SEROLOGICKÉ METODY Serologické reakce Reakce mezi antigenem a protilátkou in vitro Antigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele (člověka, ale také zvířete) jako odpověď na antigenní výzvu Metody lékařské mikrobiologie • Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Příklady: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. • Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky) Průběh protilátkové odpovědi • Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce • Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou (novorozenec je tedy může mít od matky) Titr • Nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci, se nazývá titr. • Změna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. Párová a nepárová séra • Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý (10–14 dní). Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. • Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru • Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ • V některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce) 1. PRECIPITACE, AGLUTINACE, AGLUTINACE NA NOSIČÍCH Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromoleku l (jde tedy o koloidní antigen) antigen protilátka Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby, říkáme, že antigen je korpuskulární) •Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Aglutinace (k průkazu protilátek) • Pozitivní – nepravidelný chuchvalec • Negativní – malé pravidelné kolečko 2. KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE Komplementfixace (KFR) • Komplement = jedna ze složek imunitní reakce • Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován teplem • Komplement není schopen vázat se na samotný antigen • Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku • Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Princip KFR • Sérum pacienta se smíchá s laboratorním antigenem • Přidá se komplement. V pozitivním případě se naváže (komplex Ag-Ab) • Ve druhé fázi přidáme indikátorový systémberaní ery + amboceptor (králičí Ab proti beraním erytrocytům) • U pozitivní reakce zůstává indikátor nedotčen, v opačném případě dojde k jeho hemolýze Komplement a jeho vlastnosti http://web.indstate.edu/thcme/ micro/comp_fix.gif Pozitivní reakcezábrana hemolýzy Negativní reakce- hemolýza 3. NEUTRALIZAČNÍ REAKCE Neutralizační reakce • Protilátka často dovede neutralizovat či inhibovat určitou biologickou vlastnost antigenu • Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů Příklady neutralizačních reakcí Neutralizován Objekt Reakce Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO Virus Erytrocyt shlukování HIT Virus Buňka efekt metabolický VNT 4. REAKCE SE ZNAČENÝMI SLOŽKAMI Reakce se značenými složkami • Na povrch (sklíčko, důlek mikrotitrační destičky,…) se postupně navazují jednotlivé složky • Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje • Je-li to pravda, složka se naváže • Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec • Na konci řetězce je vhodné značidlo Příklad pozitivního a negativního průběhu Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (detekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná  je odplavena  nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka Typy značidel • Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence • Enzym je značidlem u reakce ELISA Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Promytí a jeho význam • Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní • Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch • Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení I. Imunofluorescence www.biologie.uni-hamburg.de Odečítá se pomocí fluorescenčního mikroskopu přímá imuofluorescence (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) nepřímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) II. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ELISA – praktické provedení • Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry • Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: –Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) –K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola –Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) • U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. ELISA – ukázka (www.medmicro.info) ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna) Všechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) V séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna. ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) V séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde 3.Western blotting • Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty • Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blotting – princip 1: původní antigen (směs) 2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem 3: elektroforetické rozdělení antigenů 4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu 5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky) Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Možnosti uspořádání složek • Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) • Povrch-protilátka-antigen-protilátkaznačidlo (P, např. průkaz HBsAg) • Povrch-antigen-protilátka-antigenznačidlo (N) • Povrch-antigen-protilátka-konjugátznačidlo (N) Konjugát je značená protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu • Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) • Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG • Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky • Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek P09 Spirochety Spirochety  Rod Borrelia, Treponema, Leptospira  Spirální bakterie, pohyblivé pomocí intracelulárních bičíků  Jejich buněčná stěna je blízká gramnegativní, ale podle Grama se nebarví  Mikroskopovat je lze pouze pomocí zástinu, fluorescence anebo imunofluorescence  Spirochety se obecně prakticky nedají kultivovat www.wadsworth.org Borrelie • Původci lymské boreliózy (Borrelia burgdorferi sensu lato) Borrelia burgdorferi sensu stricto (postižení kloubů a myokardu) B. afzelii (kožní příznaky) B. garinii (neuroborelióza) B. lusitaniae, B. japonica, B. bissetti • Původci návratných horeček (B. reccurentis, B. duttoni, B. hermsii) Lymeská borelióza Zoonóza Přenos členovci, především klíšťaty (u nás Ixodes ricinus) Vakcína není k dispozici Protilátky nalézáme u 10 % zdravých osob Lék volby: peniciliny, tetracykliny Infekce probíhá ve 3 fázích: Časné lokalizované st. - erythema migrans - nespecifické příznaky Časné disseminované st. - borreliový lymfocytom - neurologické, revmatologické či kardiální projevy Pozdní st. - acrodermatitis chronica atrophicans (končetiny, trup, obličej) Průkaz Borrelie: • Především sérologie, popř. PCR • Sérologii se stanovují IgM (svědčí pro časnou infekci) a IgG protilátky metodou ELISA • Pozitivní nález se ověřuje Western blotem, ten je specifičtější metodou Treponema pallidum  Původce syfilis (poddruh T. pallidum subsp. pallidum)  Syfilis je klasická pohlavní nemoc, přenáší se výhradně sexuálně. Jde ovšem o systémové onemocnění – v pokročilých stádiích postihuje celé tělo postiženého člověka  Některé poddruhy T. pallidum a některá jiná treponemata způsobují jiné choroby (framboesie – yaws, T. pallidum subsp. pertenue)  Některá treponemata jsou i nepatogenní- na sliznicích dutiny ústní a genitálu Průběh syfilis Časná syfilis • Primární syfilis (ulcerace na genitálu- tvrdý vřed) • Sekundární syfilis (diseminace, nespecifické symptomy, generalizovaná vyrážka, condylomata lata) • Časná latentní syfilis (asymptomatická, relapsy sekundární fáze) Pozdní syfilis • Latentní syfilis (cca 10-20 let) • Terciární syfilis (gummata, kardiovaskulární lues, neurosyfilis) Vrozená syfilis Treponemata: přímý průkaz  Přímý průkaz se dělá zřídka  Mikroskopie: Používá se nativní preparát – zástin, mimo to lze provést fluorescenční barvení  Kultivace ani biochemická identifikace se nepoužívají  Průkaz antigenu lze provést přímou IMF  Pokus na zvířeti: Existuje tzv. RIT – Rabbit infectivity test (test infekčnosti na králíkovi)  PCR diagnostika se stává čím dál důležitější Treponemata: nepřímý průkaz  Používají se netreponemové testy, kde antigenem je zpravidla kardiolipin a treponemové testy, kde antigen je získán opravdu z Treponema pallidum  Diagnostika se skládá ze screeningu a konfirmace. Konfirmuje se vše, co ve screeningu vyšlo pozitivní či aspoň hraniční, a dokonce i to, co bylo negativní, je-li důvod  Screeningově se zpravidla použije jeden netreponemový a jeden treponemový test, konfirmace se provádí pomocí velmi spolehlivých treponemových testů  Indikací ke konfirmaci je: – jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek screeningových testů – přítomnost suspektních lézí na těle, nebo anamnéza rizikového sexuálního styku – zde i v případě negativity obou reakcí Přehled nejdůležitějších nepřímých testů na lues Screeeningové RRR – Rapid Reagin Test Netr. TPHA Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluorescence) Western Blot TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test Rod Leptospira  Jemné pravidelné závity, na koncích háčkovitě ohnuté  Způsobují zoonózy- tzv. leprospirózy, člověk se nakazí kontaktem s močí infikovaného zvířete (myšovití hlodavci, prase, skot)- koupání, konzumací kontaminované vody či potravy  Příznaky mohou být různé, od „chřipkotyfových“ příznaků serovaru Grippotyphosa (blaťácká horečka) až po žloutenku a