SEROLOGICKÉ METODY
Metody lékařské mikrobiologie
• Přímé metody: detekce mikroba, jeho
části nebo produktu. Příklady:
Mikroskopie, kultivace, biochemická
identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita =
je jisté, že agens je NYNÍ přítomno.
• Nepřímé metody: detekce protilátek proti
mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal
hostitele v minulosti (nevíme, zda před
týdny / měsíci / roky)
Přehled metod přímého průkazu
Metoda Průkaz
ve vzorku
Identifikace
Mikroskopie ano ano
Kultivace ano ano
Biochemická identifikace ne ano
Průkaz antigenu ano ano
Pokus na zvířeti ano v praxi ne
Molekulární metody ano v praxi ne*
*netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů
Serologické reakce
Reakce mezi antigenem a protilátkou in vitro
Antigen = makromolekula pocházející z.cizího
organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha.
(Anebo sice z organismu vlastního, ale v tom
případě jde o přestárlé či vadné, popř. zvrhlé
buňky.)
V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny =
části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli
antigenní odpověď
Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele
(člověka, ale také zvířete) jako odpověď na
antigenní výzvu
Dva způsoby, jak využít interakci mezi
antigenem a protilátkou:
Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího
původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba.
Přímá metoda
Průkaz protilátky: laboratorní antigen
(mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor)
pacienta
Nepřímá metoda
Interpretace
• Průkaz antigenu je přímá metoda.
Pozitivní výsledek znamená přítomnost
mikroba v těle pacienta
• Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda.
Nicméně jsou způsoby, jak alespoň
odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem
pacienta setkal:
– Množství protilátek (relativní – titr) a jeho
změny v čase (dynamika titru)
– Třída protilátek: IgM/IgG
Jak interpretovat nepřímý průkaz
• Akutní infekce: velké množství protilátek,
převážně třídy IgM, případně IgM i IgG
• Pacient po prodělané infekci: malé množství
protilátek, pouze IgG (imunologická paměť)
• Chronická infekce: různé možnosti podle
aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod.
1
1
2
2
Průběh protilátkové odpovědi
• Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také
jako první mizí. Neprocházejí placentou,
jejich průkaz u novorozence je
svědectvím jeho infekce
• Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají
jako paměťové přítomny dlouhodobě.
Procházejí placentou
(novorozenec je tedy může mít od matky)
Protilátky ostatních tříd
• Protilátky třídy IgA se u některých infekcí
vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se
uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u
infekcí, kde branou vstupu je sliznice
(například gastrointestinální)
• Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a
infestací červy. Zpravidla se však nestanovují
specifické IgE proti nějakému patogenovi
• S protilátkami IgD se v mikrobiologii
nepracuje
Titr
• Nejvyšší ředění, kde ještě vidíme
pozitivní reakci, se nazývá titr.
Dynamika titru
• Průšvih je, že každý má jinou úroveň
protilátkové odpovědi. Proto samotná
hodnota titru mnoho neříká
• Změna titru vypovídá více. Jde-li o
čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí,
nejprve stoupá, později zvolna klesá.
Proč nestačí samotný titr
Někdy se stane, že
málo reaktivní
pacient má i
v akutní fázi titr
dosti nízký
Velmi reaktivní
pacient naopak i
dlouho po infekci
titr relativně
vysoký
Párová a nepárová séra
• Párová séra = první vzorek je uchováván
v.ledničce, dokud nepřijde i druhý (10–14 dní).
Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný
vzestup se v tom případě má za signifikantní
pro akutní infekci.
• Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen
zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto
zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup
titru
• Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v
prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se
nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový
důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“
• V některých případech místo vzestupu
prokážeme pokles (subakutní infekce)
• Velikost titru rozhodně neodpovídá vývoji
klinických příznaků. Množství protilátek
často vrcholí, až příznaky zmizí.
Příklady různých projevů dynamiky titru
• 1 – 2: sérokonverze
• 3 – 4: vzestup titru
• 5 – 6: pokles titru
1.
PRECIPITACE, AGLUTINACE,
AGLUTINACE NA NOSIČÍCH
Precipitace a aglutinace
• Precipitace a aglutinace jsou dvě
nejjednodušší serologické reakce, kde
pracujeme opravdu jen s antigenem a
protilátkou bez dalších složek
• Buďto tedy dokazujeme antigen zvířecí
protilátkou, nebo protilátku
laboratorním antigenem
• Pouze ve druhém případě zjišťujeme
titry!
Precipitace, aglutinace, aglutinace
na nosičích
• Precipitace: Antigeny jsou ve formě
izolovaných makromolekul (jde tedy o
koloidní antigen)
• Aglutinace: Antigen je součástí buňky
mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby,
říkáme, že antigen je korpuskulární)
• Aglutinace na nosičích: Původně izolované
antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič
(latex, erytrocyt, polycelulóza)
Precipitace:
Antigeny jsou
ve formě
izolovaných
makromoleku
l (jde tedy o
koloidní
antigen)
antigen protilátka
Aglutinace:
Antigen je
součástí buňky
mikroba
(pracujeme
tedy s.celými
mikroby,
říkáme, že
antigen je
korpuskulární)
•Aglutinace na nosičích: Původně
izolované antigeny jsou navázány na cizí
částici – nosič (latex, erytrocyt,
polycelulóza)
Aglutinace
• Pozitivní – nepravidelný chuchvalec
• Negativní – malé pravidelné kolečko
Treponema pallidum pasivní
hemaglutinace (TPHA)
Pozitivní reakce je vznik „chuchvalce“, negativní
sedimentace částic na dno důlku. Je to červené,
jedná se totiž o aglutinace na nosiči, nosičem je
erytrocyt
Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují
polycelulózovými částicemi – můžete se pak setkat
se zkratkou TPPA
+++ ++ + +/-
- - Pozitivní
kontrola (různá míra pozitivity)
Pacienti (1, 2, 3)
TPHA
Negativní kontrola
Technické důlky
Kontrola
Vlastní reakce
Protilátky precipitací – RRR
(rychlá reaginová reakce)
• Detekujeme protilátky, které jsou pozitivní u
syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti
Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu
(látka, která se objevuje u syfilitiků)
• Pouze kvalitativně.
Sledujeme vznik
precipitátů
2.
KOMPLEMENTFIXAČNÍ
REAKCE
Komplement
• součást
nespecifické
humorální imunity
• složitý kaskádový
systém
• Aktivovaný
komplement se
váže na komplex
Ag-Ab
Komplementfixace (KFR)
• Komplement = jedna ze složek imunitní reakce
• Pro KFR používáme morčecí komplement.
Pacientův komplement je před reakcí inaktivován
teplem
• Komplement není schopen vázat se na samotný
antigen
• Komplement není schopen vázat se na
samotnou protilátku
• Komplement je schopen vázat se pouze na
KOMPLEX obou
Použití KFR
• KFR lze použít pro diagnostiku mnoha,
zejména virových infekcí
• Jako i jiné serologické reakce se KFR
používá k průkazu antigenu či protilátky
• Pro zjednodušení uvádíme pouze průkaz
protilátky- máme laboratorní antigen,
který konfrontujeme se sérem pacienta
(kde hledáme protilátky)
Princip KFR
• Sérum pacienta se smíchá s laboratorním
antigenem
• Přidá se komplement. V pozitivním případě se
naváže (komplex Ag-Ab)
• Ve druhé fázi přidáme indikátorový systémberaní
ery + amboceptor (králičí Ab proti
beraním erytrocytům)
• U pozitivní reakce zůstává indikátor nedotčen,
v opačném případě dojde k jeho hemolýze
Komplement
a jeho
vlastnosti
http://web.indstate.edu/thcme/
micro/comp_fix.gif
Pozitivní reakcezábrana
hemolýzy
Negativní
reakce- hemolýza
Co dělá komplement s
indikátorovým systémem
• K hemolýze je nutná přítomnost beraních ery,
amboceptoru a komplementu. Jinak k
hemolýze nedochází!!
• Beraní ery + amboceptor NENÍ HEMOLÝZA
• Beraní ery + komplement NENÍ HEMOLÝZA
• Králičí ery + komplement + amboceptor NENÍ
HEMOLÝZA
• Beraní ery + komplement + amboceptor
HEMOLÝZA
Problémy s KFR
• Příliš mnoho komplementu  falešná
negativita. Co dělat? Titrovat komplement
• Některá složka séra sama o sobě vyvazuje
komplement (složka antikomplementarity):
falešně pozitivní výsledky. Co dělat?
Provést test antikomplementarity bez
antigenu
3.
NEUTRALIZAČNÍ REAKCE
Neutralizační reakce
• Protilátka často dovede neutralizovat či
inhibovat určitou biologickou vlastnost
antigenu
• Tento způsob se zřídka vidí u celých
bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo
bakteriálních toxinů
Příklady neutralizačních reakcí
Neutralizován Objekt Reakce
Toxin bakterie
(hemolyzin)
Erytrocyt
hemolýza
ASLO
Virus Erytrocyt
shlukování
HIT
Virus Buňka efekt
metabolický
VNT
ASLO
• Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky,
včetně protilátek proti streptokokovému toxinustreptolyzinu
O
• Někdy se stane, že množství těchto protilátek po infekci
neklesá, ale naopak stoupá.
• V takovém případě jsou tedy nebezpečnější protilátky než
samotný patogen
• ASLO není přímý průkaz, nepátráme po patogenovi,
určujeme samotné protilátky
• Indikací k vyšetření je podezření na tzv. pozdní následky
streptokokových infekcí (akutní glomerulonefritida a
revmatická horečka)
ASLO- princip
• Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu
(streptolyzin O) na krvinku. Pozitivní je tedy zábrana
hemolýzy se sedimentací krvinek (podobně jako u
KFR, ale ze zcela jiného důvodu)
• Panel s pozitivní kontrolou a sedmi pacienty, ředění
s koeficientem pouze 1,2
• Titr nad cca 200 znamená riziko, že pacient je
ohrožen pozdním následky streptokokové infekce
Princip vyšetření
ASLO:
neutralizace
hemolýzy
4.
