DIAGNOSTIKA STREPTOKOKŮ P02 Rod Streptococcus  G+, katalasanegativní koky  Tvoří dvojice či řetízky, nepohyblivé  Kultivačně poměrně náročné bakterie  Dělení dle hemolýzy (beta- hemolytické, viridující, nehemolytické)  Dále dělení na antigenní skupiny (A-Z) dle Lancefieldové Přehled streptokoků Změny na KA viridace (alfa) Streptococcus pneumoniae skupina „ústních streptokoků“ (beta) hemolýza* Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Skupina „non-A-non-B“ streptokoků žádná Streptokoky bez hemolýzy („gamáči“) Streptococcus pyogenes strepto = v řetízcích, pyo-genes = hniso-tvorný GAS- group A streptococcus  Úplná beta-hemolýza, drobné kolonie, kultivačně náročné  Původce angíny (akutní tonsilitidy)  Způsobuje ale také hnisavé záněty tkání. Na rozdíl od abscesů, často způsobených stafylokoky, jde zde spíše o flegmony.  Kromě angin má také na svědomí spály a erysipel – růži. Jde o kmeny produkující tzv. erythrogenní toxin (erythros = řecky červený) Tonsilitis („angína“) http://www.medicalook.com • Nejdůležitější a nejčastější bakteriální původce je S. pyogenes • Jiní bakteriální či viroví původci • Horečka, zduření podčelistních uzlin Spála Pokud kmen produkuje exogenní pyrotoxinytypická vyrážka a malinový jazyk Faryngitida nebo pouze kožní projevy Růže (erysipel) Ostře ohraničený zánět Na bércích, v obličeji Často recidivy Kožní hnisavé infekce Šířící se hnisavé infekce ran Pneumonie, meningitidy Sepse Streptococcus agalactiae GBS- group B streptococci • větší kolonie, neúplná beta-hemolýza • Tato bakterie způsobuje záněty mléčné žlázy s poruchou tvorby mléka, avšak většinou je to u krav. • U žen v urogenitálním tr. a GIT • Infekce novorozenců (časné a pozdní)- sepse, pneumonie, meningitidy • Inf. gravidních žen „non-A-non-B“ streptokok  Říkáme jim tak proto, že nepatří ani do skupiny A (ve které je Streptococcus pyogenes) ani do skupiny B (kde je S. agalactiae a některé zvířecí streptokoky).  Nezpůsobují tak často angíny, ale spíše faryngitidy – záněty hltanu. Často však mohou být přítomny v krku bez klinických potíží.  S. dysgalactiae, S. equi Streptococcus pneumoniae  čili „pneumokok“. Dříve se mu říkalo Diplococcus pneumoniae, netvoří totiž řetízky, ale jen dvojice.  Tvar buněk není ideálně kulatý, má spíše lancetovitý (kopíčkovitý) tvar. Opouzdřené buňky  Hlenovité bezbarvé kolonie (kapky oleje), nebo v R- fázi (netvoří pouzdro), alfa-hemolýza http://www.uni-tuebingen.de  V malém množství se nachází i ve farynzích zdravých osob.  Sinusitidy  Pneumonie  Záněty středouší  Meningitidy  Sepse  Endokarditidy  Očkování Viridující streptokoky  Neboli ústní streptokoky, alfa streptokoky,– všechny tyto pojmy označují skupinu streptokoků, které na krevním agaru viridují; obvykle se myslí „ty ostatní kromě pneumokoka“.  Jsou normální součástí mikroflóry ústní dutiny a částečně i faryngu. I za fyziologických okolností se neustále v malém množství dostávají do krve. Malér je, když se jich tam dostane hodně najednou a když narazí na terén, kde se uchytí (např. poškozené srdeční chlopně) Viridující streptokoky http://www.osel.cz S. salivarius http://microbewiki.kenyon.edu S. sanguis http://wishart.biology.ualberta.ca S. mutans Léčba  U streptokoků je stále lékem volby klasický penicilin.  Makrolidy se používají u prokázané alergie na penicilin.  Mezi léky další volby patří doxycyklin, kotrimoxazol, ampicilin a další.  