P 08
Acidorezistentní
bakterie
 Jaké je složení G+ buněčné stěny?
Peptidoglykan (murein), řetězce kys. teichoové
 Jaké je složení G- buněčné stěny?
Tenká vrstva mureinu, nad ní vnější membrána
 Které bakterie se nebarví podle Grama?
Ty, které nemají buněčnou stěnu, nebo ji mají hodně
jinou než ostatní (acidorezistentní bakterie, spirochéty)
 Jaké znáte způsoby získání anaerobiózy?
Mechanický ve VL bujónech, fyzikální u anaerobních
boxů, chemický u anaerostatů
 Které rody bakterií tvoří endospóry?
Bacillus, Clostridium
 Jaká znáte patogenní klostridia?
C. tetani, C. botulinum, C. perfringens ad.
 Který toxin se prokazuje na žloutkovém agaru?
Lecitináza Clostridium perfringens
 Uveďte pár příkladů nesporulujícíh anaerobů.
Bacterides fragilis, Porphyromonas, Prevotella,
Fusobacterieum, Veillonella, atd.
 G+ nepohyblivé krátké rovné či lehce zahnuté tyčky,
vzácně větvící se formy
 obligátně aerobní, acidorezistentní i alkalorezistentní
 dlouhá generační doba (15-20 hodin), růst na speciálních
kultivačních půdách několik týdnů (4-6)
 vysoce hydrofóbní buněčná stěna s tzv. mykolovými
kyselinami, nelze barvit dle Grama
 schopnost přežívat uvnitř makrofágů –
významnou roli při infekci hraje tedy
buněčná imunita
 odolné k vysychání a chemickým látkám
 patogenní druhy: M. tuberculosis, M. bovis, M.leprae
 Pomalu rostoucí druhy:
M. tuberculosis, M. leprae
 Rychle rostoucí druhy:
podmíněné patogeny či
saprofytické
druhy (M. fortuitum, M. chelonae)
cca 7 dní
Původci TBC:
 Mycobacterium tuberculosis (Kochův bacil, BK)
 M. bovis - tuberkulóza krav, vzácně i lidí –
infekce z nepasterizovaného mléka,
TBC krčních a mesenteriálních lymfatických
uzlin
 M. africanum- vzácně, TBC v tropické Africe
 Asi 1/3 populace nakažena.
 Infekce se projeví jen asi u 10% osob.
I. Primární TBC
- mykobakterie se dostávají do plic
(méně často přes zažívací trakt či rány)
a zde se množí do rozvoje buněčné imunity, poté
dochází k centrální nekróze, vzniká granulační
tkáň – granulom (lymfocyty, epiteloidní b.),
- mykobakteria se šíří do regionálních mízních uzlin
a vytváří se tzv. Primární tuberkulózní
komplex
- za klinické příznaky je zodpovědná imunitní
reakce organismu
Další průběh primární TBC:
• Spontánní celkové zhojení
• Granulom v plicích kaseifikuje či kavernizujelatentní
forma
• Hematogenní šíření- do různých orgánů. Miliární
tuberkulóza- napadá
několik míst zároveň
(v ledvinách, mozku
a kostech)
II. Postprimární TB
- u osob infikovaných řadu let po primoinfekci (asi u
10%)
- vzniká za předpokladu:
• Exogenní infekce- inhalací mykobakterií
• Progrese primární infekce
- tzv. otevřená tuberkulóza (tuberkulom)
- může probíhat bezpříznakově, ale u většiny
viditelné symptomy (kašel, hemoptysa,
zvýšená teplota, hubnutí,…), zasahuje
většinou plíce
 Podávání kombinace několika antituberkulotik
– zamezení vzniku rezistentních mutant
 Nejčastěji používaná: isoniazid, rifampicin,
pyrazinamid, ethambutol, streptomycin
 Obvykle 4- 12 měsíců- fáze:
 Iniciální- snížení počtu bakterií
 Pokračovací- sterilizace ložiska
 Multirezistentní TB (MDR TB)- onemocnění
vyvolané kmenem M. t. rezistentním minimálně
na kombinaci isoniazid a rifampicin
 Očkování- BCG vakcína
 Původce lepry
 Jeho generační doba je ještě výrazně delší (12-
14 dní)
 Postihuje periferní nervy- váže se na povrch
Schwannových buněk a ty kolonizuje (v kůži,
podkoží, na obličeji, v kostech prstů)
 Základní léčba lepry není drahá (dapson,
rifampicin) bohužel v zemích, kde se lepra
vyskytuje, je i tato poměrně nízká cena příliš
vysoká
Dlouhá ID- 2-3, 7 a více let
Tuberkuloidní lepra
- na kůži necitlivé depigmentované
skvrny, zduřelé periferní nervy
- výrazná celulární imunita
- spontánní zhojení
Lepromatózní lepra
- nedostatečná celulární imunita
- dochází ke splývání a zduření
kožních lézí
- obočí vypadává, propadá se nos,
slepota, ztráta prstů
Lepra
Atypická mykobakteria
 Kromě M. tuberculosis a M. leprae existuje i spousta
dalších mykobakterií. Některá, např. Mycobacterium
marinum, patří mezi tzv. atypická mykobakteria, která
občas způsobují infekce ran a jiné problémy (fish tank
granuloma, swimming pool granuloma).
 Některá jiná mykobakteria jsou
nepatogenní a jsou normální
součástí lidské mikroflóry,
např. M. smegmatis
Actinomyces israelii
 jsou to anaerobní bakterie
 vláknité bakterie, v podstatě grampozitivní, ale barví
se Gramem špatně, protože jejich buněčná stěna je
hodně hydrofobní a obsahuje hodně mykolových
kyselin
 běžně se vyskytují v ústní dutině zdravých osob,
odtud se za různých okolností mohou dostat do
měkkých tkání krku, tváře či hrudníku- aktinomykóza
(abscesy)
 v poslední době hlavně infekce dělohy u žen s
nitroděložními tělísky
 G+ aerobní, půdní bakterie
 U lidí s oslabenou T-imunitou - lokalizované
infekce plic, diseminace - mozkové abscesy
 Tropy (N. brasiliensis) – podkožní abscesy
 Mikroskopie: Používá se Ziehl-Neelsenovo barvení
 Kultivace: Používá se speciálních půd, přičemž před
vlastní kultivací předchází moření, obvykle louhem.
Cílem moření je usmrtit ostatní bakterie, které by při
svém rychlém růstu byly kultivačně úspěšnější.
Alkalirezistentní mykobakteria moření přežijí.
 Automatická kultivace: Používá se různých typů
kultivačních automatů: mohou detekovat kultivační
pozitivitu mnohem dříve než klasická kultivace
 Biochemické rozlišení je možné, je však vyhrazeno
specializovaným laboratořím
 PCR diagnostika se stává čím dál důležitější
Úkol 1a: Barvení dle Ziehl-Neelsena
 V prvním kroku barvíme
karbolfuchsinem za horka
až do výstupu par, bez
zahřívání by mykobakteria
vůbec nešlo obarvit.
 V druhém kroku odbarvujeme
„kyselým alkoholem“, což je
směs alkoholu s minerální
kyselinou, nejčastěji HCl
 Ve třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém
kroku odbarvili. Dobarvujeme malachitovou zelení nebo
metylenovou modří.
Výsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém
nebo zeleném pozadí
Úkol 1b: Mikroskopie mykobakteriální
kultury
Úkol 1c – mikroskopie nokardií a
aktinomycet
 V úkolu 1c popište preparáty barvené podle
Grama. Uvědomte si, že částečně rezistentní
aktinomycety a nokardie se dle Grama barví, i
když špatně. Jsou také pleomorfní (různotvaré).
 Před kultivací musí být provedeno moření
 Používáme tekutou půdu Šulovu či Baničovu a
vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu.
 Dlouhá generační doba (>20 hod) - výsledky se
odečítají po 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace.
