Stanovení citlivosti bakterií k ATB,
stanovení koncentrace ATB
Cíl: Stanovit citlivost MO k ATB
Porovnat citlivost různých MO k různým ATB
Stanovit min. inhibiční koncentraci dilučním testem
MO – produkují látky s ATB vlastnostmi; sekundární metabolity
ATB - liší se původem, chemickou strukturou, spektrem účinnosti,
mechanizmem účinku
- aplikovaná ATB – málo, testy, škodlivost makroorganizmu
- Bacillus, Streptomyces, Penicillium…
Streptomyces griseus (streptomycin)
S. kanamyceticus (kanamycin)
S. erythraeus (erytromycin)
S. venezuelae (chloramfenikol)
S.aureofaciens (chlortetracyklin)
S. fradiae (neomycin)
AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí lláátkytky
Látky působící celkově:
Antiparazitární látky proti parazitům
Antimykotika proti kvasinkám a vláknitým houbám
Antivirotika proti virům
Antituberkulotika proti mykobakteriím
Antibiotika proti bakteriím (přírodního původu)
Antibakteriální chemoterapeutika také proti bakteriím, ale syntetická
V poslední době se stírají rozdíly mezi posledními dvěma
Látky působící lokálně:
antiseptika
• CHEMOTERAPEUTIKA = chemicky syntetizované látky, které ve
velmi nízkých koncentracích (řádově µg/ml) mohou inhibovat nebo
usmrtit (citlivé) mikroorganizmy.
• ATB = jakákoliv látka přirozeného, semisyntetického nebo
syntetického původu, která již ve velmi nízkých koncentracích
(řádově µg/ml) může inhibovat nebo usmrtit (citlivé)
mikroorganizmy (prostřednictvím specifických inhibičních účinků na
specifické děje).
• Mikrobicidní x mikrobistatický účinek
• POZOR na nežádoucí účinky!!
MECHANIZMY ÚČINKU ANTIMIKROBIÁLNÍCH LÁTEK
• Inhibice syntézy BS (Beta-laktamy, glykopeptidová ATB, baktericidní)
Penicilíny, cefalosporiny, vankomycin, teikoplanin, bacitracin, cykloserin, fosfomycin
• Poškození syntézy cytoplazmatické membrány
baktericidní
Polypeptidy (colistin, polymyxin, tyrothricin)
Antimykotika polyenového charakteru (amfotericin B a nystatin)
• Inhibice proteosyntézy
kys. fusidová, oxazolidinony – linezolid a eperelinezolid
baktericidní - aminoglykosidy (30S)
bakteriostatické - makrolidy (50S), tetracykliny (30S),
linkosamidy (50S), amfenikoly (50S)
• Porucha syntézy nukleových kyselin
baktericidní
Interference s DNA bakterií (chinolony - gyrázy, nitroimidazoly)
s RNA (ansamiciny, rifampicin - mRNA)
• Antagonismus a kompetitivní inhibice - antimetabolity
bakteriostatické,
sulfonamidy, trimetoprim, dapson, izoniazid
Rezistence – primární x sekundární (získaná)
vanA-ligázaglykopeptidy
acetyl-, fosfotransfarázylinkosamidy
esterázystreptoraminy
metylace rRNAmakrolidy
efflux systém
ochrana ribozómů
tetracykliny
acetyltransferázychloramfenikol
acetyl-, fosfo-,
nukleotidyltransferázy
aminoglykosidy
PBP, β-laktamázypeniciliny, cefalosporiny
Mechanizmus rezistenceAntibiotikum
Stanovení koncentrace
• Inhibice x stimulace
• ATB, vitamínů,…
• Zřeďovací metody – min. koncentrace
• Nefelometrické metody – řada koncentrací účinné látky, tekuté médium s MO, měření
intenzity růstu (zákalu)
• Titrimetrické metody – fyz.-chem. změny prostředí (produkce kyselin), titrace
• Difúzní metody – tuhá média s MO, účinná látka tvoří inhibiční/stimulační zóny
- velikost zóny odráží koncentraci
→ kapková, disková, komínková, jamková metoda
E-test – kvantitativní (gradient ATB)
Mikrodiluční test
• ATB - v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá
• MIC = nejnižší koncentrace, která inhibuje růst
• jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12
antibiotik, každé v 8 různých koncentracích
Foto: archiv MU
E-test
Testování na produkci širokospektrých betalaktamáz
• test synergismu - využívá se difúze klavulanové kyseliny od disku obsahujícího
ko-amoxicilin (tj. amoxicilin plus právě kyselinu klavulanovou)
Stanovení koncentrace ATB
Rozvařená média, temperovaná na 45°C
Rozpipetovat po 15 ml
Zaočkování 0,5 ml kultury Staphylococcus aureus
Rozlít na misky
Standardní řada ředění (250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,81 µg/ml)
Po utuhnutí agaru udělat jamy korkovrtem (4 na misce)
Do jamky 0,04 ml roztoku, 1 miska = 1 koncentrace
6 misek se známou koncentrací ATB + vzorek o neznámé koncentraci
Inkubace 24 hod při 37°C
POSTUP: Změřit zónu, zprůměrovat
Sestrojit kalibrační přímku
(průměr zóny v mm / log koncentrace)
→ určení koncentrace neznámého vzorku
Různé koncentrace oxacilinu – S. aureus
Citlivost k ATB
Postup:
• Na půdu s Mueller-Hinton agarem rozetřít kulturu S. saprophyticus.
• Sterilně jehlou rozložit v dostatečné vzdálenosti od sebe a kraje
misky testovací disky s ATB.
• kultivace 24 hod, 30°C
• Po 24 hod kultivace měření inhibičních zón, měří se průměr včetně
disku (v hodnocení je již velikost disku započítána)
• Hodnocení: do 11 mm necitlivý mikroorganizmus
11 – 17 mm citlivý mikroorganizmus
nad 17 mm velmi citlivý mikroorganizmus
Použitá ATB
• erytromycin - makrolidy 1. generace
• vankomycin - glykopeptidy
• rifampicin - ansamyciny
• chloramfenikol - amfenikoly
• cefalotin - cefalosporiny I. generace
• nitrofurantoin
• oxacilin - isoxazolylpeniciliny (penicilinázarezistentní)
• tetracyklin - cykliny
• ko-trimoxazol – sulfonamidy s potencovaným antimikrobním účinkem
• penicilin – beta-laktamy (dipeptidy)