Vankomycin je rezervní, zatím stoprocentně účinné atb (žádná zóna = chyba, nejde o streptokoka) Diagnostika streptokoků  Mikroskopie: grampozitivní koky  Kultivace: na KA kolonie šedé až bezbarvé, většinou drobné, větší kolonie má Streptococcus agalactiae  Hemolytické vlastnosti: některé viridují, některé částečně či úplně hemolyzují  Nerostou na KA s 10 % NaCl, ani na SlanetzBartleyově či žluč-eskulinové půdě. Jsou však (spolu s enterokoky) rezistentní na aminoglykosidy.  Biochemické testy: kataláza i oxidáza negativní, biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy zejména u viridujících.  Antigenní analýza může naopak pomoci spíše u hemolyzujících streptokoků. Používá se systém dle Lancefieldové – teoreticky zahrnuje všechny streptokoky, ale mnohé viridující nedisponují žádným antigenem v tomto systému. Skupiny mají písmena A, B, C, E, F, G a další. Diferenciální diagnostika  Při rozlišování streptokoků hodnotíme nejdříve hemolýzu – streptokoky členíme na viridující, hemolyzující (částečně či úplně) a ahemolytické  Pneumokoka od ostatních viridujících poznáme pomocí pozitivního optochinového testu  S. pyogenes se od ostatních hemolytických pozná pozitivním bacitracinovým a PYR testem  S. agalactiae se zase pozná pozitivním CAMP testem – o všech těchto testech viz dále Schematicky: Neznámá bakterie JinéG+ kok EnterokokStafylokokStreptokok Streptokok s viridací Streptokok s hemolýzou Streptokok bez hemolýzyPneumokok Ústní streptokok S. pyogenes S. agalactiae (SAG) Streptokok non-A-non-B mikroby.blox.pl Úkol 1: barvení kultur podle Grama  Obarvěte podle Grama osm kmenů (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.)  Jeden kmen vyloučíte snadno: bude to G- tyčinka. Další tři budou G+ koky a spolehlivě je tedy mikroskopií nedokážete rozlišit… Musíte postupovat dál Úkol 2  V úkolu 2a odhalíme stafylokoka katalázovým testem (kolonie vmícháme do kapky peroxidu vodíku). Pokud šumí, je to stafylokok  V úkolu 2b odhalíme enterokoka tím, že roste na Slanetz-Bartleyho půdě. Dříve se používala půda žluč eskulinová. Obě půdy jsou prakticky rovnocenné. Úkol 3: Popis kolonií streptokoků na KA  Pečlivě si prohlédněte a popište zbylé kmeny streptokoků.  Prohlédněte si i ostatní kmeny, všimněte si, jak moc se jejich kolonie liší od streptokoků. Popisovat je však nemusíte.  Popište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si všímejte těch vlastností, které odlišují streptokoky od ostatních grampozitivních koků a rozlišují je navzájem (absence pigmentu, hemolytické vlastnosti)  Pneumokoka odlišíte optochinovým testem – viz další obrazovka.  Podezření však můžete pojmout, když:  mikroskopicky vidíte lancetovité diplokoky  kultivačně jsou kolonie ploché, penízkovité až miskovité, někdy s centrálním vyvýšením  někdy naopak jsou kolonie výrazné, hlenovité to jsou kmeny s výraznou tvorbou pouzdra (zpravidla velmi virulentní) Pneumokok http://www.cbc.ca Úkol 4a: Optochinový test  Klasický test k odlišení pneumokoka od ústních streptokoků. Pneumokok je citlivý na antibiotikum optochin, ústní streptokoky jsou rezistentní.  Optochin se dnes už nepoužívá léčebně, zůstal tedy jen v diagnostice http://www.mc.maricopa.edu Úkol 4b: Druhové určení ústního streptokoka  Jen blázen (nebo badatel, což je někdy totéž) by druhově určoval ústního streptokoka z ústní dutiny nebo krku. Proč to činit, když je v těchto místech běžnou flórou?  Na druhou stranu, máme-li kmen z hemokultury či likvoru, je jeho určení na místě. U viridujících streptokoků nemá smysl snažit se o antigenní analýzu, zato, jak jsme se již dozvěděli, velice dobře lze použít biochemické určení.  