Biologie cytokinů rodiny gp130/IL-6 e-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 - gp130/IL-6 cytokiny náleží do cytokinové třídy I, do skupiny s dlouhými řetězci tvořené 4 těsně semknutými a-helixy (A). - Na rozdíl od ostatních cytokinů třídy 1, jejichž hlavní funkce je regulace hematopoetického a lymfatického systému, gp130 cytokiny mají významné uplatnění i v ostatních buněčných systémech v rámci regulace ontogeneze a homeostáze. Gp130/IL-6 cytokiny (ligandy) IL-6 - interleukin-6 IL-11 - interleukin-11 LIF - leukemia inhibitory factor CT-1 - cardiotrophin-1 CNTF - ciliary neurotrophic factor OSM - oncostatin M CLC - cardiotrophin-like cytokine NPN - neuropoietin Specifické receptory k jednotlivým ligandům Nesignalizující receptory - a Signalizující receptory - p Po navázání ligandu na specifický receptor se tento komplex váže na receptor gp130 za vzniku stabilního komplexu a spouští se transdukce signálu IL-6 IL-11 LIF IL-6-R IL-11-R ! v ' >j|^ ^^Gp130 *gp130 samotný má k ligai LIF-R OSM-R CT-1 CNTF-R CNTF NPN CLF CLC OSM samotný má k ligandum velice nízkou afinitu, tím je zabráněno aktivaci gp130 samotným ligandem! Komplexy tvořené cytokiny IL-6 rodiny s jejich receptory gp130/ gp130 gp130 OSMR/gpOQ Nesignalizující receptory váží dva signalizující receptory, gp130 případně LIFR IL-6 a IL-11 -> jejich receptor váže dvě molekuly gp130 LIF, CT-1, CNTF, CLC -> sdílejí receptor LIF-R, který se po navázání ligandu váže k jedné molekule gp130. CNTF a CLC sdílejí dále CNTF-R tvořící tak receptorový hetero-trimer. • OSM -> se kromě LIF-R váže i na OSM-R Příklady struktury receptoru gp130 cytokinů extracellular gpi30 •e intracellular A gp130-R LIFR G-CSFR CNTFR 's IL-11R Receptory cytokinů třídy 1 - Obecně regulují proliferaci, diferenciaci a apoptósu u imunitního, hematopoetického, nervového, kardiovaskulárního a endokrinního systému. Dále se uplatňují v metabolismu kostní a tukové tkáně, v zánětu a v indukci akutní odpovědi na zánět. - V současné době je nejlépe zmapován jejich význam v hematopoéze, imunitní odpovědi, neurogenezi, adipogenezi a reprodukci. - Předpokládá se, že gp130 indukovaná kaskáda transdukce signálu hraje jednu z klíčových rolí v regulaci kmenových buněk obecně. Fever Immune response B cell activation T cell activation I T Brain Hypothalamus CRH Anterior pituitary Acrenais ACTH Glucocorticosteroids Acute phase proteins _r <:7 Phagocytosis Tissue Stirn ulabon of Stirn Uabon of N eutrop rils an d Fi broblasts and ot her c ells Macrophages Muscle proteolysis Inhibitory: Insulin, Okadaic aci d Regulation of Acute phase reactions Mezi gp130 signalizující cytokiny se řadí i IL-27 (interleukin 27) patřící do rodiny IL-12 (interleukin 12), jeho specifickým receptorem jelL-27Ra (wsx-1) Do rodiny IL-6 cytokinů se dále řadí IL-31 (interleukin 31), který ovšem neváže gp130, ale „gp130-like monocyte receptor"- IL-31 -R(X, který heterodimerizuje s OSM-R IL-6 cy to kiny - regulace a funkce - Jednotlivé IL-6 cytokiny jsou ve svých účincích z velké části vzájemně zastupitelní - Specifičnost účinků je dána přítomností specifického receptoru na povrchu nebo v okolí buněk, ale také koncentrací jednotlivých cytokinů - gp130 