FGP_logo_color FGP_logo_color CG020 Genomika Přednáška 11 Praktické aplikace funkční genomiky Markéta Pernisová Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno pernisov@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz Šlechtění rostlin, individualizovaná medicína, pokročilé biotechnologie (produkce protilátek v rostlinách (imunomodulace), produkce terapeuticky využitelných látek, doplňky stravy), … Význam a bezpečnost GMO. Osnova 1.Genomika v medicíně 2.Biotechnologie 3.Geneticky modifikované organizmy 4.GMO – pro a proti 5.Literatura GENOMIKA V MEDICÍNĚ GENOMIKA V MEDICÍNĚ •Biotechnologie spolu s genovou technologií je klíčovým faktorem v pokroku lékařství •Zlepšení v praxi: •zrychlená identifikace a analýza nových patogenů •zrychlení vývoje a výroby vakcín a spolehlivých diagnostických nástrojů •genetické testy pro screening dědičných chorob nebo pro určení závažné genetické vady embrya či plodu •Mnohé léky vyráběné laboratorně: •bakterie, kvasinky a živočišné buňky produkují lidské proteiny, které jsou dostupné jako léky •ve vývoji jsou např. poživatelné vakcíny produkované transgenními rostlinami •1. biotech lék: inzulin, 1982 GENOMIKA V MEDICÍNĚ •Vliv genomiky na lékařství: •znalost genomu nás může dovést až k původu nemoci – mutantnímu genu - nesprávná funkce proteinu •rozpoznání takového genu umožní screening nemoci •pochopení vlivu genů na účinky léku a vznik vedlejších účinků •odhadnout individuální genetické predispozice •zlepšuje se efektivnost nových přístupů k léčbě nemocí •znalost bakteriálních a virových genomů pomáhá snadněji identifikovat mechanismy infekcí, a tak zlepšovat jejich prevenci a léčbu, a také vývoj vakcín •výzkum genomu může také pomoci pochopit proces stárnutí, a tak zlepšit kvalitu života starších lidí GENOMIKA V MEDICÍNĚ •Využití genomiky: •genetická diagnóza •individualizovaná medicína •genová terapie •regenerativní medicína •xenotransplantace •molekulární in vitro systémy ke studiu lidských nemocí GENETICKÁ DIAGNÓZA "Test provedený pro identifikaci specifických genetických rysů osobnosti. •není potřeba znát sekvenci celého genomu •využití pro: •objasnění, zda se nemoc objevila jako výsledek změn specifických genetických rysů •potvrzení a zpřesnění standardních lékařských diagnóz již zjevného onemocnění •identifikaci dědičných nemocí před jejich projevem •před implantací embrya oplodněného in vitro •hodnocení individuálních dispozic jedince pro vývoj určitých nemocí během života •DNA otisk při vyšetřování zločinu nebo určování otcovství INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA "= „personalized medicine“ " "Lékařský přístup, který klade důraz na systematické využití informací o jednotlivém pacientovi za účelem vytvoření individuálně optimalizovaného preventivního a terapeutického plánu. •Předpoklady: •detailní znalost genomu pacienta, ideálně kompletní genomová sekvence •znalosti funkce jednotlivých genů včetně funkčních odlišností jednotlivých alel zastoupených v populaci •korelace sekvenčních charakteristik s prognózami onemocnění, s úspěšností terapeutických postupů ... • " INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA •Využívá znalosti genomu k: •predikce zdravotních rizik •upřesnění diagnózy •výběr nejvhodnějšího typu léčby •minimalizace vedlejších účinků léčby •prevence http://www.personalizedmedicinecoalition.org/ INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA •Problém: •multigenová podmíněnost většiny lidských onemocnění Goh et al., 2007 INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA •Řešení: •systémová biologie - využívá např. genové klastrování pro identifikaci genů podílejících se na pozorovaných jevech • Topotecan-resistant Topotecan-sensitive Dietel and Sers, 2006 Hierarchical clustering analysis exemplified for Topotecan-resistant (R) andTopotecan-sensitive (S) cell lines. All cell lines resistant toTopotecan (left panel) and all cell lines sensitive to Topotecan (right panel) express a unique set of genes. Each row in the cluster indicates the expression profile of a specific gene across all 19 cell lines. Each column indicates the individual cell line in which the gene is expressed. Red, green, and black squares indicate that expression of the gene is greater than, less than, or equal to the median level of expression across all cell lines, respectively. The scale bar reflects the fold increase (red) or decrease (green) for any given gene relative to the median level of expression across all samples. Dietel and Sers, 2006. INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA •Řešení: •biomarkry •testy • The Case for Personalized Medicine, 3rd edition INDIVIDUALIZOVANÁ MEDICÍNA •Určité problémy •Etická otázka: •podmínkou je genetické testování nebo znalost genomu – lehce zneužitelné •riziko: nedostatečné zabezpečení údajů •v některých zemích zaměstnavatelé ani pojišťovny nemají přístup k těmto údajům •Vysoké náklady – rizika: •medicína by se mohla rozdělit na prvotřídní a podřadné služby •globalizační propast by se mohla ještě prohloubit – chudé země by si toto nemohly dovolit •Ochrana údajů: •zásadní a komplexní otázka GENOVÁ TERAPIE "Postup, při němž je do genomu pacienta vložena sekvence DNA, která má nahradit nebo doplnit určitý gen •Možnosti: •nahradit mutovaný gen •opravit mutaci •dodat DNA kódující terapeutický protein (místo lidského) •antisense terapie •V budoucnu použitelné k léčbě např. dědičných onemocnění •Typy: •somatická genová terapie •genová terapie zárodečných buněk GENOVÁ TERAPIE •Metody: •virové vektory •retroviry •adenoviry •herpes simplex virus •vektory schopné replikace •cis a trans regulační elementy •nevirové metody •injekce DNA plazmidu do svalu •zvýšení efektivity dodávané DNA: •elektroporace •sonoporace •„gene gun“ •magnetofekce •hybridní metody REGENERATIVNÍ MEDICÍNA "Cílem je obnova nemocných či poraněných orgánů či tkání. •překonání současných problémů transplantace: •nedostatek dárců •riziko odmítnutí •těžké imunosupresivní kůry •terapeutické klonování - buněčné terapie, která používá kmenové buňky k vytváření zdravých kopií buněk či tkání nemocného člověka •potenciální lékařské aplikace: léčba degenerativních onemocnění jako je Parkinsonismus, mrtvice, poškození jater, diabetes, popáleniny ... •embryonální kmenové buňky živočichů již byly úspěšně programovány, aby se vyvinuly v neurální, svalové nebo jiné typy buněk - slibné výsledky • REGENERATIVNÍ MEDICÍNA •embryonální kmenové buňky živočichů již byly úspěšně programovány, aby se vyvinuly v neurální, svalové nebo jiné typy buněk - slibné výsledky "Současná diskuse se soustřeďuje na etické otázky kolem terapeutického klonování. Buňka vajíčka je použita pro vznik embrya, které se nemá dále vyvinout v organismus. Namísto toho, po 5-6 dnech vývoje se z něj extrahují embryonální kmenové buňky; což zničí embryo. V závislosti na definici momentu, od kterého musí být chráněn lidský život, lze tento postup považovat za vytvoření lidského života za účelem jeho zničení, a tudíž