V našich podmínkách je to STREPTOtest 16 STREPTOtest 16 – jak odečíst  První reakcí je opět VPT  Druhou až devátou reakcí je opět první řádek v dvojřádku  Obdobně desátou až sedmnáctou reakcí je druhý řádek v dvojřádku Úkol 5a PYR test  PYR test je provedením podobný oxidázovému. Na kolonie se umístí reakční ploška proužku. Počká se deset minut a přikápne se činidlo. Pozitivní je červené zbarvení. Streptococcus agalactiaeCAMP test  Mnohé bakterie tvoří hemolyziny  Pokud na agar působí dva hemolyziny, může být jejich působení synergické nebo antagonistické.  Příkladem synergismu je CAMP faktor Str. agalactiae a beta lyzin Staphylococcus aureus  Nelze jej použít k diagnostice zlatého stafylokoka – ne každý totiž produkuje beta lyzin! Používá se tedy jen v dg. streptokoků Úkol 5 b: CAMP test  Na agar se naočkuje testovaný kmen a kolmo k němu laboratorní kmen zlatého stafylokoka  V případě pozitivity vidíme zesílenou hemolýzu ve tvaru dvou trojúhelníků, anebo, poetičtěji, motýlích křídel Shrnutí Bacitracinový a PYR test CAMP test Streptokok pozitivní negativní S. pyogenes negativní pozitivní S. agalactiae negativní negativní non-A-non-B streptokok* pozitivní pozitivní nesmysl, špatný test, případně směs dvou kmenů *v případě potřeby se blíže identifikuje průkazem antigenu Úkol 5c- Latexová aglutinace Praktický test: lahvičky se směsí antibiotik a latexových částic Na obrázku určete, s kterým sérem testovaný kmen aglutinuje (vypadá jinak, než ostatní). A B C E F G Zapamatujte si: Streptokoky s hemolýzou (úplnou nebo částečnou), ale také streptokoky zcela bez hemolýzy mohou být zpravidla určovány latexovou aglutinací (je-li to zapotřebí). Jejich biochemická aktivita je zpravidla chabá. Streptokoky s viridací (alfa-streptokoky) lze zpravidla dále určovat biochemickými testy (je-li to zapotřebí). Jejich antigenní determinanty jsou zpravidla slabé Úkol 6: testy citlivosti na ATB  Odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a porovnejte s referenčními zónami  Opět: horší patogen (pyogenní streptokok) je citlivější než mírnější patogeny  Také si všimněte, že testy jsou provedeny na MH agaru s krvinkami nebo na krevním agaru. Na prostém MH agaru totiž většina streptokoků roste špatně nebo vůbec. Test citlivosti na streptokoky Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Penicilin (základní penic.) P 28 mm Cefalotin (cefalosp. 1. g.) KF 18 mm Erytromycin (makrolid) E 23 mm Klindamycin (linkosamid) DA 19 mm Chloramfenikol C 21 mm Doxycyklin (tetracyklin) DO 19 mm Vankomycin (glykopeptid) VA 17 mm Klindamycin se běžně testuje, vy ho však ve své sestavě nemáte! Pozdní následky streptokokových infekcí  Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky, včetně protilátek proti streptokokovému toxinustreptolyzinu O  Někdy se stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, ale naopak stoupá, omylem se místo na streptokoky vážou na některé struktury organismu.  