REAKCE SE ZNAČENÝMI
SLOŽKAMI
Reakce se značenými složkami
• Na povrch (sklíčko, důlek mikrotitrační
destičky,…) se postupně navazují jednotlivé
složky
• Místo jedné ze složek se pokusíme navázat
vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že
danou složku možná obsahuje
• Je-li to pravda, složka se naváže
• Pokud se všechny složky postupně navážou,
vznikne nepřerušený řetězec
• Na konci řetězce je vhodné značidlo
Příklad pozitivního a negativního průběhu
Laboratorní
protilátka
Hledaný
antigen
Antigen
chybí
Značená laboratorní
protilátka (detekce)
Značená laboratorní
protilátka
+
–
Není navázaná 
je odplavena 
nemůže být detekována
POVRCH
(sklíčko nebo dno důlku
v destičce pro serologii)
Pacientův vzorek
Laboratorní
protilátka
Typy značidel
• Fluorescenční barvivo je značidlem
u imunofluorescence
• Radioizotop je značidlem u reakce RIA
• Enzym je značidlem u reakce ELISA
Western blotting je zvláštním případem
reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou
elektroforeticky rozděleny
Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední
složkou přidanou do reakce ještě příslušný
substrát – tedy jeden krok navíc.
Promytí a jeho význam
• Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to,
co se na nic nenavázalo, nedokázali
bychom odlišit pozitivní reakci od
negativní
• Proto po každém kroku reakce následuje
promytí, po kterém zůstanou přítomny
pouze složky navázané na pevný povrch
• Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí
vše za místem přerušení
I. Imunofluorescence
www.biologie.uni-hamburg.de
Odečítá se pomocí
fluorescenčního
mikroskopu
www.amsbio.com
přímá imuofluorescence
(Povrch)-(antigen)-(značená protilátka)
nepřímá imunofluorescence
(Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti
lidské protilátce)
A: Treponema pallidum – od pacienta
B: Značená protilátka proti Treponema pallidum (laboratorní)
C: Treponema pallidum – z laboratoře
D: Protilátka proti Treponema pallidum – od pacienta
E: Značená labor. protilátka proti lidské protilátce (konjugát)
II. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA – praktické provedení
• Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na
rozdíl od klasických serologických reakcí má každý
pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto,
že nezjišťujeme titry
• Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky:
–Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru)
–K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola
–Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“
s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“
pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus
mínus 10 %)
ELISA – ukázka
(www.medmicro.info)
ELISA – proč je tak oblíbená
• U reakce ELISA je na konci celého procesu
enzymatická reakce. Její intenzita se projeví
jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde
reakce probíhá. Sytá barva = vysoce
pozitivní.
• Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové
radiační nebezpečí je výhodou oproti
radioimunoassayím
• Možnost automatizace je velkou výhodou
oproti imunofluorescenci
ELISA k detekci
protilátky:
1. Pozitivní (hledá
se IgM, IgM
přítomna)
Všechny složky se
postupně navazují.
Dojde k.enzymatické
reakci – změně barvy
v důlku
ELISA k detekci
protilátky:
2. Negativní I
(hledá se IgM,
žádné protilátky)
V séru pacienta
nejsou protilátky.
Konjugát je odplaven,
v důlku není žádná
změna.
ELISA k detekci
protilátky:
3. Negativní II
(hledá se IgM,
přítomny IgG)
V séru pacienta jsou
jen IgG protilátky.
Konjugát je odplaven,
ke změně barvy důlku
nedojde
3.Western blotting
• Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů
je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé
antigenní determinanty
• Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam,
kde klasická ELISA troskotá na zkřížené
pozitivitě např. příbuzných
mikroorganismů
Western blotting – princip
1: původní antigen (směs)
2: uvolnění jednotlivých
antigenů detergentem
3: elektroforetické rozdělení
antigenů
4: „přesátí“ rozdělených
antigenů na nitrocelulózu
5: reakce ELISA (přítomny jsou
jen některé protilátky)
Western blot – vzhled
(obrázek z www.medmicro.info)
Možnosti uspořádání složek
• Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P)
• Povrch-protilátka-antigen-protilátkaznačidlo
(P, např. průkaz HBsAg)
• Povrch-antigen-protilátka-antigenznačidlo
(N)
• Povrch-antigen-protilátka-konjugátznačidlo
(N)
Konjugát je značená protilátka namířená
proti lidské protilátce
Význam konjugátu
• Konjugát se používá zpravidla u reakcí
nepřímého průkazu (průkaz protilátek)
• Je to protilátka, pro kterou je antigenem
lidská protilátka např. IgM nebo IgG
• Dokáže být selektivní proti určité třídě
lidské protilátky
• Použití konjugátu je tedy podstatou
možnosti selektivního průkazu
jednotlivých tříd protilátek
Reakce Pozitivní výsledek Negativní
výsledek
Aglutinace Nepravidelný
chuchvalec
Usazené ery
KFR Zábrana hemolýzy hemolýza
ASLO Zábrana hemolýzy hemolýza
Přehled sérologických reakcí