Růstové cykly bakterií Tvorba spory Buněčný cyklus Caulobacter crescentus Dělení bakteriálních buněk •Dělení binární •Dělení asymetrické •Dělení vedoucí ke vzniku diferencovaných populací • •Buňka vs. populace buněk Reprodukce bakterií •Před dělením musí buňka –dosáhnout potřebné velikosti –nahromadit dostatečné množství živin –být ve vhodných podmínkách –zreplikovat (zdvojit) genetickou informaci (DNA i plasmidy) –oddělit repliky DNA do příslušných částí buňky • Reprodukce bakterií •Generační doba (doba zdvojení) – doba mezi dvěma děleními buňky –v optimálních podmínkách 20-30 minut •Replikace DNA trvá déle než je generační doba, k iniciaci další replikace dochází před ukončením replikace –dichotomní replikace DNA –pouze u bakterií = replikace eukaryotické DNA probíhá paralelně na více místech –jedna bakterie se vlastně dělí naráz několikrát se časovým zpožděním Buňka – generační doba Bakterie Medium Generační doba (minuty) Escherichia coli Glucose-salts 17 Bacillus megaterium Sucrose-salts 25 Streptococcus lactis Milk 26 Streptococcus lactis Lactose broth 48 Staphylococcus aureus Heart infusion broth 27-30 Lactobacillus acidophilus Milk 66-87 Rhizobium japonicum Mannitol-salts-yeast extract 344-461 Mycobacterium tuberculosis Synthetic 792-932 Treponema pallidum Rabbit testes 1980 Reprodukce bakterií •Nejen binární dělení!! • • • • • • • • •Studije – vývoj nových terapeutik bránících dělení buněk...studium struktur a procesů dělení • Binary Fission Zdvojení genet.mat. Segregace nukleoidu Monomery FtsZ do středu buňky Ochrana cytoplazmy Syntéza b.s. Neobvyklé příklady reprodukce •Růst a mnohočetné dělení mateřské buňky •pučení Stanieria sinice 1um 30um Plancto Planctomycetes, Cyanobacteria, Firmicutes •Růst mateřské buňky: • Epulopiscium spp., Metabacterium polyspora and the Segmented Filamentous Bacteria (SFB) • - jako spory bacilů •In large Epulopiscium spp. this unique reproductive strategy begins with asymmetric cell division, see The Epulopiscium Life Cycle Figure. Instead of placing the FtsZ ring at the center of the cell, as in binary fission, (A) Z rings are placed near both cell poles in Epulopiscium. (B) Division forms a large mother cell and two small offspring cells. (C) The smaller cells contain DNA and become fully engulfed by the larger mother cell. (D) The internal offspring grow within the cytoplasm of the mother cell. (E) Once offspring development is complete the mother cell dies and releases the offspring. •Our lab studies the mechanisms of intracellular offspring development in Epulopiscium and Metabacterium polyspora. We are interested in what mechanisms are conserved between these unusual reproductive processes and endospore formation. We hope to gain an understanding of how this novel form of cell reproduction developed over time and how it benefits these intestinal symbionts. • Epulolife •Some Selected Reviews about Division and Unusual Modes of Reproduction •Alternatives to binary fission in bacteria. E. R. Angert. Nature Reviews Microbiology (2005) vol. 3, pp. 214-224. •Patterns of growth and development in pleurocapsalean cyanobacteria, J.B. Waterbury and R.Y. Stanier. Microbiological Reviews (1978) vol. 42, pp. 2-44. •Bacterial mitotic machineries. K. Gerdes, J. Møller-Jensen, G. Ebersbach, T. Kruse and K. Nordström. Cell (2004) vol. 116, pp. 359-366. •Bacterial cell division and the septal ring. D. S. Weiss. Molecular Microbiology (2004) vol. 54, pp. 588-597. • • • Komplexní růstový cyklus myxobakterií Agregace buněk Fruktifikační orgány Plodnice rodu Myxococcus Jednoduché růstové cykly •Adaptace či příprava (u sporulace) na změny podmínek životního prostředí; nikoli odpověď! •U parazitů: přechod z prostředí těla vyšších organismů ven •Jaké buněčné formy v doménách Bacteria a Archaea rozeznáváme? • •rostoucí a dělící se vegetativní formy buněk •struktury dovolující přežití nepříznivých podmínek (cysty odolné proti dehydrataci, ne však proti horku - Azotobacter, Myxococcus, Sporocytophaga, kdy je celá buňka obklopena protektivní vrstvou nad buněčnou stěnou) •rody Metylosinus and Rhodomicrobium vytváří termostabilní exospory. •Konidie - termosenzitivní asexuální reprodukční struktury produkované různými rody aktinomycet •endospory - odolná klidová nereproduktivní stadia s několika vyjímečnými charakteristikami, hl. u G+, vyj.G- Vegetativní a klidové stadium Tvorba spor •převážně G+ bakterie •– termorezistentní endospory •Bacillus (aerobní tyčky), Clostridum, Thermoactinomyces a Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces • •Výjimečně i G– bakterie (Coxiella burnetii, původce Q-horečky). • •G- bakterie – exospory •Méně rezistentní, odolné zejm.vůči •vysychání Azotobacter, •Methylosinus • sporacereus Fázový kontrast Bacillus megaterium – zelené spory obarvené varem v malachitové zeleni c Azotobacter – cysty Clostridium difficile C. perfringens •Azotobacter – pouzdra, cysty sureae5 Sporosarcina ureae – kulaté spory uvnitř čtveřice (balíčku) buněk •Oproti doméně Eucarya v buňce přítomna pouze jedna endospora • •Peptidoglykan v kortexu spory je zcela jiného charakteru než peptidoglykan samotné buňky vytvářející sporu • •Stabilizace makromolekul ve spoře: přítomností specifických bílkovin, dále ztrátou vody a její náhradou vápníkem (pouze zde přítomna v přírodě unikátní kyselina dipikolinová) • • •Vysoká odolnost napomáhá přečkat podmínky nevhodné pro život i po tisíce let (?); jsou prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí. • •Tvorba endospory však není odpovědí na prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky. Endospora, sporulace … s několika vyjímečnými charakteristikami… minimální obsah vody ----- minimální metabolismus •Odolné k působení UV a γ záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků. V ethanolu mohou přežívat několik měsíců. • •Sporicidní látky: • ethylenoxid, β-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin. • • •Jednou odstartovaný proces sporulace již nejde zastavit – regulace v uzlových bodech •Asporulační medium – glukóza • Pozorování endospor •Pozorovat neobarvené endospory můžeme fázovým kontrastem (zářící spory) nebo Nomarského kontrastem (plastický povrch buňky) • • • • • • •Jednoduchým barvením nezvýrazníme spory samotné, jen vyklenutí buňky (způsobené jejich přítomností). • Přímo obarvit endosporu od stadia vzniku kortexu je možné pouze za horka (prospora je pro barvivo ještě propustná!) C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\b.cereus.no marsky.spory8.jpg C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\spora.cereu s.fazovy.jpg Fázový k. Nomarského k. vysoce světlolomné útvary Nebarví se Gramem • • •Diagnostické Gramovo barvení určí G+ a G- typ buněčné stěny; souběžné strukt. barvení spor u suspektních sporulujících druhů zvýrazní: •Tvar, velikost a umístění spory v buňce je dalším charakteristickým znakem napomáhajícím identifikaci. •Př: vždy oválné spory B. cereus, B. anthracis, Clostridium botulinum, kulaté spory Clostridium tetani či B. sphaericus, cylindrické či elipsoidní spory dalších druhů. •U velikosti spor hodnotíme, • zda a kde vyklenuje buňku. K čemu je dobré barvení spor? Malachitová zeleň Bacillus megaterium Strukturální barvení endospor •Spory se velmi těžko barví i po fixaci • • • •Chceme-li spory obarvit, musíme • použít koncentrovaná barviva za • tepla nebo různá mořidla. •Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (př. alkoholem), čehož se využívá k diferenciaci spor. •Barvitelnost spor záleží na: • - jejich vývojovém stádium • - stáří kultury • - kvalitě živné půdy • - individuálních vlastnostech mikrobů •Barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií (s přídavkem manganu nebo urey). silný, špatně prostupný obal •Uložení v buňce: • •terminální = na konci tyčinky • C. tetani (jakoby paličky), • B. stearotermophilus •centrální (C. histolyticum, C. novyi, • C. septicum, B. anthracis, B. cereus) •subterminální = paracentrálně = • = mezi středem a pólem buňky, nejčastěji • (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis) b C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\b.sphaericu sccm1615.jpg •Rozšíření buňky: C. botulinum, C. tetani, Bacillus stearothermophilus • • • • •mírné rozšíření: C. histolyticum a C. novyi •U některých druhů spora buňku nezduřuje: B. anthracis, B. cereus. • C. perfringens C. tetani B. cereus Clostridium botulinum Clostridium difficile B. anthracis • Klinicky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium • Clostridium botulinum: • sporulující buňky odolávají 2-6 hodin teplotě 100 °C • oproti nesporulujícím, které hynou po 30' při 70 °C! • Spory inaktivovány po 20' při 121 °C vodní páry při •2 atm (0,2Mpa) a po 90´ - 180' při 160 - 200 °C suchého tepla, vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var • •v Clostridium tetani – tetanus. Ke zničení spor nutno • působit 100°C po 90 minut. • •v Bacillus anthracis • – biologická zbraň, anthrax •v • •biopesticidy - Bt toxin transgen – • Bacillus thuringiensis var. israelensis Bacillus anthracis Lidský neutrofil útočící na Bacillus anthracis spory A schematic of a bioaerosol mass spectrometry ... bioaerosol mass spectrometry (BAMS) Proces sporulace •Začíná ve fázi G1 přechodem od binárního k asymetrickému dělení • •probíhá i při dostatku živin, • hlavně však ve stacionární fázi Ke studiu sporulace je používáno bakteríií rodu Bacillus, hlavně B. subtillis •Fáze 0 •Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází v G1 od binárního k • asymetrickému dělení. Během sporulace B. subtillis můžeme rozlišit 7 fází (I –VII), jež lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni. Za proces vzniku endospory zodpovídá 7 – 8 genů. v průběhu vzniku přepážky (na konci G1) je již jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo spora •Fáze I •Tvorba axiálních filament k •rozdělení bakteriálního chromozomu. •Sporogenní zóna – jiná hustota b.mat. • Jeden z prvních signálů sporulace: vznik kvanta volutinu Druhým signálem je zvýšení množství enzymů Krebsova cyklu a hydroláz, spotřeby acetátu •Fáze II •ukončena replikace buněčného genetického materiálu •ten se rozestupuje k pólům buňky •končí invaginace cytoplazmatické membrány • V místě přepážky se dvojitě vchlípí cytoplazmatická membrána •Fáze III •proliferace cytoplazmatické membrány kolem obou vydělených částí buňky, u spory dochází k zaobalení (prospora - barvitelná) • •Intina, extina Není dosud světlolomná Spora ještě nesvítí při mikroskopii ve fázovém kontrastu) •Fáze IV • • Tvoří se kortex spóry s PG o složení líšícím se od peptidoglykanu buněčné stěny •Ve spóře obsažena kyselina dipikolinová (stabilizuje kvarterní strukturu DNA ve vazbách) a velké množství Ca++ iontů – aktivní transport - antiport. • Endospora je již světlolomná – Nomarského a fázový kontrast. Termorezistence –do prospory transportována k. dipikolinovaná •Fáze V •Syntéza pláště. •Vícevrstevný. •Již minimum vody. •U rodu Bacillus: vzniká exosporium složené z deseti proteinů, polysacharidů a lipidů. • Chemotaxonomie – unikátní bílkoviny pláště •Fáze VI •Maturace endospory a lyze mateřské buňky, uvolnění zralých spór • • •Fáze VII •Volná zralá spóra. • Dvojité obalení spory CPL membránou Stavba zralé spory •Jádro – gelová matrix • - bakteriální jaderný ekvivalent nukleoid • - kalcium dipikolinát (CDPA) nebo pyridin-2,6-dikarboxylová kyselina, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury DNA • Endospore.gif •Kortex •1) vnitřní kortex (20% kortexu) či stěnu spóry •2) zevní kortex (80 % kortexu). •Zajišťuje nepropustnost (nebarvitelný!) •Kortex tvořen peptidoglykany (PG). •Jen 20-30 % PG jednotek shodných s •jednotkami v buněčné stěně. •Zbylých 50-60 % N-acetylmuramyl–laktam, •dalších 18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu. •Tyto modifikace zajišťují enzymy: • membránově vázaná Glu-mesoDmp hydroláza a • cytosolová Ac-Ala-Glu-mesoDmp lyáza. • Endospore.gif •Perikortikální membrána •Pláště složené z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost spór k působení chemikálií. • výše zmíněné exosporium u rodu Bacillus • • Jedinečné a charakteristické struktury spory • •Kalcium dipikolinát •Proteiny stabilizující DNA •Kortex •DNA reparační enzymy v procesu germinace • Germinace spory – terminální, centrální •Germinací rozumíme rychlý proces klíčení spory. •Začíná spontánní aktivací spory •Aktivace – destabilizací pláště – působením teploty 70-85 °C po 5 – 10 min, • další aktivátory: malé organické molekuly, L-Ala, Ado a Ino, vyšší obsah bazí • V laboratořích zahřátí v přítomnosti vody. •Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí rezistenci – bílkoviny se začínají rozkládat • • • • vzniklé AMK - stavební kameny nových proteinů • •Lytický enzym: p68 => p29 (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. •Po dvou hodinách po germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky. •Inhibice klíčení: D-Ala, MgCl2, PMSF Klíčení spory B. cereus Exospory = cysty •Nejsou tolik rezistentní vůči teplu •Rezistentní vůči vysychání •Granula PHB – typická pro cysty •Odlišné obaly – algináty, různé polysacharidy •Nejpodrobněji popsány u Azotobacter vinelandii, • - mnohovrstevný obal (vnější části vyšší hustota), unikátní lipidy • •Za příznivých podmínek cysty klíčí • a mění se ve vegetativní buňky • • V podmínkách vhodných pro vznik cysty se vegetativní buňka zakulacuje, odhazuje bičíky Nepohyblivé stadium se encystuje Buňka se stává světlolomnou, z vnější strany depozice lipidických látek Akumulace lipidů i uvnitř buňky • • Rhodospirllum centenum – plovoucí a plazivé buňky a zároveň tvorba cyst Metabolicky neaktivní (Berleman and Bauer 2004) Berleman, J. & C. E. Bauer (2004): Characterization of the cyst cell formation in the purple photosynthetic bacterium Rhodospirillum centenum. Microbiology 150, 383-390 • Berleman, J., B. Hasselbring, & C. E. Bauer 2004. Hypercyst Mutants in Rhodospirillum centenum Identify Regulatory Loci Involved in Cyst Cell Differentiation. J. Bacteriol. 186, 5834-5841