V takovém případě jsou tedy nebezpečnější protilátky než samotný patogen  Indikací k vyšetření je podezření na tzv. pozdní následky streptokokových infekcí (akutní glomerulonefritida a revmatická horečka) ASLO: způsob, jak zjistit, kolik protilátek vlastně v krvi koluje  Pomocí testu ASLO zjistíte, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná autoimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky  Test ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Nejde tedy vlastně o nepřímý průkaz, přestože prokazujeme protilátky. Princip vyšetření ASLO: neutralizace hemolýzy ASLO- princip  Panel s pozitivní kontrolou a sedmi pacienty, ředění s koeficientem pouze 1,2  Titr nad cca 200 znamená riziko, že pacient je ohrožen pozdním následky streptokokové infekce Úkol 7: Odečtěte panel ASLO  Pozor! Každý pacient jen jeden řádek, hodnoty ředění jsou uvedeny na lístečcích, které máte na stole  Panel se odečítá naležato. Obsahuje pozitivní kontrolu a 7 pacientů. Rod Enterococcus  G+ koky v drobných shlucích či krátkých řetízcích  Vysoká odolnost – 6,5 % NaCl, žluč, azid sodný, pH 4,8 - 11  Jak napovídá rodové jméno – součástí normální mikroflóry střeva.  Jsou jedním z nejběžnějších původců močových infekcí  Nozokomiální infekce (rány, sepse, endokarditidy, implantáty aj.)  Primární rezistence k cefalosporinům  Nejčastěji E. faecalis (90%), E. faecium a další Enterokoky – vzhled kolonií Rod Listeria  G+ krátké tyčinky vyskytující se v prostředí a potravinách (mléko, sýry, zelenina, maso, půda, listí…),  Vyznačují schopností růst při nízkých teplotách (4 °C) (pohyb) a vysokých koncentracích NaCl či žluči  Kataláza +  L. monocytogenes, L. ivanovi, L. innocua aj. Listerióza (L. monocytogenes) - zřídka vyvolává viditelné infekce dospělých (gastroenteritida, horečnaté onemocnění) - je však nebezpečná pro těhotné a novorozence (bakteriémie, meningitida, pneumonie), a pro oslabené osoby (infekce ran, sepse, meningitidy) Korynebacteria  Korynebakteria jsou G+ tyčinky kyjovitého tvaru (koryné = kyj), některá jsou pleomorfní (různotvará), popřípadě i nekonstantně probarvená (gramlabilní)  Odolné k vyschnutí a koncentraci NaCl, nerostou však na MH bez krve  Kataláza +  Patří sem C. diphtheriae -původce záškrtu, dnes díky očkování u nás vzácný  Skupina tzv. nedifterických (= nezáškrtových) – jsou normální součástí běžné flóry na kůži, spolu se stafylokoky a kvasinkami Korynebakteria- tvary Záškrt Pseudomembranózní angina (pablány, otok) Záškrt vzniká pouze pokud kmen produkuje difterický toxin (ten do buňky vnáší tzv. b-fág) Rod Bacillus  G+ mohutné tyčinky s rovnými konci  Tvoří jednu endosporu, pohyblivé  Kataláza +  Většina příslušníků rodu Bacillus jsou neškodné mikroby, jejich spóry se vyskytují ve vnějším prostředí. Pokud se vyskytnou v kultivaci klinického vzorku, jde pravděpodobně o kontaminaci Jsou však i bacily stojící za zmínku  Bacillus anthracis se stal populárním při teroristických hrozbách. Obligátní patogen, původce veterinárního onemocnění – antraxu – byl jednou z prvních nákaz, proti nimž byla zkoušena (Pasteurem) vakcinace.  Bacillus cereus je původcem enterotoxikóz a infekcí oka. U imunokompromitovaných osob- infekce ran, endokarditidy, sepse.  Bacillus stearothemophillus a Bacillus subtilis se vzhledem ke své schopnosti přežívat při velmi vysokých teplotách používají jako indikátory účinnosti sterilizátorů. Léčba infekcí způsobených enterokoky a G+ tyčinkami  Na enterokoky ani na listerie neplatí cefalosporiny. U E. faecalis je výhodný ampicilin, u E. faecium je primární rezistence.  Dále se používá ko-trimoxazol, doxycyklin, jako rezerva vankomycin.  