krvácivé stavy (Weilova choroba) serovaru Icterohemorragiae Průkaz Leptospiry: • Používá se zástinová mikroskopie a kultivace ve speciálním médiu Borrelie: úvod k úkolům 1 až 3  Máme pět pacientů, kteří z různých důvodů přicházejí k vyšetření na borreliózu. – Pacient J: klinicky definované erythema migrans (jasný obraz, ne jen podezření) – Pacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže nejsou přítomny – Pacient L: neurologové nalezli typické klinické příznaky neuroboreliózy – „Pacient“ M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a cítí se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o tomto riziku. – Pacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu, avšak není to jasné Úkol 1: ELISA – Borrelia Průkaz protilátek proti Borellia garinii Máte k dispozici výsledky reakce ELISA ve formě hodnot absorbance Pozitivní jsou pacienti s hodnotami vyššími nežli hodnota v kalibračním důlku (CAL). Ten se nachází v pozici A1, B1 a C1 jsou kontroly Prověřte výsledky pacientů J, K, L, M, N ve třídách IgG i IgM Pacienti – ELISA, jak jdou po sobě jednotlivá čísla pacientů: CA L 6 J 22 30 K+ 7 K 23 31 K- 8 L 24 32 1 9 17 25 N 2 10 18 26 34 3 11 19 27 35 4 12 20 28 36 5 13 M 29 37 CA L 6 J 22 30 K+ 7 K 23 31 K- 8 L 24 32 1 9 17 25 N 2 10 18 26 34 3 11 19 27 35 4 12 20 28 36 5 13 M 29 37 IgM IgG Úkol 2: Borrelie – konfirmace WB Konfirmují se pouze pacienti pozitivní v reakci ELISA, nebo indikovaní z klinických důvodů. V našem případě jsou to však všichni pacienti J, K, L, M, N (všichni byli v reakci ELISA pozitivní, s výjimkou pacienta J, který však má erythema migrans, takže je bez ohledu na negativitu ELISA indikován ke konfirmaci. Pozitivita WB je definována následovně:  u IgM považuje pozitivita v pruhu p 25, OspC  u IgG považuje pozitivita v pruhu VlsE Odečtěte tedy výsledky IgG i IgM u našich pacientů. Úkol 3: Borrelie – PCR PCR je reakce přímého průkazu, je tedy průkaznější než hledání protilátek, zvlášť u čerstvé infekce K reakci PCR jsou indikováni z našich pacientů pouze pacienti L a N. Zjistěte, který pacient je pozitivní Interní kontroly tentokrát nebyly použity Závěr k úkolům 1 až 3  J: Nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně pádným důvodem k léčbě)  K: Zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další diferenciální diagnostika  L: Skutečně jde o neuroboreliózu  M: Pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má pozitivní IgG)  N: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR, zřejmě zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných neuroinfekcích Úkoly 5 a 6: Serologie syfilis (screening a konfirmace )  V úkolu 5 vybereme ze screeningových pacientů ty, které je třeba konfirmovat  V úkolu 6 potvrdíme jejich diagnózu a učiníme konečný závěr  Pracujeme s pěticí pacientů:  A = těhotná žena (běžný screening, není zvýšené riziko syfilis  B = pacient s dva dny trvající lézí, která vypadá jako ulcus durum  C = pacient se suspektní lues latens  D = dárce krve (pouhý screening)  E = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis Úkol 5: RRR a TPHA U RRR je pozitivní důlek se zákalem (vypadá podobně jako pozitivní kontrola) TPHA: Prohlédněte si panel na bočním stole. Vyhodnocení pacientů A, B, C, D, E proveďte dle obrázku na následující obrazovce TPHA • Pozitivní – vzniká aglutinát, při pohledu shora chuchvalec nepravidelného tvaru • Negativní –klesají na dno a vytvářejí denzní pravidelnou kulatou tečku při pohledu shora +++ ++ + +/- - - Pozitivní kontrola (různá míra pozitivity) Pacienti (1, 2, 3) TPHA Negativní kontrola Technické důlky Kontrola Vlastní reakce TPHA – hodnocení: Výsledky – screening RRR TPHA závěr A + 0 konfirmace B 0 0 konfirmace* C 0 +++ konfirmace D 0 0 konfirmace není nutná E + +++ konfirmace *Výsledek je sice negativní, ale konfirmační reakce budou provedeny s ohledem na klinickou situaci Úkol 6: Konfirmace syfilis Konfirmační reakce I Výsledky reakce FTA-ABS: A B C D E konfirmace se neprovádí Konfirmační reakce II Hodnocení ELISA reakce: • Nejprve spočítejte cut off a nahraďte otazníky • c. o. = (C1 + D1)/2 • IgG: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní • IgM: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní Hodnocení Western blottu  Za pozitivní v IgG i v IgM považujte všechny pásky, na kterých umístění a uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole Výsledky - konfirmace FTA- ABS IgM IgG Závěr ELISA WB ELISA WB A 0 0 0 0 0 Nejde o lues. Asi falešně + (např. po očkování) B 0 0 0 0 0 PCR nutné. U čerstvé inf. je možná seronegativita C + 0 0 + + Opravdu jde o lues latens, jak se přepokládalo. D konfirmace neprovedena Dárce je v pořádku E +++ + + + + Jde o kongenitální syfilis. Vyšetříme také krev matky.