CG020 Genomika BÍ7201 Základy genomiky Přednáška 4 Genetika přímá Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko(5?sci. muni.cz, www.ceitec.muni.cz INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky ^^^^^^^m ^^^^m ■ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, «id*ié»Éni V EVROPSKÁ UNIE 90^0 ■ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pmto,kui«n«iohi.pn«« <4hav*' Osnova ■ Přímá vs. reverzní genetika ■ Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky ■ vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle ■ anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu metabolického profilu ■ exprese zajímavých genů ■ identifikace mutovaného lokusu ■ plasmid rescue ■ iPCR ■ Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ■ poziční klonování NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TELOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Osnova ■ Přímá vs. reverzní genetika INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Přístupy „klasické"genetiky versus „reverzně genetický' přístup ve funkční genomice NÁHODNÁ MUTAGENEZE \ „Přímě genetickv"přístup EMS T-DNA 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -pozični klonovanl „Reverzně geneticky" přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI (retro)transposons MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM EVROPSKÁ UNIE INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Osnova Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky ■ vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle ■ anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce EuMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé Pimf Pírtí. V 9 100 Mikkers et al, Nature Gen (2002J Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce EpMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které obsahují v 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2 Pimf Pírtí. V 9 100 Mikkers et al, Nature Gen (2002J Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce E^Myc dvojnásobných mutaníů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních partnerů Pim proteinů (Y), některého z proteinů Pim signální dráhy (X) nebo k aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z) a E\iMyc h E\MfC Pirn1J- Pimí ma 5wň Pim: US Mikkers et aL Narture Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice Izolace genomových oblastí přilehajících k místu inzerce proviru a Štěpení genomové DNA a ligace speciálních linkerů, tzv. splinkerett (zvýšení specifity amplifikace) lurtiúr DNA resiritteil vÁlh enzyme X is ligaied ta rhe S |l lili kl'l I'll E- SpUnkereBt PCA willi (irsl Divan e1 al.. Nud Ae-ld Res (1994) r Mikkers et al.. Nature Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice ■ Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Mikkers et al.. Naturs Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice ■ Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Mikkers et al.. Naturs Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Sekvenace a lokalizace oblastí přiléhajících k protoviru vyhledáváním v anotovaných databázích myšího genomu SpliiikereHt Devan e1 aL Nud Ae-id Res (1994) Mikkers et al.. Nátuře Gen (2002) liiriiui DNA reslriCtĚli wilh enzyme X is lili jisii lů tne splínkerEne Osnova metabolického profilu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů 73 1S. 329 min ll 1,1 1245 i> ll jíIl. k Lij ion wrw SOrmn Metabolické profilování ■ Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů identifikace {např. i komerčně) zajímavých mutantů Vector2 I Col-Ž WT Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů identifikace {např. i komerčně) zajímavých mutantů snadná a rychlá izolace genů pomocí identifikace T-DNA zasažených sekvencí Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin možnost využít i speciální techniky např. mikrodisekce