V poslední době se zejména u hematoonkologických pacientů objevují epidemiologicky závažné vankomycin rezistentní kmeny – VRE. Zde zabírá pouze nové antibiotikum – linezolid. VRE Diagnostika Enterokok Listerie Koryneform. Bacillus G+ koky v.krátkých řetízcích G+ tyčinky řetězící se jako špekáčky G+ tyčinky skládající se vedle sebe (palisády) G+ robustní tyčinky, sporulující (nemusí být viditelné) šedavé, velké asi jako Str. agalactiae, většinou bez hemolýzy, ale i s virid. či h. podobné entero- kokům, hemolýza je či není velmi drobné kolonie podobné mouce plsťovité kolonie, někdy i výrazná hemolýza KultivaceMikroskopie http://textbookofbacteriology.net Diagnostika- enterokoky  Biochemické testy: kataláza negativní, možné je biochemické rozlišení, důležité štěpení arabinosy (E. faecalis neštěpí, půda je zelená, E. faecium štěpí, žloutne)  Antigenní analýza se zpravidla nepoužívá. V  Citlivost lze testovat na běžném MH agaru. Existují i půdy na screening VRE Diagnostika-G+ tyčinky  Biochemické testy: kataláza u všech tří pozitivní. Biochemicky lze rozlišovat koryneformní tyčinky navzájem (API Coryne, Remel)  Růst při nízkých teplotách a vysokých koncentracích NaCl se používají v diagnostice listerií  Průkaz antigenu – například průkaz difterického toxinu Elekovým testem Úkol 1: Barvení kultur podle Grama  Obarvěte podle Grama osm podezřelých kmenů (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.)  Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné rozlišení G+ koků a vzájemné rozlišení G+ tyčinek musíte pokračovat dál. Úkol 2: Kultivace na krevním agaru  Popište všechny kmeny, které se v úkolu č. 1 barvily jako grampozitivní. Popište velikost, barvu, tvar, profil a hemolytické vlastnosti. Podle možnosti popište i další (povrch, okraje, konzistence, průhlednost, zápach).  Pokuste se odhadnout, který z G+ koků by mohl být stafylokok (bílý, máslovité kolonie)  Pokuste se odhadnout, která z G+ tyčinek je Listeria, Bacillus a Corynebacterium Úkol 3: Kataláza, Slanetz Bartley a žluč- eskulin  3a: Proveďte u všech grampozitivních kmenů katalázový test  3b: Zjistěte, které kmeny rostou na Slanetz-Bartelyho půdě s azidem sodným. To by měly být enterokoky.  3c: Na žluč-eskulinovém agaru roste ještě jeden kmen navíc. Ten, který zde roste, a přítom neroste na půdě s azidem sodným, by měl být Listeria Žluč-eskulinový agar Slanetz-Bartley Úkoly 4: rozlišení enterokoků  V úkolu 4b odečtěte výsledek EnCoccus testu. Má jen osm reakcí. Určete výsledek pomocí návodů na svých stolech. % pravděpodobnosti a index typičnosti nevyplňujte, protože nemáte jak je zjistit. Zelená negativní E. faecalis Žlutá pozitivní E. faecium  V úkolu 4a sledujte výsledek arabinózového testu (kolonie se smísily s arabinózou a indikátorem, a nechaly inkubovat) Úkol 5: Další testy k listeriím  5a – Růst při 4 °C – Ze všech námi studovaných G+ tyčinek jen Listeria je schopna růst při nízkých teplotách. To jí umožňuje šíření v sýrárnách. Z jiných bakterií (ne G+ tyčinek), roste při chladničkových teplotách několik dalších druhů (Yersinia, některé druhy pseudomonád apod.) 5b Chromogenní půda na listerie Existují různé chromogenní půdy k diagnostice listerií. Ta, která je na obrázku, se vyznačuje modrým zbarvením všech listerií; patogenní druhy navíc mají kolem sebe halo (odlišně zbarvené okolí kolonie). ALOA HALO www.oxoid.com Úkol 6: Odečtěte podle této tabulky Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna Ampicilin (aminopenicilin) AMP 17 mm Ko-amoxicilin (aminopnc*) AMC 18 mm Co-trimoxazol (směs 2) SXT 16 mm Doxycyklin (tetracyklin) DO 19 mm Chloramfenikol C 18 mm Vankomycin (glykopeptid) VA 17 mm *Aminopenicilin potencovaný inhibitorem betalaktamázy  Všimněte si, které bakterie testujeme na MH a které na MH s krvinkami.