Vnější struktury bakteriálních buněk vs. buňky hostitele – adheze, invaze a remodelace hostitelských buněk Invaziny (OMP) LPS – enterotoxin lipid A Jak jsou indukovány změny některých struktur bakteriální buňky, a jak tyto struktury působí na přestavbu buňky eukaryotické Eukaryotický cytoskelet a jeho modifikace vlivem patogenů •Tendence – vždy vhodná nika pro přežití •Ovlivněn viry i bakteriálními patogeny •Regulace cytoskeletu vazbou na receptory či vstupem do buňky, a to: •Bakteriální toxiny •Aktin-regulující GTP-vázající malé proteiny •Cytoskelet hostitele slouží k: • - přilnutí, vstup do buněk, pohyb uvnitř a mezi buňkami, formování vakuol a remodelace, • zábrana fagocytózy... • Patogenita bakterií a eukaryotický aktinový cytoskelet •hraje roli při změnách (pohybu buňky a pohlcení bakterie) euk.CM při fagocytóze •a) interakcí bakteriálních produktů s receptory cytoplasmatické membrány za regulace cytoskeletu • b) přímým vstupem produktů do buňky •Intracelulární patogeni possess ligandy reagující s receptory a sekreční systém IV typu translokuje molekulyefektorů do cytoplasmy •Takto bakterie svými produkty manipulují aktinový cytoskelet pro promote jejich proliferaci •Stimulace polymerace aktinu a zvýšená fagocytóza bakterií!! •Rychlé násobení počtu bakteriálních buněk ve tkáních • • a) Intracelulární patogeni •Naopak, produkují substance vstupující do eukaryotické buňky a ničící síť aktinových vláken •Tím zabrání pohlcení a natrávení eukaryotickou buňkou b) extracelulární patogeni Faktory adheze Clostridium difficile při přilnutí na lidské enetrocyty ve střevě •Studium – monovrstva bněčných linií střevních buněk (střevní epiteliální Caco-2 a sliz produkující HT29-MTX), nikoli in vivo! •Růst za zahřívání a v přítomnosti krve •Mikroskopie: SEM •Interakce bakterií s microvilli epitelu, silná vazba na buňky mukózní vrstvy •Byly pozorovány hlavně dva povrchově-vazebné protejny 12 a 27kDa Průchod salmonel epiteliálními buňkami •Intracelulární parazity •Vstup do vakuol, replikace •V přítomnosti povrchů epiteliálních buněk se indukuje syntéza některých proteinů důležitých pro adherenci a invazi •Indukce proteinů stimulována trypsinsenzitivními a nueraminidázasenzitivními strukturami epitelu Přestavba cytoskeletu provázející prostup salmonel epitelem •Metodika: konfokální mikroskop, imunofluorescenční a elektronový •Po vstupu do vakuol buňky salmonel obklopeny 5-10 um struktur cytoskeletu • - rozsáhlými agregáty polymerizovaného • aktinu, alfa-aktininu a tropomyosinu krátce po přichycení (20-60 min) a tato vlákna zmizela po internalizaci • - tubulin rovněž agreguje.. • - studie: aplikace inhibitoru mikrofilament – cytochalasin D, který blokoval bakteriální internalizaci, ale nebránil akumulaci polymerizovaného aktinu •Salmonela po vazbě na povrch spouští přestavbu cytoskeletu Přestavba cytoskeletu vlivem proteinu Neisseria gonorrhoeae •Vstup do buněk tkáňové kultury po vazbě Opa (opacity outer membrane proteins) na proteoglykanové receptory •Cytochalasin D – látka přerušující mikrofilamenta - opět blokoval vstup buněk •Opět akumulace aktinových filament kolem buněk při jejich vstupu do hostitele Možnosti studií funkce struktur OMP •Známé sekvence genů pro invaziny •Transformace modelových MO (př: E. coli) těmito geny •Plasmid s genem fůzovaným s genem pro beta-laktamásu ve vedoucí sekvenci = E. coli (opa) •Oproti netransformovaným E. coli adherovaly na buňky určitého epitelu •Kinetika a stupeň invaze byly porovnatelné s hodnotami pro Opa+ N. Gonorrhoeae •Metoda studiua invaze: TEM •Invaze inhibována: cytochalasin D •TEM prokázala: buňky infikovaného epitelu vykazovaly dramatické snížeí filamentů LPS Lipid A •LPS = hlavní molekula buněč.povrchu G- bakterií •Vně VM •3 domény - koncový O-polysacharid, jádro=oligosacharid a lipid A •Lipid A – je esenciální pro přežití; endotoxin • - chemické modifikace (v závislosti na vnějšku!!!) • - tedy ovlivnitelný teplotou, pH... •Jádro – oligosacharid, několik glykoforem – 11 typů LPS •Metody popisu chemické struktury: • - tenkovrstevná chromatografie TLC, MS, (maldi, esi), • radioizotopové značení • Biosyntéza, transport a modifikace lipidu A= remodelace struktury! •Lipid A- fosfolipid na bázi glukosaminu •Konstitutivně syntetizovaný •Hydrofobní část LPS •Příčina septického šoku, vliv na patogenitu – aktivuje IS •Analýza strukturních genů pro lipid A •Ale – chemická struktura modifikovatelná vnějšími faktory!! •Modifikace lipidu A – strukturální změny – ekologická výhoda pro patogeny – strategie G- • •Izolace a charakterizace lipidu A: fyziologie bakterií, mechanismy ATB rezistence, imunitní odpověď hostitele, vývoj ATB • LPS Coxiella burnetii •Buňky fáze I a II !!! – S a R formy •Chemické a imunochemické metody •Vzácná D-glycero-D-manoheptóza •Unikátní cukry, které se nenašly v jiných LPS nebo i jinde v přírodě •(6-deoxy-3-C-methyl-L-gulosa = L-virenosa • a 3-C-(hydroxymethyl)-L-lyxosa) •Labilita vazeb v kyselém prostředí • • • •Extenzivní intra a interkmenová heterogenita glykoforem LPS Haemophilus influenzae