BARVENÍ TRVALÝCH PREPARÁTŮ je biochemická metoda, kterou se přidá k objektu specifická barvící látka (barvivo).V biologii slouží k prokázání výskytu (kvalifikaci) nebo množství (kvantifikaci) specifické látky ve zkoumané tkáni nebo k obarvení celých struktur a objektů. BARVIVA Přirozená Umělá Kyselá Zásaditá Neutrální Přirozená barviva: hematoxylin - extrakt z kampešky čínské (Haematoxylon campechianum) - bazické barvivo (barví jádra buněk) hematoxylin1 hematoxylin3 kampeškový dub1 Kampeškové dřevo je barevné dřevo tropických stromů čeledi sapanovité. Z vnějšku je modročené, uvnitř červenohnědé. Dřevo obsahuje až 12 % hematoxylinu. • Král histologických barviv • po nabarvení nutno vypírat ve vodovodní vodě • fialová barva objektů • krátká doba barvení histologických řezů – přibližně 10´ • nebarví přímo, ale až po oxidaci na hematein • samovolně na vzduchu „zraje“ několik týdnů až měsíců • přidávají se oxidační činidla (jodičnan sodný) • hematein má slabou afinitu ke tkáním, proto se musí použít mořidla (soli AL, Fe) – různé druhy hematoxylinů • barví barevný lak hemateinu Kamencové hematoxyliny (síran hlinito-draselný) - např. Harrisův, Mayerův Železité hematoxyliny (síran železito-amonný) – např. Heidenhainův Přirozená barviva: • karmín - extrakt ze samiček nopálovce karmínového - Dactylopius coccus (synonymum červec nopálový - Coccus cacti) - bazické barvivo, košenila Mathioli, 1549 cervec_nopalovy K barvení totálních preparátů – až 12 hodin •Karmínové barvivo neboli košenila se získává ze sušených těl samiček červce nopálového. •Původním domovem červce nopálového je Peru. Tam bylo objeveno i tajemství výroby košenily. Dnes se tento červec pěstuje i v Mexiku, Guatemale, Chile, Bolívii a dalších jihoamerických zemích. •V roce 1532 bylo do španělského Cádizu dovezeno osm opuncií i s koloniemi červců nopálových. Krátce poté dostal Cádiz zvláštním královským dekretem povolení k výrobě košenily. V polovině devatenáctého století se červec nopálový rozšířil na Kanárské ostrovy, zejména na Lanzarote, kde jsou pro opuncie i červce velmi vhodné klimatické podmínky. V roce 1870 se už exportovalo z Kanárských ostrovů 3000 tun košenily.Přírodní karmínové barvivo je dodnes žádaným zbožím na celém světě, i když ho stále více nahrazují barviva uměle vyráběná. Používá se v parfumerii (rtěnky nejlepších značek), v potravinářství pro přibarvování nápojů zejména alkoholických (například červeného martini), cukrovinek, jogurtů, ve farmacii (homeopaticky se červci předepisují při kašli, astmatu a bronchitidě) a také v textilním průmyslu. •Získat košenilu není jednoduché. Jsou k tomu třeba doslova lány vzrostlých opuncií (Nopalea coccinellifera), které jsou schopny přežít útoky mnoha generací červců. Vývoj červců je třeba pozorně sledovat a ve vhodnou dobu samičky sbírat štětkou na dlouhé násadě do plátěných sáčků. Jsou jich miliony. •Hlavním barvivem, které samičky červce obsahují, je kyselina karmínová. Ta tvoří až dvacet procent jejich hmotnosti. Barvivo může být nejrůznějších odstínů a je velmi kvalitní. Sesbíraný hmyz se okamžitě suší, protože jen tak si uchová výrazné karmínové barvivo. Prodává se buďto sušený k dalšímu zpracování, nebo jako už zpracované barvivo. • Přirozená barviva: • orcein - extrakt z některých lišejníků lišejník ORCEIN 800px-Deroceras_laeve_muscle_400_orcein Přirozená barviva: • šafrán - extrakt z blizen šafránu (Crocus sativus) - kyselé barvivo - na kolagen šafrán blizny šafránu Přirozená barviva: V minulosti bylo užíváno více přirozených barviv, např.: • indigokarmín (z kořenů tropického keře indigovníku) • • berberin - kyselé barvivo (žluté, dřišťál) • • brazilin - bazické barvivo podobné hematoxylinu (ze dřeva Caesalpinia) Umělá barviva: • eosin (tetrabrom fluorescein) - barví acidofilní složky tkání EOSIN EOSIN2 A/ XANTINOVÉ DERIVÁTY Umělá barviva: • bazický fuchsin - základ i pro další barviva jako jsou Schiffovo reagens, rezorcifuchsin a aldehydfuchsin basicfuchsin B/ TRIFENYLMETANOVÁ BARVIVA • anilínová modř, světlá zeleň a kyselý fuchsin - kyselá barviva Umělá barviva: • thionin, toluidinová a methylenová modř - bazická barviva • Janusova zeleň - např. pro supravitální barvení mitochondrií • olejová červeň a sudanová čerň - barviva na tuky C/ THIAZINOVÁ BARVIVA D/ AZOBARVIVA • Kyselá, barvící plasmu (též plasmatická) - eosin, světlá zeleň, oranž G, kyselý fuchsin,… • Zásaditá, basická, barvící jádro (též jaderná barviva) - toluidinová modř, metylová zeleň, basický fuchsin, hematoxylin (vypírání ve vodovodní vodě) karmín • Neutrální - např. eosinát methylenové modři. TYPY BARVENÍ: progresivní - barvíme až je dosaženo žádaného zbarvení, regresivní - napřed tkáň přebarvíme, pak přebytečné barvivo odstraňujeme sukcedánní - několik barviv po sobě, simultánní - více barviv současně. - v obou případech musí každé barvivo barvit jinou část tkáně substantivní - tkáň barvíme přímo barvivem, adjektivní - barvení prostřednictvím mořidla, které se váže na tkáň Vitální barvení Využití mikrovln pro barvení železitý acetokarmín – barvíme motolice (totální preparáty) regresivní způsob barvení (přebytečné barvivo se odstraní diferenciací v kyselém alkoholu) Dicrocoelium dendriticum – žlučovody muflona Ovis musimon 1.Vyprat fixáž v destilované vodě (30‘) 2.Vložit do barviva (IAC) nejlépe přes noc 3.Vyprat barvivo ve vodě 4.Kyselý alkohol (70% alk. : HCl, poměr 99 : 1) • (odbarvování, parenchym musí být světle růžový, doba individuální, pozorovat pod stereoskopem) • • Vzestupná alkoholová řada •70% alkohol (zastaví odbarvování, odvodňuje) – 5 minut •96% alkohol (odvodňuje) 10 – 15 minut •Karbol-xylen (odvodňuje, projasňuje) – 5 minut •Xylen (odvodňuje, projasňuje) – 5 minut •Kanadský balzám – nejdřív kapka na podložní sklo, rychle přenést objekt, přikrýt krycím sklíčkem) • •70% – kyselý alk – 70% - 96% – k-x, x, KB