GRAMNEGATIVNÍ
BAKTERIE II.
Rod Haemophilus
 Hemofily jsou krátké G- tyčinky, patří do čeledi
Pasteurellaceae
 V mikroskopu- od malých kokobacilů po
dlouhé tyčky
 Nerostou na ENDU,
dokonce ani na KA,
protože nejsou schopné
získat z krvinek růstové
faktory, které potřebují.
Klasifikace hemofilů
 Haemophilus influenzae
 pouzderný typ b (Hib)
 pouzderné typy a, c, d, e, f
 neopouzdřené kmeny
 Haemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a
mnohem méně patogenní), Haemophilus aphrophilus a
mnoho dalších druhů
 Haemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené
choroby ulcus molle
 Velmi běžná je přítomnost hemofilů v krku, přičemž
patogenní role je velmi pochybná. Zvlášť v případě
Haemophilus parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl
patogenem.
Haemophilus influenzae
 Dlouho považován za původce chřipky.
 Virulentní kmeny mají polysacharidové pouzdro
(a až f), nejčastěji typ b (Hib).
 Nejzávažnější choroby jsou invazivní infekce u
předškolních dětí - epiglotitida, meningitida,
pneumonie a sepse.
 Další časté choroby jsou otitis media a
sinusitida.
 Od r. 2001 očkování dětí
Růstové faktory hemofilů
 Hemofily vyžadují faktory z krvinek, avšak
jejich potřeba konkrétních faktorů je
specifická:
 H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD)
 H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin)
 H. influenzae vyžaduje oba faktory.
H. influenzae (vlevo),
H. parainfluenzae (vpravo)
www.medmicro.info
Pasteurella multocida
 Pasteurella multocida je běžnou flórou v dýchacích
cestách psovitých a kočkovitých šelem.
 U člověka způsobuje zejména zhnisání ran po
pokousání psem či jiným zvířetem.
 Má podobný charakteristický pach, podobný
hemofilovému, ale na rozdíl od něj roste na krevním
agaru (nikoli však na Endově půdě)
 Vypadá tam jako něco mezi streptokokem a
enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což
obvykle mikrobiologa „trkne“.
Gramnegativní nefermentující
bakterie
 Nejběžnější bakterie ze skupiny gramnegativních
nefermentujících baktérií je Pseudomonas
aeruginosa
 Mezi další patří např. rody Acinetobacter,
Burkholderia nebo Stenotrophomonas
 Striktně aerobní bakterie
 Obecně: Jsou to bakterie z vnějšího prostředí
(saprofyté), často rostlinné patogeny, „bakteriezbabělci“,
které si netroufnou na zdravého člověka.
Jejich terčem jsou pacienti s popáleninami, klienti
ARK, JIP, transplantačních center a podobně
Pseudomonas aeruginosa
 G- rovná tyčinka
 Charakteristický zápach (jasmín) a barva (zelený
pigment)
 Vyskytuje se v odpadní vodě, střevě obratlovců,
na rostlinách a v půdě
 Významný původce nozokomiálních nákaz,
kolonizuje vlhká místa pacienta (uši, podpaží,..)
 Infekce popálenin, těžké operativní výkony,
katétry, maligní procesy, cystická fibróza atd.
Výjimečný kmen
pseudomonády
s modrým
pigmentem
textbookofbacteriology.net
textbookofbacteriology.net
http://de.wikipedia.org www.uiowa.edu
Nefermentující a cystická fibróza
 Cystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění
plic s poruchou produkce normálního plicního
surfaktantu. To vede ke změněným
charakteristikám plic, včetně mnohonásobně
zvýšeného rizika infekce
 Nejčastějšími původci jsou:
Pseudomonas aeruginosa
Burkholderia cepacia
Staphylococcus aureus
Kmeny zpravidla získají polyresistenci.
Další „nefermentující“:
Pseudomonas fluorescens
http://www.bact.wisc.edu
Burkholderia cepacia
Burkholderia cepacia způsobuje hnilobu
cibule (Allium cepa), je to tedy typický
rostlinný patogen
Nozokomiální infekce
dýchacích cest
Burkholderia pseudomallei
• Burkholderia pseudomallei je
původcem těžkého onemocnění-
melliodiózy
• Příbuzná B. mallei způsobuje
zoonózu zvanou malleus čili vozhřivka
Nebezpečné i pro
člověka
Stenotrophomonas maltophilia
Původci respiračních infekcí, ranné
infekce, infekce močových cest
Acinetobacter sp.
http://www.buddycom.com
Z řečtiny: a-kineto- = „nepohyblivý“
Diagnostika hemofilů
a pasteurel
 Pasteurely rostou na krevním agaru
 Hemofily na krevním agaru růst neumí, rostou na
čokoládovém agaru
 Na KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která
jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou
bakterií je například zlatý stafylokok
 Mají droboučké kolonie, proto se používá disk
k odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve
vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu)
Satelitový fenomén
 Jak už víme, hemofily potřebují faktory
z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je
narušit. Narušení může obstarat
 zahřátí agaru (čokoládový agar)
 přítomnost jiného mikroba
 Satelitový fenomén představuje tu druhou
možnost, jak může hemofil získat faktory
z krvinek. Znamená růst hemofila pouze
kolem stafylokokové čáry.