 Aktinomycety –VLA, za anaerobních podmínek,
nokardie KA
Úkol 2: kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií
K tekuté Šulově půdě
 I pozitivní zkumavka je na první
pohled čirá, protože nárůst
mykobakterií je patrný jen u dna
 Nelze používat difúzní diskové testy
 Antituberkulotika přidáváme přímo do kultivační půdy
 Antituberkulotika jsou zvláštní látky, až na výjimky odlišné
od antibiotik
 Vždy se užívají kombinace tří či čtyř:
rychle totiž vznikají rezistence, navíc
některá působí jen intra- a jiná zase
extracelulárně
 Mykobakterium roste  je rezistentní
 Mykobakterium neroste  je citlivé
Antibiotikum Zkratka
Isoniazid H, INH
Ethambutol E
Rifampicin R
Pyrazinamid Z
Streptomycin S, STM
Úkol 3a: testy antituberkulotické
citlivosti
Úkol 3b: Testy antibiotické citlivosti
Antibiotická citlivost se na rozdíl od mykobakterií dá u
nokardií a aktinomycet stanovit difusním diskovým
testem. Musíme ale počítat s tím, že rostou pomalu
a špatně
Posuďte, kteří pacienti jsou pozitivní a kteří negativní v
PCR TBC. Jsou patrny nějaké případy inhibice reakce?
1, 2, 3, 4 = pacienti
číslo 1, 2, 4
5 = pozitivní
kontrola 6 =
negativní kontrola
7 = ladder (žebříček)
horní řádek =
proužek vzorku (c),
dolní = IC (b)
Úkol 4: PCR pro diagnostiku TBC
Úkol 5: diagnostika lepry
 Pásovec devítipásý
 Produkuje lepromin, který se používá k
leprominovému testu- obdoba
tuberkulinového testu
Test uvolnění interferonu gama
(Quantiferon© TB-GOLD)
 Moderní možností k ověření buněčné imunity je vyšetření
indukovaného uvolňování interferonu gama, v praxi
se používá prakticky výhradně komerčně dostupný test
Quantiferon TB-GOLD, proto budeme dále hovořit jen o
něm
 Bylo prokázáno, že při tuberkulóze, a to i latentní,
dochází k tomu, že tuberkulózní antigeny aktivují Tlymfocyty
a ty tvoří velká množství interferonu gama
 Podobně lze tyto T-lymfocyty aktivovat nespecificky např.
takzvaným mitogenem, ten se proto používá jako
pozitivní kontrola
Quantiferon – tři zkumavky
 Odebírá se nesrážlivá krev do tří zkumavek
(potřebujeme lymfocyty!)
 první zkumavka obsahuje mitogen (MIT) – zde by
mělo za normálních okolností vždy dojít ke stimulaci
tvorby interferonu gama
 druhá zkumavka obsahuje antigeny TBC (TB) – zde
by mělo dojít ke stimulaci tvorby interferonu gama
pouze u infekce TBC
 třetí zkumavka neobsahuje nic (NIL) – zde by za
normálních okolností nemělo docházet ke stimulaci
tvorby interferonu gama
Quantiferon – hodnocení
 Za pozitivní lze považovat výsledek, kdy Tlymfocyty
reagují na stimulaci antigenem
mykobakteria, avšak ve zkumavce neobsahující nic
nedochází k tvorbě inferferonu
 Za negativní lze považovat výsledek, kdy Tlymfocyty
reagují na stimulaci mitogenem, ale
nereagují na stimulaci antigenem mykobakteria
 Neurčitý výsledek se objeví v případě, že Tlymfocyty
nejsou aktivovány ani mitogenem, nebo
naopak se tvorba interferonu objeví i ve zkumavce,
kde nic nebylo
Úkol 6: Interpretace výsledku testu
Quantiferon TB Gold
Pomocí tabulky ve svém protokolu se pokuste
interpretovat následující výsledky testu Quantiferon TB
Gold examination u čtyř pacientů:
 Anna: MIT = 4,8 TB = 1,2 NIL = 1,1
 Berta: MIT = 5,3 TB = 4,8 NIL = 2,1
 Cecil: MIT = 0,9 TB = 0,9 NIL = 0,8
 Dimos: MIT = 8,4 TB = 8,3 NIL = 8,2
(všechny hodnoty jsou uvedeny IU/ml)
Úkol 6 – tabulka
NIL
TB mínus
NIL
MIT mínus
NIL
Konečná
interpretace
testu
Přítomnost
infekce
M. tuberculosis
≤ 8,0
< 0,35 ≥ 0,5 negativní
Nepravdě-
podobná
≥ 0,35
jakákoli
hodnota
pozitivní
Pravdě-
podobná
< 0,35 < 0,5
nejistá Nelze určit
> 8,0
jakákoli
hodnota
jakákoli
hodnota
*zjednodušeno; výsledek se také
může lišit podle varianty testu