MALDI-MS analýza mikroorganizmů


Její výhodou je rychlé získání výstupních dat, která jsou obtížně dostupná u geneticky a
biochemicky obtížně odlišitelných druhů, např. druhů rodu Listeria, B. anthracis a B. cereus, kmeny
beta-hemolytických streptokoků skupiny A. Technika MALDI-TOF MS však poskytla jedinečné signály
těchto bakterií.

Důkazem typizace až po úroveň kmene jsou studie typizace kmenů methicilin-senzitivních (MSSA) a
rezistentních (MRSA) stafylokoků. Další studie získala charakteristické spektrum kmene E. coli
O157:H7 se specifickým signálem antigenu: m/z 9740.


·        rychlost analýzy a značná citlivost detekce, vysoká reprodukovatelnost a jednoduchá
příprava vzorku, detekce markerů široké palety mikroorganismů
  * Databáze

Referenční spektra jsou vytvořena za využití vhodných algoritmů a uložena na internetu (Demirev a
kol. 1999). Takto je např. dostupná knihovna PNNL obsahující referenční signály kmene B. subtilis
ATCC 15841 v TSB, E. coli a Y. enterocolitica v LB bujonu (Valentine a kol. 2005). Protože pro
mnohé bakteriální druhy je tato technika teprve ve stadiu optimalizačních procesů, databáze jsou
většinou placeny. Navíc proteinové databáze nejsou úplné v případě druhů, u kterých byla provedena
pouze částečná analýza genomu.
  * nízké detekční limity, až 10^ –15 mol
  * Analýzu je tedy při zamražení vzorku možno provést nezávisle na datu kultivace. I zaschlá kapka
vzorku ve směsi s MALDI matricí skýtá možnost analýzu opakovat; vzorek je v této podobě stabilní
několik dní. Obě situace jsou výhodné pro možnosti srovnávacích analýz. Toho je možno využít např.
pro krátkodobé srovnávací studie


Podle mnohých studií je  90 %  signálů hmotnostního spektra v rozmezí 500-10 000 Da. K typizaci
kmene může přispět detekce charakteristických proteinů. Biomarkerové proteiny mohou být
identifikovány sekvenováním či měřením přesné hmotnosti peptidů získaných enzymatickým štěpením



Postup přípravy vzorku pro MALDI-MS analýzu v mikrobiologické laboratoři (flowbox, vortex):


-          5-10 mg buněčného materiálu narostlé kultury rozmíchat v 900 μl sterilní DDW

-           dobře promýt buňky od media (vortex) (při použití buněk z kultivace v tekutém mediu
doporučuji dvojí promytí v DDW)

-          Centrifugovat 2 minuty při 4000-5000ot/min

-          Odpipetovat vodu po promytí buněk, dále pracujeme s peletem

-          K peletu buněk přidat 300 μl DDW a promíchat na vortexu

-          Přidat 900 μl 96 % ethanolu, promíchat na vortexu

-          Centrifugovat 2 minuty při 13 500 ot/min

-          Odpipetovat VEŠKERÝ supernatant

-          Pelet skladovat v lednici



Postup přípravy vzorku pro analýzu v laboratoři MS (kampus, přízemí, budova A2):











MALDI MS analýza vzorku bakteriální kultury: