráha sekreční dráha
standardní dráha bez signálu
©signální peptid (sekreční dráha)
/j\ signální sekvence
^ (ER proteiny)
signální skupina
(lysozimální proteiny)
fflSL^a-šroubovice
sooc-
-
-LEDK
^\  signální peptid
y)    : krátké peptidy
manoza-6-fosfát     \ |\|-, GkOneC
: intrastrukturní (sign. sekvence)
nepolární region
sekvence (4) ukončující transport
(membránové proteiny) -H
©signální peptid ŕ mifnrhnnrlriální
(mitochondrialni proteiny)
©signální sekvence (jaderné proteiny)
q signální sekvence
y.
KKRK
(peroxizomy)
©signální region (sekreční váčky)
F KS
-
3
signální region
: souhra různých strukt. motivů
: jsou rozpoznávány receptory : využití transferových proteinů
30
zánik proteinů
zánik peptidové vazby
: proteázy (proteolytické enzymy)
:: vznikají proteolytické peptidy : peptidázy (karboxy-, amino-, dipeptidázy )
:: di- a tripeptidy a dále AK : přenos energie in vitro
:: srážka (N2, He, Ar), záření (foton, e~)
©
31
metabolizmus proteinů
funkční protein
proteazom
peptidy •##)\(-~^
lysozom
degradace
aminokyseliny
: dusíková bilance
:: rovnováha
:: 300-400 g denně
: lysozom
:: cca 40 hydroláz :: proteázy
32
funkce proteazomu
33
expresní a diferenční proteomika
praktické základy
exprese proteinů a rozdíly v n í
: aktuální podmnožina proteomu definuje děje v živém systému :: jaké proteiny se aktuálně v systému vyskytují? :: kolik jich tam je? :: kde jsou?
:: v jaké formě tam jsou?
::: volné, vázané v proteinových komplexech
::: strukturní, signální, zásobní, enzymy... :: a proč?
: rozdíly v dějích v různých stavech živého systému :: podmnožiny proteomu různých stavů a jejich průnik
34
metabolom
A
regulace metabolizmu
proteom
aktuální podmnožina proteom u
- sada proteinů
posttranslační modifikace regulace translace
transkriptom
: čím je to dáno? : jak to zjistíme : co na to má vliv?
posttranskripcni modifikace regulace transkripce
genom
35
hypotéza
(biologický problém)
opakovatelný jev vs. šum předpoklad testování předpokladu
(odpovídající empirická studie)
instrumentální data model
reformulovani modelu
(nové poznatky)
analýza interpretace syntéza a možná objev ©
testovaní modelu
(odpovídající empirická studie)
instrumentální data
falzifikace justifikace
(model biologického systému)
36
základní charakteristika bioanalytů
: geny (génom)
: mRNA (transkriptom)
: proteiny (proteom)
: nízkomolekulární látky (metabolom)
: velmi široká škála fyzikálně-chemických vlastností
: jsou jich řádově desítky tisíc druhů v jednom organizmu
: jsou velmi dynamické
: metody jsou stále ve vývoji a metodika není triviální
37
identita proteinu
: čím je dána identita proteinu?
primární sekvence proteinu
: alternativní sbalení (priony) : posttranslační modifikace
terciární sekvence proteinu
: kvartérní struktura
unikátní funkce proteinu
: enzymová reakce
: interakce s jinou molekulou
38
jak můžeme zjistit identitu proteinu?
specificita
: buď vydělíme protein ze směsi jiných proteinů : nebo to jde i ve směsi (specifická interakce) :: kontaminace
separace
: už ta závisí na individuálních vlastnostech proteinu :: není ale často dostatečně specifická
: náboj, polarita, molekulová hmotnost/velikost : specifické interakce
primární sekvence
: určení pořadí aminokyselin :: postupné odbourávání ::: enzymaticky (exoproteolýza) ::: chemicky (terminálni degradace) ::: fyzikálně-chemicky (štěpení peptidové vazby)
:: hmotnostně-kombinatoricky ::: peptidové mapová n í/peptidová signatura
:: fyzikálně
::: změna odporu při průchodu řetězce nanopórem
terciární sekvence
: určení 3D struktury :: lokalizace jader/atomů ::: jaderný spin
::: difrakce záření (X) na atomech
::: kryo-elektronová mikroskopie
:: topologická analýza ::: vzdálenosti aminokyselin
unikátní funkce proteinu
: detekce unikátního produktu enzymové reakce
: detekce vzniku unikátního komplexu
: co má vliv na identitu/přítomnost proteinu? genomické vlivy pre- c
: zapiš genu donor     větvení akceptor
exon
:: mutace
: převedení genetické informace :: chyba v transkripci :: chyba v translaci
proteomické vlivy
: úpravy proteinu :: náhodné či nežádoucí modifikace AK :: náhodná či nežádoucí proteolýza
smyčka intronu
metod icko-a na lytické vlivy
: chyby v přípravě či analýze vzorku
42
forma proteinu
: čím je dána forma proteinu?