Cryosectioning LMPC Sections without vascular bundles (,( MS Sali lit, LI Cluster analysis of cell-type specific samples Identification of differentially concentrated metabolites Osnova ■ exprese zajímavých genů INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Expresní profil ■ Identifikace mutantů se změnou expresního profilu analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese Expresní profil ■ Identifikace mutantů se změnou expresního profilu analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a Expresní profil Osnova ■ identifikace mutovaného lokusu ■ plasmid rescue ■ iPCR m INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutanta Identifikace mutanta I samčí sterilita, poruchy v prodlužování tyčinek (A,B) (porovnej se standardním typem C) Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu ■ identifikace T-DNA mutované oblasti INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutovaného lokusu 1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici pomocí plasmid rescue ■ reštrikční štěpení (EcoRt) mutantní genomové DNA ■ religace a transformace E.coli ■ izolace plazmidové DNA z pozitivně selektovaných klonů ■ identifikovaná sekvence byla identická s genem pro NAD7 kódovaným na mtDNA PpulDI ľ n CACAGGAAACAGCT AIGACATGATTACCAAtlCGAGC i CGG1 ACC.CAATT CTATGAAAGAG ľCTCGGGAGCCAGGATGCA7GCCA GT TIC AT ACGACCAGGT GGAG TGGCACAAGAT CIGCCTCľ ľGGCTTAIľJTCGAGAIAIIG AT T CC GTGTCLTTTGTCGVaACTGTACTŮATGCTTAAGCTCGAGCCŮTGGGTTAA GŮTAC íTTCTCAGAGCCCTCGGICCTACGTACGGT CŮMGrATGC TGGTCCACCTCArXG-TGTTC IA G AC G G AG A AC CGAATACAGCTC1ATAACTAAGG TICACACAACAATTTGCTTCTCGTATCGATGAAT TAGAAGAGATGTC AAC CGGCAACCGT ATCTGGA.AACAACGATTAGTGGArA TTGGTACTGT CACTGCACAGtAAGCAAAGGATTGGGGAATTGTAAATGGCTTCŮ1GTC CGGGGGA ŮAGTGIGTTGTTAAACGAAGAGCATA.GCTACTTAATC ITCJCTACAGITGGCCGIľGGCATAGACCTTTGTTGCTAATGACCIATAACCAIGACAGTGACGTGTCGT1CGTTTGCIAACCCĽTTAACATTT ACCGAAGTACAGGCCGCCI -nadľ sequence - 27 Identifikace mutovaného lokusu 2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici pomocí inverzní PCR (iPCR) reštrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA purifikace, religace a PCR pomocí T-DNA specifických primerů klonování a sekvencování identifikovaná sekvence nebyla homologní k žádné sekvencí se známou funkcí Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu ■ identifikace T-DNA mutované oblasti ■ lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Vyhledávání v knihovně IGF-BAC genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí inzertu 100 kb bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s radioaktivně značenou sondou ©00© ©00© ©00© ©©©0 Mapovaní pomocí IGF-BAC databáze /. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA ■ celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů ■ 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2 ■ 18 s podobností k mtDNA //. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA ■ celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů ■ všechny lokalizovány na chromozomu 2 NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé hranici T-DNA na chromozomu 2 Sekvence přiléhající k pravé a levé hranici T-DNA rga ftNSI mi4Í1 řhyí v £ítínPi prii £Lu JDÍ13I ř«í-ipl(5 Slíi.Jřř.S trii ľj' <.r; ^-i ^? ^l-;-: j; ^-is: i r TÍH UDÍ! g>!M!» Tť n;n glďl77 • ^1 W i a-" a"-li! ä" Í3Tt) i9.0t> SO.O: Sl.Ut «.00 53.0* 64.00 es ÍJ.3S íM|_H 00 6Í.0O 6;rw nblii r»w . p. _^ plín fSJH-SPÍ i pm.i US, i J! - TU I* "DLI] g^CJl IJJ^^ Tlili 6 Nh.oo en n.W í.oo z.oo 3.00 i.'.'.' 5.00 . 