Růstové cykly bakterií Tvorba spory Buněčný cyklus Caulobacter crescentus Růstové cykly bakterií II. Střídání přisedlé a volné (plovoucí) formy života u prokaryot Caulobacter crescentus Sphaerotilus natans Biofilm • Biofilm Vodní prostředí + pevné povrchy http://www.lf3.cuni.cz/ustavy/mikrobiologie/teozak/biofilm/biofil15.gif …společenství buněk usazených v glykokalyx, přichycených k povrchu nebo okolním buňkám, se změněným fenotypem růstu a jinou transkripcí genů přirozené prostředí, průmysl, těla živočichů, bioingeneering, klinický materiál… •Charakterizace mikrobiální fyziologie: • - studovány planktonní buňky nebo buňky biofilmu? – v přírodě existence většiny bakterií ve formě biofilmu, planktonní buňky se vyskytují jen ve fázích přechodu do biofilmu budoucího • •Studie biofilmu: Sbírkové kmeny? Z prostředí? • •Jaké vlastnosti musí mít bakteriální povlak, aby byl za biofilm označen? • - nově proti původní definici: •„struktury a závoje vznikající •i bez přítomnosti pevné podložky…“ • (surface-attached) a planktonní (free-floating) • Biofilm / mikrokolonie: •husté mikrobiální populace vyvinuté z volně plovoucích (planktonických) buněk usazených na vhodném povrchu v matrix z polysacharidů formujících „hřibovité“ útvary s dutinkami, kanálky a stopkami. Je zodpovědný za 65% onemocnění západního světa. http://focosi.altervista.org/pseudomonasbiofilm.jpg Složky biofilmu: Bakteriální buňky a jiné organismy uvnitř hřibovitých shluků propojených kanálky a póry. Biofilm jednoho bakteriálního druhu má jednodušší stavbu než společenství více druhů •Studium – větš. u G- •počalo u polysacharidové glykokalyx •mikroskopie: • - světelný mikroskop: obtížné • - elektronový: nepracuje se živými buňkami • - konfokální: dovoluje prohlížet plochy ve • zvolené hloubce, z řezů pak skládána • struktura; časosběrná metoda: možno získat záznam dění v biofilmu • - řádkovací elektronoptická technika… • •Studium složení – lokalizace? Společenství? • • Biofilm = společenství buněk v čase!! Jak biofilm vzniká.. Volně pohyblivé buňky, hlavně při hladovění, se za pomocí adhezinů (GP nebo PS) přichytávají na povrchy Hned po přilnutí se změní jejich fenotyp a začnou produkovat velké množství PS, formuje se lešení, mikrokolonie a kanálky. Časem se na impuls (z buněk detekujících hustotu populace vychází signál quorum sensing – důsledek konkurence a neúnosnosti velikosti společenství) buňky odlučují a kolonizují povrch. Tloušťka – několik až stovky μm, dle dostupnosti živin a počtu druhů. Koexistence aerobů a anaerobů. V různých vrstvách různý náboj, což pomáhá transportu živin. Jednodruhový – př: aerob P. aeruginosa – mnohem tenčí biofilm než vícedruhový. • Biofilm je elastický, povrch se v proudu kapaliny vlní. V silnějším proudu se posunuje po podložce. Při dostatku živin se povrch biofilmu vyrovnává. Lze měřit hydrodynamiku průtoku v kanálcích; v 1/2 hlouby je průtok 5x pomalejší. Vlastnosti a změny buněk při vzniku biofilmu •Přilnutí: • - spouští se řada genů • - uplatňují se bičíky – při dotyku nárust jejich syntézy • - v hotovém biofilmu mizí • - u G- bakterií fimbrie (=pili) - 1 μm dlouhé; stovky • - některé salmonely a E. coli • – zvl. typ fimbrií z neobvyklé bílkoviny amyloidu: curli • (význam v patogenezi i při studiu patogeneze u Alzheimerovy • choroby – model tvorby amyloidu) • •Zkumavka: stac. kultivace: plovoucí E. coli, bez usazování na skle •Nádoba s přítokem živin: vzniká povlak s odlišnými buňkami – mutací změněna jediná AMK v regulační bílkovině genu pro curli •Vznik biofilmu – přizpůsobení přisedlému způsobu života: •Mechanismy adheze: adhesiny, fimbrie – curli, glykokalyx •Reverzibilní – van der Waalsovy síly – slabé vazby buňka-povrch •Irreverzibilní – chemická vazba (kovalentní, vodíková) • - přítomnost extracelulárních polymerů •Změna fenotypu - ustává syntéza bičíků, mukózní látky •Ps. aeruginosa – alginát •Spouštěcí podněty: •Osmotický tlak •Snížený obsah kyslíku •Rostoucí hustota poulace - quorum sensing – malé mlk. • pro maturaci biofilmu a virulenci • např: acyl-homoserin lakton (G-), malé peptidy (G+) •Po přichycení změna vlastností: • - zprvu na úrovni regulace genů (díky změně vnějších podmínek – • - jiné osmotické poměry, rozdílná distribuce kyslíku, rozdílná hustota populace) • - 1/3 bílkovin se produkuje v rozdílném poměru k bílkovinám planktonických buněk • - více tvořeny bílkoviny 1) pórů, 2) transportní • 3) syntetizující mimobuněčnou hmotu • •Po přichycení nutno • vytvořit matrici • - z polysacharidu • - př: P. aeruginosa • - PS alginát, již 15 minut • po přisednutí http://www.lf3.cuni.cz/ustavy/mikrobiologie/teozak/biofilm/biofil20.gif Změna bílkovinného profilu populace Početná populace…. •Signály • - G+ - peptidy – řídí dělení buněk (= hustotu populace), tvorbu matrice (velmi trvanlivé; na povrchu i po odstranění biofilmu!) • „quorum sensing“ – několik desítek genů tvořících signály • - vznik bílkovin mnoha fcí – regulace, virulence (toxiny, enzymy) •Přenos genů • - až 1000x úspěšněji než u buněk planktonických •Fenotyp buněk • - rytmicky se mění • - po odplavení si zachovají urč. dobu vlatnosti jako v biofilmu (R) •Odplavení • - aktivace genu pro syntézu enzymu štěpícího matrici • •Pseudomonas aeruginosa •formování biofilmu sestává z pěti kroků, během nichž exprese více jak 800 proteinů •(tedy víc jak polovina proteomu tohoto druhu) •je šest i vícenásobně zvýšená. • • Značná část experimentů prováděna s kulturami: .. tento výzkum vysvětluje i patogenezi některých onemocnění • •Reversibilní přilnutí (attachment): buňky se přechodně fixují k substrátu a povrchem indukovaná genová exprese ústí do tvorby proteinového profilu zřetelně odlišného od planktonních buněk • •Ireverzibilní přilnutí: u buněk dochází k reorientaci, shlukování, ztrátě pohyblivosti a aktivaci regulonu quorum sensing • •Maturace I: buněčné shluky jsou silnější a je aktivován rhl quorum sensing system • •Maturace II: buněčné shluky dosahují maximální tloušťky s proteinovým profilem odlišným od planktonních buněk • •Disperze: změna struktury shluků, formování pórů a kanálků. Přítomnost pohyblivých i nepohyblivých buněk. Pseudomonas aeruginosa fáze vzniku biofilmu Nový objev mikrobiologů v USA: nejen pevné povrchy, ale i v bujonu ve zkumavce po delší kultivaci, dříve než buňky klesnou ke dnu… •Síťovina z polymeru - hexagonální stěny kanálků, 150nm tlusté, ukrývají buňky •Kanálky vznikají z plochých struktur, které se tvoří v pravidelných periodických vzdálenostech •Na periferii tvoří buňky kompaktní závoje, které vlají v proudu kapaliny a tlumí střihové síly tekutého prostředí •Funkce síťoviny: lešení, asi i přenos signálu a ukazatel směru posunu buněk •Popsány i struktury vlákének spojujících jednotlivá místa síťky •Zatím nezodpovězené otázky: jakto, že buňky zaujímají seskupení destičky a ne amorfní kapky? •Jak to, že se řadí v pravidelných intervalech? •Co bakterie zastaví po dosažení 150ti nm tloušťky stěny? S. epidermidis, Ps. aeruginosa •Signalizace mezi buňkami podmíněná jejich koncentrací. •Jedná se o integraci signálů z prostředí, kde bakterie žijí. •Tyto signály jsou předávány buněčnými transdukčními •mechanismy. • •Mnoho druhů bakterií používá quorum sensing ke koordinaci své genové exprese v závislosti na místní hustotě populace . • Podobně