Diagnostika stafylokoků
P01
Diagnostika stafylokoků
Mikrobiologický ústav LF MU
Stafylokoky
Grampozitivní koky, nejčastěji ve shlucích tvaru
hroznů, nepohyblivé a nesporulující
Velmi odolné (vyschnutí, vyšší koncentrace solí)
Rozdělení podle koagulace plazmy na
- koaguláza pozitivní (S. aureus)
- koaguláza negativní
Patogenní stafylokoky
Staphylococcus aureus
název z řeckého staphylé = hrozen
Jediný pro člověka běžně významný z tzv.
koaguláza pozitivních stafylokoků
Tento „zlatý stafylokok“ s oblibou způsobuje
hnisavé infekce kůže
a kožních adnex, otravy
z potravin
Virulenční faktory S. aureus
koaguláza – sráží krevní plazmu; znak patogenních
stafylokoků
fibrinolyzin – rozpouští fibrinové sraženiny
leukocidin (PV toxin) – lýza leukocytů
deoxyribonukleáza – znak patogenních stafylokoků
enterotoxiny – jsou produkovány v potravinách; způsobují
zvracení a průjmy
hyaluronidáza – enzym, který produkují stafylokoky a
usnadňuje invazivitu
adherence (přilnutí), pouzdro (proti fagocytóze), tvorba
biofilmu, PBP2a, enzymy degradující ATB beta-laktamázy
aj.
TSST-1 (toxin syndromu toxického šoku)
- způsobuje toxický šok
Některé kmeny produkují enterotoxiny
entrotoxikóza (intoxikace bakteriálním toxinem se,
na rozdíl od střevní infekce, projeví velice rychle;
obvykle také rychle odezní)
Exfoliativní toxiny (epidermolyziny)
- stafylokokový syndrom opařené kůže
Toxiny
Abscesy
Na rozdíl od streptokoků, které
vytvářejí ve tkáních zpravidla
neopouzdřené flegmóny, tvoří
stafylokoky spíše opouzdřené
abscesy (dutina plná hnisu)
Nejčastěji infekce kůže a kožních adneximpetigo,
folikulitida aj.
infekce močových cest
infekce dýchacích cest, pneumonie
(sekundární)
bakteriémie a sepse
katétrové infekce krevního řečiště infekce a
dalších implantátů - biofilm
Onemocnění způsobené S. aureus
hnisavé infekce měkkých
tkání - abscesy
hnisavé infekce ran
hnisavé infekce tvrdých
tkání - osteomyelitis
Stafylokoky s nízkou patogenitou - koaguláza
negativní stafylokoky
nejběžnější je Staphylococcus epidermidis (30 – 90 %
izolátů)
další, klinicky významní: S. saprophyticus, S. hominis, S.
haemolyticus, S. warneri, S.sciuri,S. capitis, S.
lugdunensis
jsou součástí normální mikroflóry, zejména kůže
v poslední době jsou velice významnými původci infekcí
u oslabených osob
způsobují: - infekce močových cest (S. saprophyticus)
- bakteriémie a sepse
- katétrové infekce krevního řečiště infekce a
dalších implantátů - biofilm
Léčba
 U stafylokoků je lékem volby oxacilin
 Makrolidy jen u alergických osob.
 Linkosamidy mají význam u infekcí
pohybové soustavy a opouzdřených
procesů.
 Glykopeptidová antibiotika (vankomycin a
teikoplanin) jsou v rezervě. Používají se u
kmenů rezistentních na oxacilin, takzvaných
MRSA.
Methicilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou
epidemiologicky závažné kmeny, rezistence k ßlaktamovým
ATB.
MRSA 2008- 2011
Diferenciální diagnostika
Gramovo barvení odhalí všechny bakterie, které
nepatří mezi grampozitivní koky
Pozitivní kataláza odliší stafylokoky od streptokoků a
enterokoků
Stejnou službu (a ve směsi mikrobů ještě lepší) udělá
kultivace na KA s 10 % NaCl
Rozlišení stafylokoků
Plasmakoaguláza volná je pozitivní u zlatého
stafylokoka, negativní u koaguláza negativních,
proto se tak také označují
Clumping factor neboli vázaná plazmakoaguláza
se používá stejně, ale je méně spolehlivá
Hyaluronidáza
Méně spolehlivé testy (nejsou důkazem)
Hemolýza: Koaguláza negativní stafylokoky mohou
produkovat jen delta hemolyzin, zlaté i alfa a beta,
mívají proto mnohem výraznější hemolýzu
Nazlátlé zbarvení kolonií a jejich větší průměr
může také napovědět
Větší shluky v mikroskopii jsou také typické
pro zlaté stafylokoky
V méně závažných klinických případech se
spokojíme s tím, že jde o koaguláza negativního
stafylokoka a netrváme na druhovém určení
Pokud je druhové určení potřeba (např. u
hemokultur), lze je provést biochemicky
V našich podmínkách se používá např. STAPHYtest
16 (Erba-Lachema)
Dourčení koaguláza negativních stafylokoků
Úkol 1: mikroskopie vzorku
Prohlédněte si mikroskopický preparát sputa,
obarvený podle Grama
Pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a
také po leukocytech (hlavně polymorfonukleárech),
které svědčí pro bakteriální zánět
Úkol 2: barvení kultur podle Grama
Obarvěte podle Grama předložené kmeny (K, L,
M, N)
(pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat
plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s,
alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit,
imerzní obj.)