je přítomen prakticky na všech buňkách - Membránově vázaný, receptor může být nahrazen solubilním (IL-6-R, IL-11-R, LIF-R, CNTF-R, gp130-patrně působí jako competitork membránově vázaným variantám, nebo jako a-receptor. In vivo byl v plasmě prokázán IL-6-R IL-6 IL11 LIF OSM CNTF CT-1 Udržení pluripotentních buněk (ES) Diferenciace do makrofágů (M1) Růst myelomových buněk Podpora trombopoesy Indukce proteinů akutní fáze Indukce ACTH Neurální diferenciace Indukce osteoklastů Srdeční hypertrofie IL-6 a IL-11 (hematopoetické a imunitní buňky, fibroblasty) se uplatňují zejména v regulaci hematopoésy a imunitní odpovědi. Obecně podporují proliferaci a diferenciaci hematopoetických progenitorů. IL-6 indukuje produkci protilátek B-lymfocyty. IL-11 podporuje vznik NK buněk, a podílí se na zdravém vývoji placenty. IL-6 patří také mezi myokiny (myokiny - cytokiny produkované svalovými buňkami). LIF (široké spektrum buněk, zejména mezenchymálního původu) má zásadní význam v reproducki, je nezbytný pro usazení blastocysty v děložní sliznici a pro přežívání a růst spermatocytů. V průběhu neurogeneze indukuje vznik astrocytů z neurálních progenitorů, indukuje diverzifikaci některých typů neuronů (např adrenergní na cholinergní). Celkově s podílí na regulaci diferenciace motoneuronů. V hematopoése indukuje zejména diferenciaci buněk myeloidní řady. Blokuje transport lipidů do adipocytů. V játrech indukuje produkci proteinů akutní fáze zánětu. Podílí se na růstu kostí, zvyšuje resorpci vápníku i počet osteoklastů, zároveň zvyšuje i počet osteoblastů. Působí hypertrofně na svalové buňky (i srdeční). Je hlavní regulátor produkce ACTH. Bone formation Acute phase proteins Embryonic stem cells Osteoblasts Pituitary Adipocytes / Lipid ransport LIF ACTH ^Uterus _//_^Blastocyst implantation Hematopoietic^—**Stem cells S^T^ Platelets Muscle Neurones \ Ovarv\J"eStlS \! cells ^—< * / Autonomic Regeneration signalling Neuronal survival Macrophage / Dendritic cells 's V* Leukemic cell suppression Thymic lymphocyte maturation Corpus Luteum Spermatogenesis CNTF, CLC, CT-1 a NPN (hlavně neurální buňky-glie, astrocyty) působí zejména v průběhu neurogeneze, podobně jako LIF. Svaly produkovaný CT-1 reguluje jejich spojení s motoneurony, podporuje přežívání a růst kardiomyocytů. CNTF brání demyelinizaci neuronu. Uplatňují se ovšem i v hematopoése. (2.3 % Japonců jsou CLC -/-, myši mají podobný fenotyp jako CNTF -/-) OSM (monocyty, lymfocyty) v hematopoése regulace trombopoesy a erytropoésy, v neurogenezi podpora motoneuronů. LIF a IL-11 a zahnízdění (implantaci / nidaci) blastocysty ve sliznici dělohy (endometriu) a) estrogen a progesteron, zvyšují proliferaci a diferenciaci buněk sliznice b) Estrogen indukuje produkci LIF žlázkami endometria. LIF je produkován do lumen dělohy kde aktivuje buňky luminálního epitelu k produkci mnoha genů zahrnujících i faktory buněčné adheze jako jsou Coch a CD9. c) Invaginující blastocysta spouští procesy decidualizace řízené prostaglandiny (produkovanými Cox-2) a IL-11 Control LIFA Vliv antagonistů (LIFA & IL11A) na průběh implantace blastocysty do endometria dělohy. No implantation sites Reduced size of implantation sites LIF > uterine lumen endometrium Požkození způsobené nadbytkem LIF Myším byly transplantovány buňky produkující zvýšené množství LIF. Tyto buňky se přednostně usazují v kostní dřeni a ve slezine. Po 2-3 měsících dochází ke ztrátě hmotnosti, kachexii, nervozitě a hypermobilitě myší (A). Detekujeme také zvýšenou proliferaci v dřeni dlouhých kostí (B), kalcifikaci v játrech, srdci a svalech. Dále pozorujeme ztrátu tukové tkáně, atrofii thymu, absenci žlutého tělíska v ovariu, absenci spermatogonií v semenotvorných kanálcích (C). Nadbytek hyper-IL6 zesílení tlouštky stěn srdečních komor, hematopoéza mimo kostní dřeň, thrombocytózy, plasmacytomy, hyperplasie hepatocytů Myši deficientní k některému z IL-6 cytokinům jsou životaschopné a s výjimkou LIF a IL-11 -/- i plodné. Jsou však menší, s poruchami hematopoésy, adipopoésy, a s nedostatečnou imunitní odpovědí. LIF, CNTF, CT-1, CLC -/- mají také nedostatečně vyvinuté motoneurony a jejich propojení se svaly, jsou hypermotorické, ale na „pokraji smrti". Mnohem zásadnější význam má absence / nefunkční mutace jejich receptoru. IL-6R -/- ??? LIF-R - / - Myši hynou před a těsně po narození, zejména v důsledku chyb v neurogenezi, hematopoéze, celkovém metabolismu (hypoxie v důsledku špatně vyvinuté placenty) a nedostatečně vyvinuté kostry. IL-11Ra -/- Normální hematopoéza, ale změny v tvorbě kostní tkáně, neplodné samice v důsledku chyb ve vývoji placenty. Některé imbrední kmeny myší mají navíc IL-11-Ra2 OSM-R-/- Výrazné snížení krvetvorby, jak na úrovni progenitorů, tak v počtu periferních elementů CNTF-R - / - Poškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát CLF nepoškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát Gp130-/- Myši hynou během embryonálního vývoje v (8-12 den ~ organogeneze, 20-22 ds celkový), v důsledku poruch v hematopoéze, neurogenezi, kardiogeneze, hepatogenezi,... Tyto poruchy se objevují i v dospělosti, jak dokazují experimenty s tzv. kondiciovanými mutanty lFN-alpha sensitive cells Ca rdia c myocyte s (MX- Cre) (MLC2vCREKI) Proopiomelanocortin neuron cells ( POMC-Cre) Noradrenergic cells 0oA|iJ 1 (DBH-ÍCre) -MAIN Astrocytes (GFAP-Cre) Macrophages / Hepatocytes {Alfp-Cre) IMMUNE SYSTEM Endothelial cells (7ie2-Cre) Germ cells (TNAP-Cre) Gut epithelial cells (Villin-Cre) Význam transdukce signálu gp130 ve vývoji kostí (Sims 2008) Reported pbenotypes of gp!30-signaling cytokine and receptor component knockout mice Deleted co mpon en t Lethality Dwarfism Bone formation Bone resorption Trabecular bone vol. gp!30 (Kawasaki ct aL, 1997; Shin et ai.. 2004) Neonatal (neonate) Yes 4 Osteoblast ■ft-Osteoclast U Resorption U gp 130-STAT 1/3 (Sims etaL,2004) (adult) Yes gp!30-SHP2 (Sims et al, 2004) (adult) No ■ft Osteoblast ft Formation ■ft-Osteoclast ■fr Resorption f gpl30-SHP2.IL-6 (Sims et al.. 2004) (adult) No ■ft-Osteoclast ■fr Resorption IL-6 (Si ms et al.. 2005; Pol i et al.. 1994) (ad ul t) No IL-llR(Sims et al., 2005) (adult) Very mild 4 Osteoblast U Formation ii. Osteoclast U Resorption * IL-6 IL-llR (Sims et al.. 2005) (adult) Very mild 4 Osteoblast U Formation U- Osteoclast U Resorption LI F (Boze c et al.. 2008) (neonate) Yes ■ft-Osteoclast ■fr Resorption