90 ?.00 6 S.bi il] M 00 ä .Cff^ ^ ÍHBSU fG* pravděpodobně došlo k inverzi téměř celého chromozómu 2 rga ňNSl PhyB er copl L.TP Libiqu* miTSa Osnova ■ Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ■ poziční klonování INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutovaného lokusu ■ Poziční klonování ■ podstatou je kosegregační analýza segregující populace (většinou potomstva informativního zpětného křížení) s molekulárními markery □ SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) □ polymorfizmus délky genomu (PCR produktů) amplifikovaného pomocí specifických primerů □ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) □ polymorfizmus délky restrikčních fragmentu úseků genomu, detekce pomocí Southern blotu (PCR po naštěpeni genomové DNA a ligací adaptorů) o CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) □ polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu amplifikovaných pomocí PCR □ RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) n polymorfizmus délky náhodně (pomocí krátkých primerů, 8-10 bp) amplifikovaných úseků genomu □ AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) □ polymorfizmus délky fragmentů genomu (PCR po naštěpeni genomové DNA a ligaci adaptorů) Identifikace mutovaného lokusu Příprava mapovací populace Col Col Col Ler L m— B- m Col Col Col Ler Ler Ler "' -I I-"' m -I I™ m-l L» m J LlUI m J j_m m .1 i Col Ler Col Ler Ler Ler m J Lm m J Lm m -j Lm Co/ Co/ Col Ler Ler Ler u H U m J Lm m J Lm m -I LM Rekombinantní analýza - určení procenta rekombinace mezi mutací a molekulárním markerem r r%1 = počet chomozomů Co// počet všech chromozomů x 100 marker I - ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II - žádná vazba 6 mutantů 7/12x100 = 58% • Analýza cca 2000 mutantních linií • Určení nejbližšího (ještě) segregujícího markem • Identifikace mutace pomocí sekvenování F2 mutanti _ ___ _ Mapa DNA molekulárních markem 1CH 2CH 3CH 4CH 5CH 3.9-ID.Q -11.4- 39.0 -4D.C - 60,0-66,3 -72.0- 83.6 - 113,0-117.8- -EAT ■F21M12 ■ngaS3 ■CIW12 -ZFPG ■T27K12SP6 -CIW1 -nga2BD ■ngal11 -AtľiATPASE 9.6-11.0- 30,0-34,5- 73.0- 90.B-97.0- ■ngal145 ■CIW2 - ngal126 ■nga16S 8.4 -20,6- 43.0-43.8- 60.0- 70.0 75,2- ■ngal62 - CIW11 - AíhGAPAb -F1P2-TGF ■CIW4 - nga6 nga1111 57,6 ■ 83,4 -85.3 - -ngall39 -ngall07 8,5-10,0- 14.3-16,0 -23,7- 33.4-42,0- 50.5- 68,4-71,0- 88,0-93,1 - 112,0-115,0- -125 - MUK11D -CTR1 -nga225 -CIW16 -nga249 - nga106 -CIW8 -nga139 - nga76 -PHYC -AtnS0191 -CIW9 Markery pro jemné mapování Ústa & Dean Pí Classics mi-RFLP Gocxfman QoodmanBAO TÍQH □ Attmsrift \ upífsie | Mapsfoi Clu Miiosome 3 for a!! iWaps. Search Potions: [T| m Selected Meps v 3111 l^íj Display All Rows v] MapViewer Home Release Not? View Prirtl-VžrSrtW Select range (e.g. 1 500-2000) AGI Map color key Listei & Dean Rl I Find I search byname (e.g. UFO) l i S |T|o bp 2,463,170 bp|_ 2,000,000 Zoom to; j-fa- .Y,] Zoom up to 200n to- see genes! I í~FJ"ď~l Search byname (e t) UFO) [________□ S KH130 329,3 ATPTP2B SH134 7Z,6 SK71 250,0 5HHJ4_73,Ě CI¥2 SH115_237,0 KPIS1 SG-CSIJP1SQ SH46_294,4 5H61 322,0 SH122 129,8 SH122_129,S SH253_310,7 SK121 93,6 5H45 234,7 HI320 5HZ06 KGA114S KGA114 5H57_225,2 5H84_9S,5 .29,8 3H121_i71,6 SHZ^.SS^S G4532 3J12_27-J,4 SGCS1IP129 SHI5896,3 SH11 2-53,3 H497A SH17_241,6 B 2-3 a SGCSHP111 SH133_12Q,2 SH73_253,4 ,5H233_nS,S G4553 SH46 411, J CIC9A T6P5-SGCSW T6P5-Ttřf-T6P5-T-'-J Í-J1ZÍ. pni. M0B_2 F2I9 T£3K3 T^HĚ T17H13 F2JH14 TBŮ11 Fjtjj TSK22 T18 F10AS f23I14 JJJJFÉ : £14H20 L±]°.< o.po 1TEL2H N0R2 F19B11 FJLI.. T.lijj F.jjj.lj FL6J1Ú T2S.H1Í " 12 J1BC20 JJ.6B23 FjjJB F15L11 gJ4 FSK7 p ['11 T6PS RCA t H sccsHřiao + ATPTTtľ_B 11.97 . 10 j 00 1113:20 FS3_2 KT-A11-45 + ATGST2J5 HITOOU + Shrnutí ■ Přímá vs. reverzní genetika ■ Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky ■ vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle ■ anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu metabolického profilu ■ exprese zajímavých genů ■ identifikace mutovaného lokusu ■ plasmid rescue ■ iPCR ■ Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ■ poziční klonování NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Diskuse JMI INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky