Identifikace bakterií (biochemické testy,
standardizované identifikační systémy)
Cíl: Identifikace neznámého izolátu
Identifikace MO – stanovení příslušnosti k určité taxonomické skupině
- čistá kultura!!!!
morfologie: makro- i mikroskopické znaky, tvar a zbarvení kolonie, charakter růstu, identifikační
barvení – Gram, acidorezistence, tvorba spor, přítomnost pouzdra, atd.
fyziologie: vztah k O2, teplota – růst, rezistence, tolerance k NaCl, žlučovým solím, ATB, typ
metabolizmu, atd.
biochemie: zdroje C, redukce nitrátů, tvorba indolu, acetoin, atd.
doplňující testy: elektron. mikroskopie, obsah G+C v DNA, sérotizace, fagotypizace, PCR,
ribotypizace, imunochemické reakce, chemická analýza BS, produkce toxinu, patogenity, atd.
! Záleží na sledované skupině – tabulky, klíče, často využití pc!
• Druh = jasně vymezená skupina navzájem příbuzných kmenů,
zahrnujících typový kmen
= sdílí 70% a vyšší DNA-DNA homologii komplementárních párů
bazí (DNA reasociace)
= vykazuje, až na výjimky, shodné fenotypové znaky a současně
má některé odlišné znaky od jiných skupin
• Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology – přehled popsaných
druhů, jejich vlastností, klíče a tabulky k určování
• Biochemické identifikační testy
– snadno zjistitelné a poměrně stálé vlastnosti (mutace je vzácná)
– v prostředí mohou být mutanti → % kmenů pozitivních reakcí u kmene
• Standardizované testovací systémy
– rychlé zpracování velkého množství vzorků
– odstranění nesrovnalostí individuálními rozdíly v přípravě médií,
provedení i hodnocení
→ standard, diagnostické soupravy
reprezentativní soubory biochemických testů
(mikrometody – v 1 soupravě 10-20 testů)
jednoduché, snadná manipulace, tabulka hodnocení; API systém
u nás nejvíce od Lachema Brno (ve spolupráci s CCM)
Mikro-LA-Test – vysušená média v destičkách s jamkami, do kterých se
kape buněčná suspenze (ENTEROtest, STAPHYtest, ENTERO RAPID,
ANAEROtest,…)
Hodnocení – tabulky, index či program TNW
Kontrola kvality – kontrolní kmeny CCM se standardními výsledky
E. coli
Salmonella entericaShigella flexneri
Průkaz glykosidáz v
mikrotestu API (u
manotolu a sorbitolu je
patrná produkce plynu)
Čeleď Enterobacteriaceae
– G- tyčky, fakultativně anaerobní
– klinicky významná, početná čeleď, cca 65 druhů
– osídlují střevo, většina nepatogenní, ale i významní patogeni (antropogenní
serovary salmonel – Typhi, Paratyphi; Shigella, Yersinia pestis, některé kmeny E. coli)
– rozlišení: kvasné zkoušky, redukce nitrátů, tvorba H2S, hydrolýza
močoviny, KCN test, tvorba indolu…
– selektivní půdy – ENDO a MacKonkey agar, Simmons-citrát agar, Salmonella-Shigella
agar, agar s briliantovou zelení
– netvoří spory, chemoautotrofní, mezofilní
– oxidáza negativní (kromě rodu Plesiomonas); kataláza pozitivní
glukózu štěpí za tvorby plynu; redukují nitráty
KOH test
– určení G+/–
do kapky 3% KOH se nanese kličkou kultura
– pokud se za kličkou potáhne sraženina (viskózní suspenze)→ Gdošlo
k poškození BS a vylití obsahu buňky
Katalázový test
– kataláza umožňuje rozkládat H2O2 na H2O a molekulární O2
– do kapky 3% H2O2 se nanese kličkou kultura
– pozitivní reakce → uvolňování bublinek
OF test (typ metabolismu glukózy)
– médium s glukózou a acidobazickým indikátorem (bromthymolová
modř) → ve vzniklém kyselém prostředí žloutne (pozitivní reakce);
v zásaditém prostředí zmodrá alkalizací; při neutrální reakci
zelená
– 2 zkumavky (bez a s parafinem), očkuje se vpichem
– možno odečíst i pohyb bakterií
– nefermentující
pod parafinem modrá či zelená barva
Obr: dvojice zkumavek zleva
- beze změny, oxidace a fermentace,
pouze oxidace
• médium s glukózou a bromthymolovou modří (indikátor pH) plníme do zkumavek,
rychle zchladíme a do každé druhé zkumavky přidáme sterilní parafinový olej.