Detekce hemofilů
Hemofily jsou
rezistentnější než
bakterie běžné flóry,
takže rostou uvnitř zóny,
ovšem jen kolem
stafylokokové čáry
(satelitový fenomén!)
www.medmicro.info
Diferenciální diagnostika G-
nefermentujících
 Endova půda: jak již víme, rostou na ní z klinicky
významných jen enterobakterie, příslušníci čeledi
Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující
tyčinky
 Nefermentující odliší to, že nefermentují glukózu
(např. Hajnova půda zůstává po kultivaci celá
červená, nezmění vůbec barvu)
K diagnostice nefermentujících
 Pseudomonády se zpravidla poznají:
 Mají typickou vůni (mladé kultury)
 Tvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či
rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na
KA či Endově agaru
 Mají pozitivní oxidázu
 Ostatní nefermentující musíme rozlišit
biochemicky, například NEFERMtestem 24
Úkol 1: Barvení kultur podle
Grama
 Obarvěte podle Grama podezřelé kmeny (pro
zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat
plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30
s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda,
osušit, imerzní obj.)
 Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné
stěny. Pro vzájemné G- tyčinek musíte
pokračovat dál.
Úkol 2: Kultivace bakterií
 Podívejte se na výsledky kultivace našich bakterií
na čokoládovém agaru, krevním agaru, Endově a
MH půdě. Popište morfologii kolonií na krevním
agaru. U bakterií, které na krevním agaru nerostou,
popište kolonie na čokoládovém agaru.
 Hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou
samy schopny je narušit, nerostou na KA
 Pasteurely na KA rostou, na Endu však nikoli
 G– nefermentující naopak rostou na všech
půdách
Úkol 3a: Satelitový fenomén
 Jak už víme, satelitový fenomén znamená
růst hemofila pouze kolem stafylokokové
čáry.
 Přítomnost satelitového fenoménu je
důkazem, že jde opravdu o příslušníka rodu
Haemophilus
 Kolonie jsou mrňavé, prohlížejte je důkladně!
Úkol 3b: Test růstových faktorů
hemofilů
Jeden disk obsahuje faktor X, druhý faktor V, třetí směs obou
Úkol 3c – antigenní analýza –
demonstrace výsledku
 Zapište výsledek aglutinace hemofilů dle obrázku
(jde o kmen K):
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Úkol 3d: detekce Pasteurella
typickým vzorcem citlivosti
 Žádné gramnegativní bakterie nejsou citlivé na
vankomycin. Vankomycin lze použít jen u
grampozitivních,
 Na druhou stranu, jen málo bakterií je citlivých na
penicilin, zvlášť mezi G– tyčinkami.
 Kombinace citlivosti k penicilinu a rezistence
k vankomycinu je poměrně specifická pro rod
Pasteurella.
Úkol 4: Hajnova půda pro detekci
G– nefermentujících bakterií
 Čtyři z našich kmenů rostly na Endově agaru
(vizte Úkol 2). Mohly by to být G–
nefermentující, Enterobacteriaceae či
Vibrionaceae.
 Typické pro G– nefermentující je chybění
jakékoli změny na Hajnově půdě (zůstává
červená, případná nahnědlá barva nevadí, je
Úkoly 5a: Oxidázový test
 Proveďte oxidázový test (pro připomenutí:
reakční ploška se přiloží na kolonie, pozitivita =
modré zbarvení)
 Z nejběžnějších G– nefermentujících tyčinek
má Pseudomonas oxidázu pozitivní,
Burkholderia zpravidla také;
Stenotrophomonas většinou ne a
Acinetobacter také nikoli.
Úkol 5b: NefermTest 24
 Pro přesnou biochemickou identifikaci G–
nefermentujících užíváme většinou Nefermtest
24 (nebo podobný jiných výrobců).
 Je to trojstrip (ne dvojstrip jako minulý týden)
 Kód se tu tvoří jiným způsobem:
 první číslice je 0 (oxidáza –) nebo 1 (oxidáza +)
 dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
 sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení
Úkol 6 – testy antibiotické
citlivosti
 Hemofily nerostou na MH agaru
 Zpravidla se používá Levinthalův agar
(přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou
zóny lépe viditelné než na klasickém
čokoládovém agaru
 V naší laboratoři se používá „hemofilový agar“,
což je půda blízká agaru Levinthalovu
 G– nefermentující naopak rostou ochotně na
nejrůznějších médiích
Upozornění
 Hemofily tvoří velmi mrňavé kolonie. Pokud je
očkujeme nahusto (jako při testování citlivosti
na antibiotika), jsou ještě mrňavější.
 Proto je na agaru není moc vidět. Je třeba
najít vhodné úhly mezi vaším okem, miskou s
hemofilem a dopadajícím světlem – zprvu se
zdá, že tam nic není!
Tabulka zón citlivosti – HEM
Antibiotikum Zkratka Referenč.
zóna*
Ampicilin (aminopenicilin) AMP 22 mm
Ko-amoxicilin (am.+inhib.) AMC 18 mm
Cefuroxim (cefalosp. 2G) CXM 20 mm
Tetracyklin (tetracyklin) DO 29 mm
Ko-trimoxazol (směs) SXT 16 mm
Azithromycin (makrolid) AZM 12 mm
Tabulka zón citlivosti –
neferm.
Antibiotikum Zkratka Referenč.
zóna*
Piperacilin + tazobaktam TZP 22 mm
Gentamicin (aminoglykos.) CN 18 mm
Imipenem (karbapenem) IPM 22 mm
Ciprofloxacin (chin 3 gen) CIP 29 mm
Ceftazidim (CS 3 gen) CAZ 16 mm
Colistin CT 12 mm
Zóny u hemofilů jsou často velké
a splývající, což studenty mate!
Jsou-li zóny tak velké,
že se nedají změřit,
tak je neměřte a
prostě rovnou napište,
že kmen je na dané
antibiotikum citlivý.
Zeleně jsou vyznačeny
hypotetické okraje zón
– všimněte si, že
z naprosté většiny buď
splývají, nebo jsou
mimo misku