Cytologie a morfologie bakterií Anthony van Leeuwenhoek Z 50 – 275 x, 17.stol Janssenovi Z 9 x, ~1595 Anthony van Leeuwenhoek První nákresy bakterií (z ústní dutiny člověka) SEM Treponema pallidum útočící na membránu savčí buňky • phschool.com Zvláštnosti prokaryotické buňky •živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce •jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA •haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavně •bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická •ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL vyjma Archea: •5S, 16S a 23S rRNA • translace začíná N-formylmethioninem • geny pro RNA bez intronů •specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: • peptidoglykan (až na mykoplasmata) • steroly v membránách zcela výjimečně • bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací • anaerobiosa, schopnost vázat N • tvorba kyseliny PHB (zásob.l.) • pokud fotosyntéza - anoxigenní bakteriální ribozom G- G+ E. coli S. aureus peptidoglykan •Struktury a jejich konformace závisí • na buněčném stadiu! • - parazité, patogeni – vstup do hostitel.b. • (př: remodelace proteinů listerií) • - změna struktur při buněčném dělení •Mikroskopie – nutno zvoli vhodný typ dle • sledované struktury • př: EM – 3 typy – mesozomy, nukleoid, cytoskelet • - dehydratace, pokovování – agregace nukleoidu artefakty Cytologie bakteriální buňky Cytoplazma – difúze nebo řízené reakce? •Přeplněná ale organizovaná • př: 72 000 ribozomů v exponenc. fázi – specif. interakce s RNA • •Polarizovaná • polarita buňky dána - aktinovými centry • - umístěním CM receptorů • polarita zabezpečuje pohyb b., vstup do hostitele, adhezi b. • (receptory, pilli větš. na pólech buňky) • Cytologie – 1) buněčné struktury •metody výzkumu •PŘÍKLADY: •Složky peptidoglykanu (AMK, cukry) napomáhají při taxonomických studiích • - složení PG, barvitelnost b. stěny, • serologie, fagotypizace •Výskyt typ.inkluzí – pomoc při identifikaci •Bičík – vztah mezi strukturou a mechanismem otáčení, který je různý u různých druhů!! • jejich vztah k fyziologii a taxonomii Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! UKÁZKA_2 • rotace bičíku kolem vlastní osy – pouze u prokaryot • poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes CM • Regulace pomocí MCP systému = proteiny 27 Velikost a tvary bakteriální buňky velký poměr povrch/objem – velká plocha kontaktu buňky s prostředím •Velikost bakt b. v µm • •Chlamydia 0,3 x 0,3 •Bdellovibrio 0,8 x 0,3 •Rickettsia 1 x 0,3 •S. aureus 0,8-1 x 0,8-1 •E. coli 2-3 x 0,4-0,6 •B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 •Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 •Chromatium 25 x 10 •Spirochety 500 •Tvary bakt. buňky •Koky - sférické, oploštělé, lancetovité • - diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky •Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se, palisády pleomorfní •Kokobacily •Pupeny •Prostéky •Spirily •Hvězdice •Mycelia • 750 µm - největší známá prokaryotní buňka, objevená r.1999: Thiomargarita namibiensis Nejmenší (např. někteří příslušníci rodu Mycoplasma) měří 100 až 200 nm • • Morfologie •Buňky •Charakteristických shluků buněk •Buněčných útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra..) •Bakteriální kolonie Většinou druhově charakteristické = identifikační znak Pozor na: fázi růstového cyklu! endospory vyklenující buňku stáří kultury pleomorfní buňky Clostridium botulinum endospora buňka char.shluk kolonie sporangium spory Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Pleomorfní buňky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních buněk. Další potíž: Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní buňky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. Př: Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys Bacillus megaterium ccm 2007 (nativni48noma) Bacillus megaterium ccm 2007 (3-nativni24-hallo) sarcina-nativni_5 Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně) Je neznámý vzorek vůbec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? Fáze tyčka – kok? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem Bacillus anthracis Ústní mikroflora UKÁZKA 1 Lactococcus lactis Staphylococcus aureus na pokožce Proteus Streptomyces kolonie sporangium spory Produkce ATB Struktury G- buňky Le pto spi ra Morfologie buňky •PREPARÁT • - co chceme vidět? – podle toho preparát a typ mikroskopie • tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. • • • • • • pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence • barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra..) • typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. • rychlá příprava nativního preparátu barvení buněk a spor za horka a struktur Gramovo barvení světelná mikro- skopie Světelná Fázový kontrast Fluorescenční Elektronová… U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! •Př: tyčky bacilů •Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei •Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens Posuzujeme-li vzhled buňky kmene určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: •1) Prochází sledovaný druh růstovým cyklem? •- v každém z nich má pak buňka jinou morfologii! • Př: Chlamydia, Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. •Mění se nejen vzhled buňky, •ale buňka v cyklech prochází •typickou změnou vnitřních •struktur. Buněčný cyklus Caulobacter crescentus • Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie Morfologie buňky vprostřed buněčného cyklu • Životní cyklus rodu Bacillus - u některých jeho druhů i u jiných rodů navíc různá barvitelnost Gramem při různém stáří buněk – až gramlabilní při popisu preparátu nutno uvažovat stáří buněk! •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? •- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz Originál je k vidění: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis Endospory vs. exospory •G+ bakterie – endospory termorezistentní Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces •G- bakterie – exospory Méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání Azotobacter, Methylosinus ALE: Př: Coxiella je G- a tvoří endospory! •Konidie: Actinobacteria Azotobacter Sporosarcina – balíčky 8 buněk fázový kontrast •3) Stárnutím mění buňky tvar •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí -živiny, tlak, osmolarita… •5) pleomorfní buňky – př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma • Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální buňky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1μm velké buňky se v cyklu střídají s elementár.tělísky výběžky Cytologie a morfologie buněk v průběhu buněčného cyklu, ve fázích růstového cyklu, při dělení a smrti buňky Co je možno vyčíst z tvaru buňky •tvar buňky napovídá o metabolické aktivitě •(kokovité buňky vykazují max. metabol. aktivitu) •fáze růstového cyklu • Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci řetízky koků: Streptococcus řetízky bacilů: Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády koků: Micrococcus balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus • Mikrokolonie E. coli vznikající ze tří mateřských buněk (na agaru) - charakteristický vzhled vznikajících útvarů dělících se buněk u růz. rodů…. ASM Microbe Library. J. Shapiro and C. Hsu Morfologie bakt. kolonií • •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! • kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií • •Př: sledování morfologie kolonií • – univerzální media, jiný vhled na • selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?) • S-, R- a M-formy • sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) • Proteus Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních půdách Nocardia E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. půdách Jeden druh bakterie různá media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní až na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmenům E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních půdách DSCN0760 Kontaminace na misce! • • Děkuji za pozornost J Bezpečnost a zásady práce Plášť, přezůvky, skříňky, jídlo, pití Po vstupu do laboratoře či před zahájením práce prosím o mytí rukou; test účinnosti mytí rukou Stoly – před a po práci Incidur, ethanol MO – Biohazard group 0 Mytí rukou před návštěvou toalety!!! 29 !! : případně ethanol Kahan zapnutý jen po dobu práce s ním MO – Biohazard group 0 Nemluvit při očkování mikroorganismů Misky s bakteriálními kmeny otevírat co nejméně a po práci správně zavřít Sterilní práce – žíhání kličky v plameni kahanu.. 30 Popisování misek: zespodu, svrchu – dle metody!! O náplni cvičení se informovat předem Viz Studijní materiály - příprava Nevylévat nic do odpadu – stůl: odpadní nádobky Prosíme neodnášet kultury! 31