činí některé sociální druhy hmyzu, kde používají quorum sensing ke kolektivním rozhodnutím, např. kde vybudovat hnízdo. • • Quorum – sensing Quorum – sensing - regulace luminiscence u Vibrio fischeri • Luminiscenční bakterie neemitují světlo, jsou-li v planktonním stavu. Výdej světla je energeticky Náročný. •Quorum sensing u Vibrio fischeri •Výzkum quorum sensing regulovaném AHL začal až pozdních 60 letech. Mořská bioluminescentní bakterie Vibrio fischeri rostla v tekutých kulturách a bylo zjištěno, že kultury produkují světlo pouze když byl nárůst vysoký. Původní vysvětlení spočívalo v předpokladu, že medium obsahuje inhibitor luminiscence, který je odstraněn po dostatečném nárůstu.Tento předpoklad byl učiněn na základě faktu, kdy bylo prokázáno, že růst v mediu je upraven tak ( „conditioned“ to jest ve kterém už jednou byly bakterie kultivovány),že luminescence byla indukovaná již při nízkých densitách buněk. • Později bylo prokázáno, že luminescence byla iniciována nikoli odnětím nějakého inhibitoru ale způsobena akumulací molekuly aktivátoru neboli „autoinducer“.Tato molekula je tvořena bakterií (autoinduktor) a aktivuje luminiscenci po dosažení určité koncentrace. •N-(3-oxohexanoyl)-homoserine laktone (3-oxo-C6-HSL) ••Bakterie jsou schopné vycítit (to sense) svou densitu monitorováním koncentrace autoinduktoru. Tento mechanismus uvědomování si buněčné density byl označen jako quorum sensing (QS). Molekula tvořená Vibrio fischeri byla poprvé izolovaná a charakterizovaná v roce 1981 - a struktura byla •identifikovaná jako N-(3-oxohexanoyl)-homoserine lakton (3- •oxo-C6-HSL). Analýza genů účastných v QS u V. fischeri byla poprvé provedena Engebrecht et al (1983). Tento objev vedl k •navržení základního modelu pro quorum sensing u V. fischeri, •který je nyní vzorem pro ostatní podobné quorum sensing •systémy •N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserin lakton OHHL •• Po mnoho let od objevu AHL- QS regulace panoval názor, že tato regulace je omezená na mořské bakterie jako V. fischeri a V. harveyi. Výzkum syntézy antibiotik prováděný v Nottinghamu a Warwicku vedl k objevu, že QS je daleko více rozšířen, než se původně předpokládalo. •• V roce 1992 bylo prokázáné, že malá molekula OHHL je odpovědná za regulaci syntézy beta–laktamového antibiotika: 1-karbapen-2-em-3-karboxylová kyselina, které je tvořeno půdní bakterií patogenní pro rostliny Erwinia carotovora. •OHHL , produkovaný u V. fisheri účinkem LuxI proteinu – regulační faktor supernatanty kultur: Pseudomonas aeruginosa • Serratia marcescens, Erwinia herbicola, Citrobacter freundii • Enterobacter agglomerans, Proteus mirabilis •Všechny studované kmeny produkovaly podobnou molekulu. •Lux typ regulace není unikátní pro bioluminiscenci V. fisheri (Photobacterium fisheri). Gen LasR, regulující elastasu u P. aeruginosa je homologem k LuxR. Podobně SdiA je aktivátorem transkripce souboru genů řídících buněčný cyklus u E.coli. • Quorum - sensing •Soustava malých organických molekul, které jsou buňkou tvořeny v závislosti na koncentraci jich samotných v prostředí •Buňka tak reaguje na hustotu populace •Kaskáda reakcí po vazbě na receptor spouští syntézu sekundárních metabolitů a komunikaci v rámci • bakt. společenstva •Vnitrodruhová •organizace komunity •http://biomikro.vscht.cz/vyuka/bm/Quorum_sensing.pdf P. aeruginosa: acyl-homoserin lakton (LasI/LasR and RhlI/RhlR) systém •Monitorování hustoty populace •Specifické receptory a syntetázy (Lux I) •Různé LuxI produkují různé formy ASHL •Liší se v R1 a R2 pozicích postranního řetězce •Koncentrace ASHL v buňce dána koncentrací těchto molekul v prostředí •Význam pro ekologii buněk ale i virulenci 3D rekonstrukce dozrávání biofilmu Pseudomonas aeruginosa •!!! Ekonomika buňky: produkce extracelulárních signálů až nad určitou hustotou populace !!! • •Načasování rozmístění faktorů virulence v hostiteli je kritický bod – patogen se může hromadit bez vykazování faktorů virulence • •Více než 4% z téměř 6 000 • genů P. aeruginosa regulováno • pomocí quorum - sensing • • •Žluté diamanty v kruhu: LuxR homology aktivované HSL signálem – jeho difuze do a ven z b. •Šipky: qsc genes. •Substrát pro HSL syntázu je acetylovaný acyl-karyl protein (Acyl-ACP) a S-adenosylmethionine (SAM). •I = acyl-HSL syntetáza (LuxI homolog) •LuxR konformace Acyl-homoserin lakton (AHSL) quorum-sensing cyklus AHSL R1: H, OH, O R2: (CH2)2-14 (CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2) Parsek, Matthew R. and Greenberg, E. Peter (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8789-8793 •Nízká hustota populace produkuje určitou kvantitu ASHL molekul •Různé transkripční faktory gsc genů jednotlivých cyklů jsou aktivovány různými formami ASHL po dosažení jejich určité koncentrace •Kaskáda reakcí pro •spuštění produkce •sekundárních metabolitů: •HCN, pyocyanin •Acyl-homoserin lakton (G- bakterie) = autoinduktor (červený) a metabol.produkt od urč.koncentrace AHSL (zelený) •Quorum response in gram-postitive bacteria. • • •Zvýšení uvolňování •buněk ze zralého •biofilmu Kontrola procesu tvorby biofilmu •Zvláštnosti biofilmu •Přenos genů mezi buňkami až 1 000x větší •Vyšší rezistence k ATB a dezinfekci (H202, chlor) • - omezená difúze • - sorpce ATB • - klidový stav, hladovění • - změna genotypu: •geny mar •– multiple ATB resistance •- efflux systém •- enzymatická degradace •- modifikace cílových mlk •Speciální sigma faktory •Signální mechanismy • •Zubní povlak • – A. van Leewenhoek • - periodontitida •Střevní sliznice •Infekce • – sliznice nebo uvnitř tkáně; • - endokarditida • - trvalý biofilm na chlopních • (hl. strepto- a stafylokoky; • nebezpečí z krvácivých dásní..) •- rány; bércové vředy; spáleniny • • Biofilm v lidském těle výhoda biofilmu – perzistence a R k ATB pH při rozkladu zásobních cukrů poškozuje sklovinu zubu - silně redukující prostředí v kapsách pod dásní – proliferace anaerobů •Chronické infekce •– dýchací cesty • Cystická fibróza – genet. onemocnění (porucha iont. rovnováhy) • Vývoj: běžné infekce (stafylokoky, hemofily, pneumokoky) • později na poškozené tkáni P. aeruginosa; v alginátu odolné. • CHOPN •- ušní infekce •- močové cesty •- chronický zánět prostaty • • - Imunokomprimovaní – kolonizace alveol, až kalcifikace.. Biofilm nespouští imunitní odpověď. Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů Oral multispecies biofilm development and the key role of cell–cell distance Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) •1970, Gibbons and Nygaard • - ve smíšené kultuře Actinomyces naeslundii a Streptococcus sanquinis z dentálního povlaku – snížení turbidity v bujonu (minuty) = „koagregace“ • •Proces vzniku biofilmu: • 1) přilnutí vrstvičky proteinů • na zubní sklovinu – ze slin • 2) první kolonizátoři • – streptokoky ústní dutiny • 3) aktinomycety, Fusobacterium • 4) pozdní kolonizátoři na fusobakteria •Proces kolonizace – souslednost • - podle ústní hygieny • - a dostupnosti vhodných „partnerů“ • pro agregaci mikrokolonií • a jejich následné párování. •Často pouhá přítomnost kmene nestačí, je potřeba •přítomnosti vhodných partnerů koagregace v dostatečném množství. • • • • • • • http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Media/Images/LabExercises/Applications/Denta lBiofilms.jpg Rickert et al. 2003 •bind to complementary salivary receptors (sialylated mucins, proline-rich protein, α-amylase, salivary agglutinin and bacterial cell fragments) in the acquired pellicle coating the tooth surface. Late colonizers bind to previously bound bacteria. Sequential binding results in the appearance of nascent surfaces that bridge with the next coaggregating partner cell. Coaggregation is different from aggregation that occurs between genetically identical cells and from agglutination of cells through interaction of cells with soluble molecules, for example, antibodies. Most coaggregations are between cells of different genera; Fusobacterium nucleatum strains, for example, coaggregate intergenerically with representatives of all oral bacterial species. However, intrageneric coaggregation among fusobacterial strains is only rarely observed. In sharp contrast, streptococci exhibit broad intrageneric coaggregation partnerships (for example, S. gordonii and S. oralis) as well as intraspecies partnerships (for example, S. gordonii DL1 and S. gordonii 38). Each bacterial strain exhibits specificity in partners. For example, some streptococci are capable of coaggregating with certain Veillonella spp., whereas other streptococci cannot coaggregate with those veillonellae but do coaggregate with a separate group of veillonellae24. Figure modified, with permission, from Ref. 106 © American Society for Microbiology (2002). Figure 2. Interactions between coaggregating pairs of organisms. http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Media/Images/LabExercises/Applications/Coagg regatingPairs.jpg Mezibuněčné interakce biofilmu zubní skloviny • 1 buňka - adheziny lektinového typu • 2 buňka - oligosacharidové skupiny • Koagregace přerušena: - denaturací lektinu - navázání cukru (laktózy) blokující lektin kompetitivní inhibicí •Morfologické struktury orálního biofilmu • •“corncobs” – koky koagregující s vláknitými bakteriemi • •“rosette” - 1 buňka koagregující s koky • • •“test tube brush formations” http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Media/Images/LabExercises/Applications/Cornc obFormations.jpg corncobs •Tvorba a spojování koagregátů •Dělení v mikrokolonii koagregátu Růst dentálního biofilmu http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Media/Images/LabExercises/Applications/Biofi lmMassIncrease.jpg http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Media/Images/LabExercises/Applications/Coagg regationAssay.jpg •Výsledek: •Tvorba a spojování koagregátů uvnitř 1 rodu a mezi různými rody •Dělení v mikrokolonii koagregátu • •Pomnožené kultury, promyté v a kultivované v koagregačním pufru: 1 mM Tris [pH 8,0] 0,1 mM CaCl2 0,1 mM MgCl2 150 mM NaCl 0,02% NaN3 •Cévky – arteriální, žilní •Močové katetry •Dýchací a dializační přístroje •Umělé chlopně •Kontaktní čočky •Děložní tělísko • • • • •Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů • • Biofilm a medicína Stafylokoky – fibronektin-binding protein.. pseudomonády, E. coli, streptokoky, aktinomycety… Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… •Lékařská mikrobiologie: • Pg bakterie biofilmu nelze testovat na rezistenci k antibiotikům – vykultivované bakterie jsou již planktonické = s jinými vlastnostmi! Bakterie biofilmu až 1000x rezistentnější k ATB než planktonické buňky. Experiment: Byl vytvořen umělý biofilm - Některá ATB vyvázána polysacharidem - vylučování ATB pumpou nebylo zesíleno - buňky možná v klidovém stavu a ATB působí jen na buňky rostoucí - rezistence je jednou z fenotypových změn, vzniká po aktivaci regulačních genů určité části buněk Např. u P. aeruginosa