je zakázán. •Důsledek etické diskuze: podpora výzkumu dospělých embryonálních kmenových buněk BIOTECHNOLOGIE BIOTECHNOLOGIE •Využívá živé organismy, buňky nebo jejich části (enzymy) k výzkumu, jehož poznatky pak dávají vzniknout novým produktům a aplikacím v medicíně, zemědělství, potravinářství, ochraně životního prostředí a alternativních metodách výroby v chemickém průmyslu či jiných průmyslových procesech. •Interdisciplinární věda, která je ovlivňována chemií, biologií, fyzikou, materiálovými naukami, inženýrstvím a informatikou. •Původ biotechnologie se dá vystopovat 4 tisíce let zpátky, když Sumeři (aniž by o tom věděli) používali mikroby pro výrobu alkoholických nápojů. BIOTECHNOLOGIE •moderní biotechnologie často pozměňuje genetické uspořádání buněk a organismů s cílem optimalizovat procesy, např. chemickou či fyzikální úpravou, buněčnou fúzí nebo genetickým inženýrstvím. •genetické inženýrství modifikuje izolované nukleové kyseliny •pojmy moderní biotechnologie a genetické inženýrství jsou často používány jako synonyma •genetické inženýrství je ve skutečnosti pouhým odvětvím biotechnologie •genetické inženýrství – GMO organizmy BIOTECHNOLOGIE •Příklady: •efektivní využití rostlinné biomasy pro výrobu paliv •získávání základních jednotek pro výrobu polymerních látek z živých organismů místo z fosilních zdrojů •fytofarmaceutika – nové metody vakcinace jako je například exprese protilátek, nebo antigenů vhodných k imunizaci v rostlinách •European Federation of Biotechnology http://www.efb-central.org ROSTLINNÉ BIOTECHNOLOGIE Agriculture Fibres Organic Acids Polyols Polyurethanes Polyester Nylon Polymers Monomers Biorefining Feed Additives BioFuels Green Solvents (ethyl lactate) Specialty Chemicals High Performance Materials Pharmaceutical Precursors Amino Acids Lignin Ethanol The Biorefinery platform using Agricultural Feed Stocks Marc Van Montagu, ACPD, Praha 2009 Prof. Em. Marc Van Montagu, ACPD, Praha 2009 ROSTLINNÉ BIOTECHNOLOGIE •Příklady: •produkce pavoučích vláken •produkce degradovatelných biopolymerů •produkce polypeptidů podobných elastinu (složka živočišných tkání) •produkce vakcín a protilátek •lidské (HIV, TNF) •živočišné (veterinární) •imunomodulace rostlinných hormonů • FAKTA K ZAMYŠLENÍ •naše civilizace je postavena na zemědělství, za 10000 let jeho existence klesla plocha potřebná k obživě jedince o 90% •k zabránění kolapsu je třeba tuto plochu dále snížit (ze současných 0,45 ha/osobu na 0,2 ha/osobu a to do roku 2050) •návrat k původním metodám zemědělství by byl návratem k původním nárokům na plochu k obživě a je tedy dlouhodobě neudržitelný •intenzivní zemědělství = konverze vody a ropy na potraviny •cílem rostlinných biotechnologií je využít všech dostupných poznatků vědy ke šlechtění odrůd s větším výnosem při menších nákladech na vodu a hnojiva 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 1961 1997 2050 Source: UN Millennium Ecosystem Assessment GENETICKY MODIFIKOVANÉ ORGANIZMY ŠLECHTĚNÍ •genetický základ organizmů se přirozeně mění mutacemi •před érou genetického inženýrství otázka náhody •nástroje šlechtitelů: •výběr a křížení •výběr: •pozitivní nebo negativní •výsledky byly náhodné •moderní šlechtitel se naučil poškozovat dědičnou informaci •chemicky, zářením • http://sphotos-h.ak.fbcdn.net/hphotos-ak-prn1/16215_464313343614408_331329709_n.jpg GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ •Objev •struktury DNA •restrikčních enzymů •plazmidů •cílená změna („cílené šlechtění“) •1973 – bakterie produkuje žabí protein •technika rekombinantní DNA = „stříhání genů“ = genové inženýrství •možnost přenášet geny = transgenoze •dle zákona: genetická modifikace •výsledek: GMO •první praktické využití: příprava lidského inzulinu v bakterii - 1978 • Boyer a Swanson – firma Genentech ŠLECHTĚNÍ vs. GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ Boyer a Swanson – firma Genentech GENETICKY MODIFIKOVANÉ ORGANIZMY (GMO) •Organismy, nesoucí upravenou vlastní nebo cizí (z jiného organismu) genetickou informaci, umožňující cílené změny daného organismu a jeho využití pro daný účel • http://www.gmo-compass.org/ GMO ROSTLINY •Využití: •odolnost ke škůdcům •odolnost k herbicidům •odolnost k suchu •odolnost k chladu •odolnost k zasolení •zvyšování využití dusíku •zvyšování nutričních hodnot plodin • • http://www.ugent.be/we/genetics/ipbo/en Bt PLODINY •rezistence k hmyzím škůdcům •kukuřice, bavlník, rýže •gen z Bacillus thuringiensis (Bt) •exprimují delta-endotoxiny (Cry proteiny) •zvýšení výnosů, snížení množství postřiků • HT PLODINY •rezistence k systémovým herbicidům •glyfosát •firma Monsanto: Roundup •zasahuje do procesu syntézy aromatických aminokyselin; živočichové nemají příslušný enzymatický aparát = neškodný •blokuje enzym 5-enolpyrovylšikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS) v chloroplastech – působí na zelené rostliny •neúčinný pro bakteriální EPSPS – evolučně rozdílný •sója, kukuřice, cukrová řepa, řepka, bavlník, alfalfa – přidaný enzym pro toleranci •glufosinát (fosfinotricin) •obchodní názvy: Basta, Liberty, Finale, Radicale ... •znemožňuje zpracování amoniaku – toxický •Streptomyces hygroscopicus jej syntetizují i přeměňují: acetylace enzymem fosfinotricinacetyl transferáza - v roce 1987 byl izolován kódující gen a dostal označení bar • MULTIREZISTENTNÍ PLODINY •Bt rezistence + herbicidy •multirezistentní kukuřice – v USA tvoří většinu celkové produkce •příklad multirezistentní kukuřice: •tři Bt geny pro rezistenci vůči vzdušným škůdcům •tři Bt geny pro rezistenci vůči půdním škůdcům •dva geny pro rezistenci vůči herbicidům • PLODINY TOLERANTNÍ K NEMOCEM •viry – neexistují postřiky •gen pro virový neinfekční obalový protein – zvýší odolnost vůči virové infekci •papája – Hawaii, jihovýchodní Asie •banán, maniok Hlízy manioku tvoří základní potravinovou složku pro více než 500 milionů lidí. Rovněž se využívá jako krmivo - zkrmuje se v podobě maniokové moučky hlavně prasatům, skotu, ovcím a kozám. PLODINY TOLERANTNÍ K SUCHU •kukuřice odolnější k suchu: komerčně využitelná v roce 2016 Lathyrus sativus Chickpea Cereals Drought in Ethiopia Hrachor – Lathyrus sativus Cizrna – Chickpea Obiloviny - Cereals ZLEPŠENÍ VYUŽITÍ DUSÍKU •využití dusíku z hnojiv •gen z ječmene – 3x zvýší využití dusíku při nedostatku kyslíku When crops are supplied with excess nitrogen fertilizer to gain maximal yields the excess nitrogen is converted into the gas nitrous oxide (N2O) and also leaches into rivers. N2O has 300x the Global Warming Potential of CO2 and nitrogen fertilizer runoff creates marine dead zones, such as in the Gulf of Mexico at the mouth of the Mississippi river. Crops that have the ability to grow well with less nitrogen, because of enhanced uptake or similar characteristics, result in less N2O release and less N runoff. This lessens the effect of fertilizer nitrogen on global warming and lake and marine pollution. ZVYŠOVÁNÍ NUTRIČNÍCH HODNOT •zlatá rýže •vložených několik genů z kukuřice kódujících enzymy