struktura
: definuje funkci a interakce :: volný
:: vázaný - kvartérní struktura, proteinový komplex
lokalizace
: definuje funkci
43
: jak můžeme zjistit formu proteinu? složení
: separace a eventuální denaturace :: molekulová hmotnost, tvar...
interakční partneři
: stabilní ko-lokalizace
separace na úrovní b. kompartmentů : co má vliv na formu proteinu?
struktura
obsah proteinu
: čím je dáno množství proteinu?
fyzický počet kopií proteinu
: intracelulární :: různé formy ::: volný
::: proteinové komplexy ::: jiné supramolekulární struktury :::: jádro, b. membrány, b. organely
: extracelulární
:: ve mnohobuněčných organizmech v mezibuněčném prostoru :: exoproteo m/sekreto m
45
jak můžeme zjistit obsah proteinu?
specificita separace
primární sekvence + další informace
: množství AK :: absorbance, fluorescence
: množství specifických peptidů :: iontočet
terciární sekvence + další informace
: specifická interakce :: interaktant s vhodnými analytickými vlastnostmi ::: absorbance, fluorescence, scintilace, enzymová aktivita
: nespecifická interakce
46
: co má vliv na obsah proteinu?
genomické vlivy
: transkripční aktivace :: promotor či zesilovač (enhancer), transkripční aktivátor
: transkripční umlčování :: epigenetika (vtištění, metylace DNA, histonový kód...) :: dsRNA/střihač (d//tc?^-siRNA-komplex RISC, miRNA...
proteomické vlivy
: metabolizmus (katabolizmus) :: předčasné odstranění :: dislokalizace
metodicko-analytické vlivy
: chyby v přípravě či analýze vzorku
47
... a jejich rozdíly
: jak můžeme zjistit rozdíl obsah proteinu? :: relativní rozdíl :: absolutní rozdíl
relativní vs. absolutní rozdíl
: jen poměr signálů odpovídajících obsahu :: dva srovnávané stavy vs. třetí stav - standard
48
praktický příklad studie expresní proteomiky
stanovení obsahu stafylokokového enterotoxinu H v potravinách
Staphylococcus aureus
: enterotoxiny A - V (SE, staphylococcal enterotoxirí) : exoproteom/sekretom S. aurea
: spolu s proteázami a dalšími proteiny {cca 150; 58 stálých) : obsah SEH cca 0.4 - 12.0 nM, Mr = 25 210, pí = 5.65
Stafylokoková enterOtOXikÓza (SFP - staphylococcal foodpoisoning)
: enterotoxiny - superantigeny :: aktivace imunitního systému > jeho selhání :: jen malé množství stačí na vyvolání reakce (~ |jg)
49
výskyt SEH v potravinách
: masné výrobky : mléčné výrobky
: cukrářské výrobky Ä
: původně pouze v surovinách :: termostabilní, odolný vůči proteázám i změnám pH :: původce odstraněn, toxin zůstává
10
20
30
40
50
srovnání s jinými SE
: menší obsah
: srovnatelná toxicita
P0A0LS/1-241 P0A0V2/1-2S7 P0Í552/1-266
P0A0L9/U241 P0A0L2I1-2S7 P01552/1-266
POAOLSfi-241 P0A0L2/1-257 P01S52/1-26Ô
P0A0L&1-241 P0A0Ľ2/1-257 P015&2/1-26Ó
P0A0L9/1-241 P0A0L2/1-257 PO f552/1-266
i IinkikI- -HfsIlBlísftsyak.........aeMBoMhMolMaI- - aygqM
i |k|ta|t- • II d i HtIt tIpl vmgsIkse e t n e kdIp kkSehqItHJgIl. ko i y yyn - i |y|rlMshvi |i fHi|vi|tpnvla|sqpdpkpdeBBsIkfB. T^enmkvlIdo
70 BO 90 100 110
I lil
e|i k|de i sgekdliIr- ■ ■ nqgdsg^—kMataMq!f|n|nM iM^f
Eli eIhDQFL'jh r i . Fi • f to m SvVYNOL lIoIo -Kí i . oÍyIĺ-I, Bl yB y l|vfl i DQFL v fdl iíys i Kd|kLGn|ĎnvSÍe|kNk|l AD1y|d|yBvfHn|
130 140 iso 160 170
103 B*|e k i s e I..........i seIlHJtIln s e kIaqerv i :■ anvw. ■ i|ke t -. | i
ii7 gBBaggtp|..........k r cmyggv|lhdn|r|te|kkvp i nlwlBkqn t v'FlE 1
117 HHJyFSKKTND i NSMOTDKP;   CMYGGVT: HNg|q|dkySs|tvr!feBMnLLS - - F 1
60
47 hpf i k| 58 ekakt s8 nhvsa
120
I0ľ 11b 116
180
149
166 TB 174 D S1
TNKKI.VT
24 i
Ll |ľ
lolo- - ysntl|r| |p|dkfdqsky|mi
190 200 210
■J i k i |k jsdHS Jyk - - - Be i s
elq Qa|rBqeBŇb1NSDVf|gkVQR!
oelD' lt|hBvknkm1efn- -n|pyet
220
230
EiDMKÍPRD YSFj 1 Y D 204 iHTsMp|vnMlFG224
i en -
tf 129
240 250 i
205 lkée ■ • WO YE i DkHE| 225|q1q- -YSNTL 230 IpIdKFDQSKY;
260
270
li;|dd i s h lov nIyIkkk < vd|i<Dv k|evy|t|kkk
241 257 266
: vysoká sekvenční homologie až 50 % (SEB, SEA, SEK)
plán vědecké studie
v oblasti expresní proteomiky
5. aureusM potravinách produkuje SEH : identifikace : kvantifikace
vývoj metody
: kmen 5. aureus s genem seh :: genomické ověření
: podmínky kultivace :: optimální pro produkci SEH
: nalezení SEH a jeho stanovení
opakovatelný jev vs. šum předpoklad testování předpokladu
(odpovídající empirická studie)
instrumentální data model
aplikace metody
: nalezení a stanovení SEH ve vzorku potravin : nalezení podmínek jeho produkce a toxicity
51
kmen S. aureus s genem seh
: potvrzení pomocí PCR
: i jiné metody (přenos podle Southerna) :: můžeme a máme je využít?
podmínky kultivace
: hledání média :: fyziologický roztok, mozkosrdcová infúze
: optimální podmínky :: teplota, obsah živin, doba kultivace
: první stádium přípravy vzorku :: odstranění buněk 5. aurea ::: nespecifické ztráty při centrifugaci
druhé stádium přípravy vzorku
: separace SEH :: obohacení, frakcionace, purifkace?
separovat nebo neseparovat? to je, oč tu běží!
pro
: zjednodušení vzorku : zvýšení citlivosti : zvýšení specifity
separovat!
: stojí za to to zkusit :: metodické výhody převažují
: principiálně bezproblémové
proti
: ztráty :: další manipulace ::: kumulování chyb
:: nedokonalá separace :: nespecifické ztráty
: náročnost :: peníze a čas
53
separujeme proteiny/peptidy
: moderovaná hydrofobicita :: potlačení hydrofiInich a coulombických interakcí ::: iontově párovací chromatografie na obrácené fázi
: náboj proteinu :: elektromigrační metody (CZE, IEF) :: iontová chromatografie
: velikost/tvar molekuly :: potlačení jiných vlastností ::: denaturační gelová elektroforéza
:: sítový efekt (FASP) > FASP
:: specifické interakce ostatní metody
::: imunoanalýza : žádná separace
:: artefakty (IEF) : nízká výtěžnost :: nespecifické ztráty 54
detekce SEH
: primární a sekundární sekvence :: UV-Vis detekce (IP-RPLC) :: tandemová hmotnostní spektrometrie (IEF, IP-RPLC, SDS-PAGE, 2D-PAGE)
: terciární sekvence :: imunoanalýza (SDS-PAGE)
stanovení SEH
: primární sekvence :: SIL + hmotnostní spektrometrie (180, GIST, ICPL)
::: nereprodukovatelné < nespecifické procesy ve FASP
: terciární sekvence :: imunoanalýza (imunoblot) > konečná ©
55
výsledky stud
detekce SEH v modelovém vzorku
: ano
stanovení SEH v modelovém vzorku
: ne
> žádná aplikace v reálném vzorku
: žádný model sekrece SEH v potravinách : žádná metoda stanovení SEH v potravinách
metodické překážky
: nereprodukovatelné stanovení SEH :: velmi nízký obsah > zásadní vliv nespecifických ztrát
reseni?
: jiná metoda separace (RPLC-OT MS) : jiná metoda stanovení (???)
existují sice obecné (expresně) proteomické postupy : ale nejsou univerzální :: nutnost hledat vždy přípatřičný postup