DIAGNOSTIKA ANAEROBNÍCH BAKTERIÍ P07  Pokud chce klinik, aby byl jeho vzorek prověřen na přítomnost anaerobů, mykobakterií či aktinomycet, musí to uvést na průvodce. Musí se užít speciální postupy.  U dalších původců (třeba spirochet či chlamydií) se navíc zpravidla odebírá sérum a provádí se nepřímý průkaz http://de.wikipedia.org Praktická poznámka Rod Clostridium  Grampozitivní (relativně velké) tyčinky  Schopny tvořit spóry-vyklenují buňku  Rostou za anaerobních podmínek v prostředí s nízkým redoxním potenciálem, některé tolerují malé množství kyslíku v prostředí  Vyskytují se jako saprofyté ve střevě zvířat a člověka (hnilobné procesy), spóry v prostředí (v půdě, bahně rybníků, v řekách, v prachu i na vegetaci)  Jen málo patogenních druhů. Způsobují neurotoxikózy, enterotoxikózy, a nekrotizující infekce měkkých tkání (vysoká smrtnost) Neurotoxická klostridia Clostridium tetani  Štíhlé tyčinky tvořící endospóry uložené terminálně (paličky na buben)  Součást normální střevní mikroflóry savců, zejména koní, spóry v půdě  Původce tetanu (ztrnutí šíje) Tetanus • Endogenní (vagina či střevo člověka) či exogenní • Sporami infikované hlubší znečištěné či zhmožděné rány, v ráně klíčení spór • Za klinické projevy infekce je zodpovědný tetanický toxin, který blokuje inhibici motorických neuronů (brání uvolňování mediátorů této inhibice) • Projevuje se tonickými křečemi příčně pruhovaného svalstva Tetanus www2.bc.cc.ca.us Žvýkací svaly (trismus) Mimické svaly Spasmy svalů trupu Postižení dýchacích svalů Svalové ruptury, zlomeniny Srdeční zástava Tetanus www2.bc.cc.ca.us epistotonus Clostridium botulinum ● Ve střevním ústrojí zvířat, spóry v půdě, prachu, ve vodě, kontaminanta potravin ● Původce botulismu. ● Typy:  Kojenecký botulismus- toxin produkován ve střevě dítěte, C. botulinum se zde pomnoží  Traumatický botulismus  Alimentární botulismus Alimentární botulismus  Zde původce vůbec nevstupuje do těla. Jen jeho toxin (botulotoxin) vstupuje do těla (zpravidla z nedostatečně upraveného konzervovaného masa- domácí konzervy)  Opět účinkuje jako neurotoxin (zabraňuje uvolňování acetylcholinu do synapse a dochází k přerušení vedení vzruchu)  Vyvolává obrny- paralýzy příčně pruhovaných svalů gastrointestinální projevy, rozostřené vidění, ztížené polykání, poruchy artikulace, zástava střevní peristaltiky, zástava močení Botulismus Clostridium perfringens  Jeden z původců plynaté sněti (spolu s C. novyi, C. septicum aj.)- infekce měkkých tkání (nekróza kůže, podkoží a svalstva)  Plynatá sněť je typické válečné onemocnění. Může se však vyskytnout i při živelných pohromách  Klostridia plynatých snětí – respektive jejich enterotoxiny – se také uplatňují jako patogeny ve střevě  Exogenní a endogenní infekce Histotoxická klostridia http://www.geocities.com Clostridium perfringens www.medmicro.info Clostridium difficile  Tento mikrob se vyskytuje ve střevě celkem běžně, problém však je, když začne produkovat toxin, a především, když mu někdo odstraní konkurenci a on se přemnoží.  Odstranění konkurence způsobí nejčastěji léčba některými typy antibiotik, nejčastěji linkosamidy. Linkosamidy jsou účinné proti většině striktně anaerobních bakterií, nikoli však proti C. difficile.  