Testovaný kmen očkujeme vpichem vždy do dvou zkumavek (s parafinovým
olejem a bez).
TSI test (tripple sugar iron)
– test na utilizaci laktózy, glukózy, sacharózy, produkci H2S
pomocí indikátoru železa podle Hajny
– acidobazický indikátor (bromkrezolová červeň)
– indikátor produkce H2S (síran železnatý)
– médium je očkováno vpichem a po šikmé ploše i hádkem v 1
zkumavce
– žlutá (pozitivní reakce), černá – H2S
– produkce plynu – nadzvedlý či potrhaný agar
– glukóza – sloupec; laktóza – šikmá část
The tube on the left has a
yellow butt (acid), red
slant (alkaline), H2S
production as indicated by
blackening of the agar,
and no gas roduction.
The tube on the right
shows no H2S formation, a
yellow slant (acid), gas
production, and an acid
butt. Note that the gas on
the bottom has lifted the
agar.
The tube on the left has a
red butt (alkaline), red
slant (alkaline), and no
acid or H2S production.
The tube on the right has
a yellow slant (acid),
yellow butt (acid), and no
gas or H2S production.
Důkaz produkce oxidázy
– enzym cytochrom oxidáza c
– chromogenní oxidačně-redukční činidlo → oxidací mění barvu
(červenofialová)
– papírek zatlačit na kulturu nebo kličkou přenést část kultury
– pozitivní – do 30 sec intenzivně zmodrá; opožděně pozitivní – do
2 min zmodrá; negativní – beze změny i po 2 min
+ Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens
– Enterobacteriaceae (kromě rodu Plesiomonas)
Identifikace G- fermentujících tyček
pomocí ENTEROtestu
– k identifikaci čeledi Enterobacteriaceae (glukózu fermentují, oxi -)
– 16 testů (2x8 na destičce)
– VYBRAT VHODNÝ KMEN
– 2,5 - 3 ml fyziologického roztoku + buněčná kultura
→ zákal 1 dle stupnice McFarlanda
– POZOR na orientaci destičky
– pipetovat 100 µl suspenze do každé jamky
– anaerobní podmínky (prvních 5) – 2 kapky parafínu
– kultivace 18-24 hod při 37°C
– při hodnocení se zakapávají jamky pro indol a fenylalanin
(reakce do 3 min)
– interpretační tabulka, barevná srovnávací stupnice
• H2S produkce sirovodíku
• LYS dekarboxylace lysinu
• IND produkce indolu
• ORN dekarboxylace ornitinu
• URE rozklad močoviny
• PHE deaminace fenylalaninu
• ESC hydrolýza eskulinu
• SCI utilizace citrátu
• MAL utilizace malonátu
• INO produkce kyseliny z inositolu
• ADO produkce kyseliny z adonitu
• CEL produkce kyseliny z celobiózy
• SUC produkce kyseliny z sacharózy
• SOR produkce kyseliny z sorbitolu
• TRE produkce kyseliny z trehalózy
• MAN produkce kyseliny z mannitolu
ONPG test
– produkce β-galaktozidázy
– bezbarvý o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranozid
– pozitivní reakce (enzymy schopné štěpit laktózu) – vznik žlutého
ortho-nitrofenolu
– do zbytku fyziologického roztoku s bakteriální kulturou sterilně
vložíme testovací proužek a kultivujeme 24h při 37°C
Program TNW
• Identifikační skóre = míra výlučnosti identifikace
- procento pravděpodobnosti, že kmen přísluší právě k tomuto
taxonu /druhu/ a žádnému jinému
>99 výborné odlišení
96–99 velmi dobré odlišení
90-96 kmen je odlišen
<90 kmen neodlišen
• T index = typičnost identifikovaného kmene vzhledem k vypsanému
taxonu
- čím vyšší T index, tím podobnější je daný kmen „ideálu“
daného taxonu
>0,75 typický kmen
0,5-0,75 méně typický kmen
0,25-0,5 netypický kmen
<0,25 zcela netypický kmen
Doplňující testy
Sada latexových reagens pro
průkaz somatického antigenu
O157 u kultur E. coli
Latexová (zprostředkovaná)
aglutinace (vpravo pozitivní
výsledek)