LiFR(Ware et al., 1995) (neonate) Neonatal ND U Osteoblast3 ■ft-Osteoclast ■fr Resorption CT-l (Walker et al., in press) (neonate) _ No 4 Osteoblast ■ft-Osteoclast U Resorption CT-l (Walker et al., in press) (adult) No U Osteoblast3 U Formation* ■ft-Osteoclast U Resorption * CNTFR (DeChiara et al., 1995) Neonatal ND ND ND ND CLF (Alexander et al., 1999) Neonatal ND ND ND ND 3 Denotes an effect that is very mild or sex-specific. ILQ 1 IL6R IL1 1 GL I CL YxxV-l YxxQ-l YxxQ-l <—^ IL11R YxxV h-YxxQ YxxQ |-YxxQ YxxQ gp130 hornodimer YxxQ YxxQ -i -Yxx> -YxxQ YxxQ CNTF CNTFR -YxxQ -YxxQ --J-YxxQ gp130 heteradimers Ernst 2004 JAK - Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT - transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) Rovnováha mezi JAK/STAT a Ras/Erk signalizací při aktivaci gp130 receptoru Splenomegaly (IL6/sIL6Rtg) Thrombocytosis (IL6/slL6RTG) Physiological response Reduced APR (IL6K°) Blastocyst implantation (LIFK0) Thrombocytopenia (gp130flOM) Perinatal death (gp130KO) Perinatal death (LIFR|5K0) gp130 Signalling output Balanced Unbalanced Ernst 2004 Aberrant activation Physiological activation Impaired activation SHP2/ERK SiMM S TAT 1/3 SiMM Splenomegaly Enhanced APR Thrombocytosis (gp130^57F) Th1 cytokines Gastric adenomas (gp130y7ř7F; Auto-immune arthritis (gplStF759) Reduced APR (gp130A3TAT) Blastocyst implantation (gp130>STAT) Thrombocytopenia (gp130i3TAT) Perinatal death (gp13fJFxxQ) Th2 cytokines Synovial chondromatosis (gplSO^51*1) Biologická odpověd pro různě aktivní gp130 receptor gp130Y757F gp130F759 gp130Y757F/ STAT3He Wifd-type gp130iSTAT gp130F™Q gp130KO gp130-dependent STAT3 signal outp _ SHP2 SOCS3 STAT1/3 Hn<-*-, eďq^Ťi^~ cytoplasmic ) gp13Dwl -03—Mír-Mi-- ' gp130«57F C U1 c CL 05 i_ 15 o 'co g iľD w-c a* a*a^ ERK-SiMMs J gp13Q™9 > STAT1/3-SiMMs Ernst 2004 gp130:gp130 receptor gp130:LIFR3 receptor ■— APR ---Gastric adenoma -Blood platelets - - - Blastocyst implantation — Perinatal survival Regulace signální kaskády gp130 cytokinů je také regulovány specifickými protein tyrosin fosfatázami. V signalizaci gp130 cytokinů hraje klíčovou roli tyrosin fosfatáza SHP2. Zde (gp130 a LIFR) spouští signalizaci kaskádou Ras/Erk (MAPK) - kompetice s JAK/STAT. V případě zapojení OSMR, je nahrazena adaptérovým proteinem She. Komplex OSM / OSMR / gp130 aktivuje Erk (MAPK) dráhu přes She a ne přes SHP2 jako LIF-R a gp130. V některých případech je preferenčně je aktivována dráha Erk a STAT5. Antiviral, microbial, tumor responses Ceil survival Th 1 differentiation Tyk2 Jakl Jak2 Stat 2 [Stat IL 6 IL-1Í iFN-o/f}, iFN-y, IL-6, IL-11. OSM, LIF, CNTF G-CSF IL-2, IL 4, IL-7, IL-9, IL 13, IL-15 EGF, PDGF, CSF-1 IL-6, QSM, LIF CNTF, bptin TT2- IL-3, IL-S, GM-CSF EPO. GH, PRL, G-CSF EGF, PDGFf CSF-1 IL-2, IL-4, IL-7, IL-1S, IL-15 IFN-O/ß, iFM-y, IL-10 {+;-) IL-6, IL-II.OSM, LIF. GNTT G CSF ILř2 (+/-), JL-V (H-)r IL-C t+M GH (+/-)T PRL f+M, G-CSF EGF, PDGF, CSF-1 IFN-a iFUct, IL-10 IL 6. IL 11, OSM. HF CNTF, loplin IL-12 IL-2 (+/-), IL-7 (+/-), IL 9 GH. G-CSF EGF, PDGF Nol re ported Perinatal lethal Embryonic lethal Autosomal SCIDf analogous to X-hnkea yc deficiency Defects in antirricrobial defenses, mainly due