Lehčí průjmová onemocnění až pseudomembranózní enterokolitidy (často nozokomiální nákazy)  Poškození střevního epitelu, kumulace tekutin ve střevě, nekróza nakažených tkání  Dnes se k léčbě používá nejčastěji bakteriální chemoterapeutikum metronidazol Clostridium difficile http://medecinepharmacie.univ-fcomte.fr http://www.health.qld.gov.ausitemaker.umich.edu C. tetani Původce tetanu C. botulinum Producent botulotoxinu Clostridium perfringens, C. septicum aj. Klostridia plynatých snětí (+ enteropatogenita) C. difficile Enteropatogenní Je potřeba si uvědomit, že i klostridia se úplně normálně podílejí na běžné střevní mikroflóře. Problém nastává, pokud se přemnoží, dostanou tam, kam nemají, vyskytne se kmen produkující velké množství toxinu apod. Přehled klostridíí Společné charakteristiky nesporulujících anaerobů  Vyskytují se jako běžná flóra:  v tlustém střevě tvoří 99,9 % celkového objemu mikrobů, je jich tam kolem jednoho kilogramu  v ústech mohou žít díky biofilmu – jsou do něj zavzaty tak, aby neměly přímý přístup ke vzduchu, který by je ohrožoval  v pochvě nejsou přítomny u všech žen, ale uvádí se, že asi 70 % žen nějaké anaeroby v pochvě má; pokud se zde ovšem přemnoží, jde o dysmikrobii, kterou je nutno léčit  Některé i na kůži www.microbes-edu.org  Při zánětu obvykle neexistuje jeden původce, ale uplatňuje se směs. Někdy se používá termín „Veillonova flóra“  Směs striktně anaerobních, ale i fakultativně anaerobních bakterií  Nesporulující striktně anaerobní mikroby mají vzhledem ke svým vlastnostem velmi omezené možnosti přenosu.  Velká část infekcí je tedy endogenního původu Přehled nesporulujících anaerobů (u člověka nejběžnější druhy) Koky Tyčinky G+ Peptococcus Peptostreptococcus Propionibacterium*** Eubacterium G- Veillonella Fusobacterium, Leptotrichia* Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas** *se zašpičatělými konci **s rovnými konci tyčinky ***není stoprocentní anaerob Bacteroides fragilis  Pleomorfní tvary (koky, tyčinky či vlákna)  Běžně obývají zažívací trakt, dutinu ústní či vaginu, kde se také mohou uplatnit jako patogeny Porphyromonas gingivalis  Hnědočerně pigmentované kolonie  Dutina ústní, Urogenitální trakt Prevotella melaninogenica  Černý pigment  Onemocnění HCD (anginy, sinusitidy) Gingivostomatitis: Prevotella gingivalis www.mamagums.com Fusobacterium sp.  Polymorfní bakterie (vlákna)  Pleuropulmonární infekce, chronické sinusitidy, mozkové abscesy… Peptostreptococcus sp. Veillonella sp. Diferenciální diagnostika– I  Mikroskopie: Má větší význam než u aerobů, vzhledem k morfologické různorodosti  Kultivace: Je nutno zajistit anaerobiózu pomocí anaerostatů či anaerobních boxů. U tekutých půd postačuje přelití parafinem. Používá se VL bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy  Biochemie: kataláza a oxidáza většinou negativní, možné vzájemné rozlišení biochemicky Diferenciální diagnostika– II  Pokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči, u botulismu jsou naopak patrné parézy. Tetanická myš Jak získat anaerobiózu  Mechanicky – VL bujony přelijeme parafinovým olejem  Fyzikálně – v anaerobním boxu se nahradí vzduch směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby  Chemicky – v anaerostatu se  z organických kyselin tvoří vodík a CO2  v druhé fázi na palladiovém katalyzátoru reaguje vodík s kyslíkem za vzniku vody, takže se kyslík spotřebovává Přelévání VL-bujonů parafinem www.medmicro.info, photo O. Z. Anaerobníbox(uvidítehoještějednou) www.medmicro.info, photo