pro biosyntézu β-karotenu •zabránění problémům se zrakem u velké části populace v Indii a Číně •řepka a sója •zlepšené vlastnosti oleje: stabilnější, odolnější k vysokým teplotám, delší skladování • • While most biotech crops have characteristics that enhance their cultivation, those with enhanced consumer characteristics are being developed. For example many children in SE Asia develop blindness because of a deficiency of vitamin A. Golden rice is engineered with genes from maize to be high in the precursor of vitamin-A that when eaten is converted to vitamin-A in order to prevent blindness in developing countries. High oleic soybean and canola oil are now available. Oil with this fat profile is more stable, allowing for greater heat tolerance and longer shelf life. GMO ŽIVOČICHOVÉ •Transgenní kočky •lentiviry citlivé k restrikčním faktorům •specifický restrikční faktor: rhesus macaque TRIMCyp + eGFP •uniformní exprese, žádná mozaikovitost a žádné umlčování v F1 generaci •lymfocyty transgenních zvířat rezistentní k replikaci FIV • Wongsrikeao et al., 2011, Nature Methods GMO – PRO A PROTI GMO – PRO A PROTI •GMO rostliny •zvýšení výnosů bez nutnosti používat insekticidy, pesticidy, fungicidy • • • • • •24% výnosu na akr •50% zlepšení výnosu pro malé zemědělce • • • • Ohio State University, December 2011 GMO – PRO A PROTI •GMO rostliny •snížení používání pesticidů - negativní vliv silných pesticidů používaných v současném zemědělství •zvýšení využití dusíku z hnojiv - negativní vliv přílišného hnojení na kvalitu vod •zvýšení výživové kvality plodin •zmenšení pěstební plochy •frekvence přenosu pylu na jiné druhy (křížení) byla zjištěna v rozsahu 0,05-0,53% GMO – PRO A PROTI •GMO rostliny •Bt plodiny: negativní vliv i na jiný než škodlivý hmyz ??? •účinek i na některé motýly a brouky •na Bt bavlníku více hmyzu Lu et al., 2012, Nature berušky pavouci zlatoočka b, Predator population density on cotton in commercial fields in 36 locations (each point represents one-year data; the red arrow indicates the beginning of Bt cotton use). Inset: population abundance of ladybirds (blue) = beruška, spiders (red) = pavouk, and lacewings (green) = zlatoočko, collected from 14 locations. c, Number of insecticide sprays for CBW = cotton bollworm (grey points) and all insect pests (black points) on cotton; each point represents one-year data. GMO – PRO A PROTI •GMO rostliny •Nebezpečí vzniku alergií •GMO rostliny obsahují vždy jen jediný nebo několik málo vnesených genů a jsou velmi pečlivě testovány •naopak daleko méně jsou testovány nové odrůdy, při jejichž šlechtění se velmi často používají silné mutageny, např. rentgenové záření a kde dochází ke vzniku desítek a stovek nových mutací najednou •O zákazu pěstování GMO ve Švýcarsku rozhodlo referendum •30% populace EU se domnívá, že pouze transgenní rostliny mají geny a odmítá je jíst… • GMO – PRO A PROTI "Diskuze GMO – PRO A PROTI "Náš úkol: •neúnavně vysvětlovat, že rozumné využívání vědeckých poznatků, a to včetně genomiky, je nutné jak k pokrokům v medicíně, tak i pro zachování naší civilizace •diskuse s veřejností o významu a přínosech GMO pro lidskou společnost •potřeba obhajoby GMO rostlin - plodiny 21. století •žádná technologie není bez rizika, ani GMO, ale není potřeba dělat z GMO strašáka a démonizovat je – za tím je většinou třeba hledat finanční prospěch některých firem a i určitou zaslepenost „ochránců světa“ všeho druhu… • LITERATURA •viz přednáška Ceiling cover scan freedom to innovate