nalezen cyklický glukan (polymer glukózy) vyvazující ATB i in vitro, vně i uvnitř buňky. Rezistence souvisí s množstvím změn při přechodu do společenství biofilmu. Možné vysvětlení: snaha pseudomonád bránit se ATB streptomycet v prostředí právě tvorbou biofilmu. •Terapie biofilmů • Studium mutací genů gsc = studium narušení formování biofilmu – poté přístupnější ATB a dezinfekci Návrhy: aplikace ATB v intervalech; současné působení ultrazvuku a ATB, kombinace ATB a el. pole.. Přisedlé bakterie • • • •Každé buněčné dělení •je asymetrické – vznikají •dvě morfologicky odlišné buňky • •Životní cyklus závisí na jednotlivých krocích buněčné diferenciace a asymetrického dělení • 3 700 genů Plovoucí bičíkatá buňka se nereplikuje Během proměny dochází k odhození a nahrazení bičíku a pilusů polární stélkou, která přichytí buňku k podkladu Nezralá stélkatá buňka se prodlužuje Každá morfologická změna je kontrolována dokončením specifických kroků buněčného cyklu – uzlové body. Pro replikaci buňky nutné přisednutí na místo s vhodným substrátem a diferenciace ve stélkatou buňku. Poté iniciace replikace DNA. Reproduktivní stélkatá buňka replikuje DNA, vznik dceřinné buňky, syntéza nového bičíku na pólu proti stélce. • • •Chemotaxe hraje roli u adherovaných buněk •Caulobacter – volné plovoucí buňky – není syntéza DNA, ani dělení, ale exprese MCP – podobných receptorů – silná chemotaxe. Pohyb za signály, dokud nenarazí na povrch bohatý na substrát – osídlení a iniciace buněčného dělení. •Několik esenciálních transdukčních proteinů mění v průběhu cyklu buněk Caulobacter svou vnitrobuněčnou lokaci Asymetrické umístění regulátorů cyklu – = regulační systém přenosu sinálů • Strukturální analogy aktinu (MreB) - předurčení tvaru buněk C. crescentus, Escherichia coli, Bacillus subtilis - • Protein buněčného dělení: FtsZ, je protipólem tubulinu (bakterie tedy vlastní struktury vláknitého cytoskeletu) • Crescentin – podobný intermediáním filamentům – helixy a zakřivení Caulobacter – asymetrické samouspořádávání molekuly – tvar b. • • • Sphaerotilus natans G- tyčky, medium 12 •Tekoucí vody •Papírenské vody •Kaly •Aktivované kaly • – problém sedimentace • Degradace pochev – Bacillus - enzym • Sphaerotilus natans •V prostředí s nízkou koncentrací kyslíku •Dokáže utilizovat široké zdroje org.látek: polysacharidy, polyalkoholy, org.kyseliny • • Sphaerotilus natans •Micromonosporaceae, Actinoplanes sp. • Sporangium: 10 um • Zoospory v řetízcích nebo ve dvojicích • Uvolněné z mycelia dlouho přežívají •Pilimelia columellifera •(by G. Vobis) Příbuzný rod s Actinoplanes Sporangia s typickými řetízky spor • sporangia • •Zdroje: •Schindler J. (2008): Ze života bakterií, ACADEMIA, Praha •www.yale.edu/jacobswagner/research.htm • •http://www.sciencedaily.com/releases/2006/04/060411222211.htm • •biology.kenyon.edu/.../Chap11/Chapter_11A.html • •http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/16/8789 • • • •http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Contents/02_Lab_Exercises/03_Applications/0 1_Instructor_Version/06_Bacteria_in_Dental_Biofilms.html •http://www.sanedentist.com/ • Návody pro cvičení •Biofilm: •http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Contents/02_Lab_Exercises/03_Applications/0 1_Instructor_Version/06_Bacteria_in_Dental_Biofilms.html • •http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Contents/02_Lab_Exercises/02_Protocols_and_ Methods/01_Instructor_Version/01_Buried_Slide_Technique.html •http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v005/r001/Contents/02_Lab_Exercises/00_Lab_Overview/0 1_Lab_Exercises_Overview.html •Děkuji za pozornost