Imerzní olej + imerzní objektiv!!
Úkol 3: popis kolonií na KA
Pečlivě si prohlédněte předložené kmeny
Popište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si
všímejte těch vlastností, které odlišují
stafylokoky od ostatních grampozitivních koků
(výrazný pigment, konzistence)
V úkolu 4 identifikujeme
stafylokoka tím, že roste
na KA s 10 % NaCl,
kdežto ostatní nikoli
Úkol 5 katalázový test (kolonie vmícháme do
kapky peroxidu vodíku). Pokud šumí, je to
stafylokok
Pozor! Pozitivní katalázu
má spousta bakterií,
vč. G- tyček a koků
Úkol 6a - vázaná koaguláza
komerční testy
jsou spolehlivější než
volná
plasmakoaguláza
Úkol 6b – volná koaguláza
Nejklasičtější z testů pro odlišení zlatého stafylokoka
Kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí plasmy ve
zkumavce
Pokud plasma zkoaguluje (má konzistenci želé), je
koaguláza pozitivní
Úkol 6c: Hyaluronidáza (test dekapsulace)
Princip testu: hyaluronidáza, produkovaná zlatým
stafylokokem (ne však koaguláza negativními
stafylokoky) rozpouští pouzdro bakterií tvořené k.
hyaluronovou (Streptococcus equii)
Ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu
streptokoka (ztráta „hlenovitosti“)
Hyaluronidáza
Úkol 7: rozlišení stafylokoků
STAPHYtest 16 – jak ho odečíst
STAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí.
Jako první se odečítá test VPT ve zkumavce.
Červená tekutina ve zkumavce = pozitivní VPT,
bezbarvá tekutina = negativní
První řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce
Druhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. reakce
Vypočítejte kód a porovnejte s
kódovníkem. Kód je šestimístný.
Prvních pět číslic je z trojic testů,
šestá číslice je z dvojice
Vyhodnocení destičkových testů
 Z takového testu dostaneme řadu výsledků –
většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát
štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní,
substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní).
 Příklad: + - + + + - - - - - - - - + + + +
 Je několik způsobů, jak takovou řadu převést na
„čitelný výsledek“:
 Porovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných
výsledků.
 Přepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu
kódů. Nejběžněji používáno
 Výsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne
vždy praktické
Oktalové kódy
 V praxi se každé trojici výsledků přiřadí číslice od
nuly po sedmičku – viz následující obrazovka
 Zaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí
 Pod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4
 Sečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“,
nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou)
Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN
Výsl. + – + + + – – –
1 2 4 1 2 4 1 2
Kód 5 3 0
Druhý kmen
(703 241 = S. epidermidis, 97,95 %, Tin=1,00)
1 2
H
3
G
4
F
5
E
6
D
7
C
8
B
9
A
10
H
11
G
12
F
13
E
14
D
15
C
16
B
17
A
První řádek panelu Druhý řádek panelu
+ S l l l l l l l l l l l l l l l l
- S l l l l l l l l l l l l l l l l
? S l l l l l l l l l l l l l l l l
+ + + - - - + + - - + - - - + + -
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2
7 0 3 2 4 1
Zkum
Úkol 8: citlivost k antibiotikům
 Odečtěte difusní diskový test – změřte
zóny a porovnejte s referenčními zónami
 Všiměte si, že S. aureus je relativně
citlivější než koaguláza negativní
stafylokoky.
Odečtení testu citlivosti
Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna
Oxacilin (protistaf. penic.) OX 13 mm
Cefalotin (cefalosp. 1. g.) KF 18 mm
Vankomycin VA 12 mm
Klindamycin (linkosamid) DA 21 mm
Rifampicin RF 20 mm
Gentamicin GN 15 mm