O. Z. Anaerostat Palladiový kalalyzátor (pod víčkem) nezbytný pro druhou fázi reakce Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) nutný pro celou reakci www.medmicro.info, photo O. Z. Úkol 1a + 1b: mikroskopie vzorků a mikroskopie kultur  Podezřelé kmeny již jsou obarveny podle Grama  Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné rozlišení musíte samozřejmě pokračovat dál  Anaerobní tyčinky jsou někdy velice různotvaré – v jednom preparátu najdete útvary od vláknitých až po prakticky kokovité Úkol 2a: Anaerostat vzduchotěsné víčko palladiový kalalyzátor (pod víčkem) konstrukce pro ukládání Petriho misek Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) šroubovací uzávěr tlakový ventil www.medmicro.info, photo O. Z. Úkol2b:Anaerobníbox www.medmicro.info, photo O. Z. zdroj anaerobních plynů prostor pro vkládání misek vstupy pro ruce personálu Úkol 3: Kultivace bakterií  Zjistěte, kde co roste, a to co roste, popište.  Všimněte si, že anaerobní bakterie rostou často v drobných, nepravidelných koloniích, které mají někdy výběžkaté okraje. Typický je pro ně také značný zápach.  Úkol 3a: Aerobní kultivace na krevním agaru umožňuje růst striktně aerobních a fakultativně anaerobních bakterií. Když tu tedy bakterie neroste, avšak roste na anaerobních půdách, je to striktní anaerob. Úkoly 3b a 3c  V úkolu 3b zapište vzhled kolonií bakterií na VL (krevním) agaru  V úkolu 3c zapište vzhled růstu kmenů bakterií ve VL bujónu  Všimněte si toho, že z našich čtyř kmenů jen dva jsou striktní anaeroby. Jeden je fakultativní anaerob a jeden je striktní aerob Úkol 4: Biochemické rozlišení  Používají se různé testy, v našich podmínkách především ANAEROtest 23 (Erba Lachema). Zapište výsledky jednotlivých reakcí („+“ nebo „-“) a spočítejte oktalový kód Výsledek určete podle kódové knihy POZOR – kódová kniha je rozdělená na několik částí podle morfologie anaerobních bakterií. Je třeba hledat v té správné části kódové knihy Úkol 5 – testy antibiotické citlivosti  Antibiotická citlivost se u anaerobů určuje na půdách, na kterých jsou schopny růst, tj. nikoli na MH agaru, ale zpravidla na VL krevním agaru  Lékem volby u většiny anaerobů je opět klasický penicilin. Rezistentní je však rod Bacteroides (rody Prevotella a Porphyromonas, které se z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé) Úkol 6a – průkaz tvorby lecitinázy  Tvorba lecitinázy se projeví precipitací kmene na žloutkovém agaru. Protože však lecitináz je mnoho a nás zajímá pouze lecitináza druhu Clostridium perfringens, prověřujeme, zda je lecitináza inhibovatelná specifickým antitoxinem. „Negativní I“ vůbec neprodukuje lecitinázu. „Negativní II“ produkuje, ale nějakou jinou, než nás zajímá Úkol 6b: Průkaz toxinu pokusem na zvířeti  Prohlédněte si obrázek tetanické myši. Podobně jako myš se do opistotonu dostává i pacient www.biotox.cz Obrázek Petra Ondrovčíka (1959–2007) Úkol 6c: Imunochromatografický průkaz toxinu C. difficile  Imunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent, podobně jako u reakcí ELISA či a imunofluorescence  Nejklasičtějším příkladem je těhotenský test  Týká se především kmenů Clostridium difficile produkujících toxin. V pozitivním případě je zpravidla viditelný proužek reakce i proužek kontroly . V negativním případě je viditelný pouze proužek kontroly.