to lack of IFM responses Nol reported ^mbf^iicjetha^ Stat-6 IL-12 IFN-ot, IL-10 IL-2, IL-7 IL-9, IL-15 IL-3, IL-5, GM CSF EPO, GH, PRL, GpC5F Laptin IL-4, IL 13 Leptin Loss of IL-12 responses such as Th1 differentiation Slat-5A: loss of mammary gland development and lactogenesis Slal*5B: loss of GH function including absence cl sexual dinmrphism in growth rate and liver gene expression and reduced fertility Slat'5AJB: as above plus loss of proliferation responses 1o IL-2 in peripheral T cells Loss of IL-4 resporees such as Th2 dilferenliation Liu, 1998 I aktivace (jaks) regulace STAT1 Tyr701 Ser727 STAT2 Tyr690 STAT3 Tyr705 Ser727 STAT4 Ser721 STAT5a/b Tyr694 Ser725/S730 STAT6 Tyr641 STATs jsou fosforylovány na serinech kinázami PKCd, Erk, JNK, p38. Význam této fosforylace a ani její přesný mechanismus není objasněn. Zdá se, že tato fofsforylace může zvyšovat transkripční aktivitu proteinů STAT. Další významné signální dráhy aktivované gp130 cytokiny aktivací JAK jsou: a) Tyrosin-kinázy Src rodiny: Hek (IL-6, LIF), cYes (LIF) b) PI3-K (fosfoinositol-3 kináza, PI3K -> Akt (PKB)) Obě tyto dráhy jsou zodpovědné zejména za pro-proliferační a anti-apoptické účinky gp130 aktivace. Aktivovaný receptor gp130 také asociuje s PKC6, jež fosforyluje jeho Thr890 a zvyšuje tak afinitu tohoto receptoru k STAT3. ALTERNATIVNÍ DRÁHY AKTIVACE STAT3 Aktivace prostřednictvím proteinů Hes (transkripční cíle signální dráhy Notch - protein Hes je schopen asociace s JAK2, jeho aktivace vedoucí k aktivaci STAT3 = fosforylace Y705 a dimerizace - sebeobnova neurálních kmenových buněk - propgrese nádorů Hes1/Hes5 1 Mastil, Ngn2 Regulace / zpětná vazba v transdukci signálu gp130 cytokinů Negativní zpětná vazba aktivace gp130 signální dráhy je zprostředkována indukcí exprese proteinu SOCS (I.), inhibice pak interakcí PIAS se STAT (II.) a defosforylací STAT fosfatásou Tc-PTP (III.). °0Ů Proteolysis Absence SOCS má v mnoha ohledech podobný účinek jako absence některého z komponet kaskády LIF->gp130->STAT3. Other proteins Nucleus Wormald 2003 Inhibice funkcí fosforylovaných gp130 receptoru a JAK proteiny SOCS SOCS (supresor signálu cytokinů / suppressor of cytokine signaling) - jejich exprese je indukována aktivací gp130 a dráhy JAK->STAT. Asociují s JAK, inhibují tak její aktivitu a tím je zastavena fosforylace / aktivace STAT (zpětná vazba). Jednotlivé SOCS proteiny vykazují jistou specifitu pro jednotlivé gp130 signální komplexy. SOCS proteiny = CIS (cytokine-inducible SH2 protein) a SOCS1-SOCS7. IL-6 (CIS, SOCS1,2,3), LIF (CIS, SOCS1,2,3), IL-11 (SOCS3), OSM (CIS, SOCS1,3) interaction with: JAK kinase domain phospho-Tyr Elongin B/C SOCS adaptors r::\ pto interaction! mode of action: inhibition competition SOCS target SOCS other (CIS) kinase activity with STATs stabilisation degradation degradation signalling Základní struktura jednotlivých SOCS proteinů Piessevaux 2008 SOCS hrají také významnou úlohu v signalizaci ostatních STATs aktivujících cytokinů zejména IFNs. Poruchy regulace exprese SOCS proteinů je často spojena s negativní prognózou u nádorových onemocnění nebo s auto-imunitními poruchami. - PIAS1 (STAT1) - PIAS3 (STAT3) - PIASxa - PIASxp - PIASy (STAT1) í s fosforylovanými STAT proteiny io jejich vazbě s DNA >u transkripci. Inhibice je často )teinů drahou podobnou ubiquitinaci. E3-Ubiquitjn II [Target protei rget protein rDeqradation^ Rakesh, 2005 CP Negative regulation DAC SUMOJ Transcription factor 'Transcription-fee tor-binding site Shuai & Liu 2005 Positive regulation p3O0 or CBP •%4 iUMO a) schematická struktura jednotlivých proteinů PIAS The SAP domain (scaffold-attachment factor A (SAFA) and SAFB, apoptotic chromatin-condensation inducer in the nucleus (ACINUS) and PIAS domain), which contains a conserved LXXLL amino-acid motif (where X denotes any amino acid); the PINIT amino-acid motif, which is present in all PIAS proteins except PIASyE6-; the RLD (RING-finger-like zinc-binding domain); the AD (highly acidic domain), which contains a SUM01 (small ubiquitin-like modifier 1 ^interaction motif (red) that is found in all PIAS proteins except PIASy and PIASyE6-; and the S/T region (serine- and threonine-rich region), which is also not present in PIASy and PIASyE6- b) některé ze signálních drah interagujících s proteiny PIAS a) Modulace reakcí imunitního systému, zejména útlum průběhu zánětu - antagonisté receptoru, inhibitory JAK a STAT aktivity b) Potlačení nádorových onemocnění - aplikace cytokinů a agonistů receptoru (leukémie), inhibitory JAK a STAT aktivity c) Potlačení neurodegenerativních onemocnění - aplikace zejména CNTF a jeho derivátů (ligand-receptor) d) Podpora hematopoézy - aplikace cytokinů e) Potenciálně zvýšení úspěšnosti IVF Vysoká promiskuita mezi receptory a cytokiny (zejména při vyšších dávkách), která často vede k nežádoucím vedlejším účinkům (kachexie, zánět, vyšší citlivost k infekcím) je řešena vytvářením solubilních komplexů ligand-receptor. Literatura ke studiu: 1. Akira, S. 1999. Functional Roles of STAT Family Proteins: Lessons from Knockout Mice. Stem Cells 17:138-146. 2. Auernhammer, C. J., and S. Melmed. 2000. Leukemia-Inhibitory Factor-Neuroimmune Modulator of Endocrine Function. Endocrine Reviews 21:313-345. 3. Ernst, M., and Jenkins, B.J. 2004. Acquiring signalling specificity from the cytokine receptor gp130. TRENDS in Genetics. 20: 23-32. 4. Heinrich, P. C, I. Behrmann, S. Haan, H. M. Hermanns, G. Muller-Newen, and F. Schaper. 2003. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem. J. 374:1-20. 5. Igaz, P., S. Toth, and A. Falus. 2001. Biological and clinical significance of the JAK-STAT pathway; lessons from knockout mice. Inflamm. res. 50:435-441. 6. Liu, K. D., S. L. Gaffen, and M. A. Goldsmith. 1998. JAK/STAT signaling by cytokine receptors. Current Opinion in Immunology 10:271-278. 7. Metcalf, D. 2003. The Unsolved Enigmas of Leukemia Inhibitory Factor. Stem Cells 21:5-14. 8. Murphy, M., R. Dutton, S. Koblar, S. Cheema, and P. Bartlett. 1997. Cytokines which signal through the LIF receptor and their actions in the nervous system. Progress in Neurobiology 52:355-378. 9. Rose-John, S. 2002. GP130 stimulation and the maintenance of stem cells. TRENDS in Biotechnology 20:417-419. 10. Taga, T. 1997. The signal transducer gp130 is shared by interleukin-6 family of haematopoietic and neurotrophic cytokines. Ann Med 29:63-72.