Proteinové, buněčné a tkáňové čipy Jitka Malčíková 26.11.2013 Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Molekulární medicína, CEITEC MU Logo CMBGT_verze 5 final zakladni_CZ FN Brno_modra_obdelnik Genom (20-25 tis genů) Transkriptom Proteom (miliony proteinů) Dynamický systém – odráží momentální stav buňky Hladina proteinu často nekoreluje s hladinou mRNA iceberg Transkripce Posttranskripční modifikace Alternativní sestřih Translace Odbouráváni mRNA Posttranslační modifikace Alternativní konformace Proteomika Proteom - soubor všech proteinů v daném biologickém systému (buňka, tkáň, organizmus) Klinická proteomika - studuje celkový buněčný proteom v klinických vzorcích §Cíl - identifikovat a charakterizovat proteiny zapojené do vzniku a vývoje onemocnění Proteomické metody §Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) úČasově, finančně náročné úTěžko reprodukovatelné úDvoubarevné značení – DIGE §2D Kapilární elektroforéza §Hmotnostní spektrometrie §Proteinové čipy úVysokokapacitní úPoměrně jednoduché zpracování úExpresní i funkční studie úVyžadováno minimální množství vzorku dige Proteinové čipy § § §Expresní ústanovení přítomnosti a koncentrace proteinů v komplexních vzorcích §Protilátkové čipy §Lyzátové čipy §Antigen čipy § §Funkční ústudium interakce proteinů s jinými molekulami §proteiny, peptidy, nízkomolekulární látky, oligosacharidy, DNA ú Princip proteinových čipů §Vazba protilátka-antigen - mikrospot ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) úSystém využívající malé množství vázané protilátky a malého objemu vzorku je citlivější než systém se stonásobně větším objemem materiálu ú úCitlivost řádově ve femtomolech - 106 molekul/ml §Množství navázané molekuly je sice velmi nízké, ale v rámci mikrospotu lze dosáhnout vysoké hustoty ú úStanovení koncentrace analytu ve vzorku §Koncentraci přímo odpovídá množství vázaného analytu (Ekins RP, J Pharm Biomed Anal. 1989) abarray Princip proteinových čipů §Stovky – tisíce proteinů imobilizovaných ve formě mikrospotů na pevném povrchu ú membrány (polystyrenové, PVDF - polyvinyliden fluorid, nitrocelulosové) ú standardní mikroskopická sklíčka §s chemicky modifikovaným povrchem (poly-lysin, aldehydické skupiny) §potažená membránou §Detekční metody úNejčastěji fluorescence úEnzymaticky – značení alkalickou fosfatázou, křenovou peroxidázou úChemiluminiscence úRadioaktivita úZvýšení signálu – značení biotinem – vazba na značený streptavidin úHmotnostní spektrometrie Možnost dvoubarevné detekce Vyšší citlivost a specifita Čipy pro stanovení antigenů Xiaobo et al. 2010 Xiaobo et al. 2010 Sendvičová metoda Přímé značení Protilátkové čipy §Přímý formát (FPA- forward phase arrays) §Na povrchu spotované protilátky (velikost spotu 0,3-0,5 mm) §Inkubace se vzorkem § § § § § § § § § § §Detekce stovek antigenů ve vzorku §Expresní profilování – „large-scale“ monitorování proteinové exprese §Cílené na určité buněčné procesy (buněčný cyklus, cytokiny, MAPK dráha, p53 dráha…) Lyzátové čipy §Zpětný formát (RPA – reverse phase arrays) §Na povrchu spotované vzorky (proteinové, tkáňové lyzáty, sérum) §Inkubace se specifickými značenými protilátkami § § § § § § § § § §Srovnání exprese až desítek antigenů u stovek různých vzorků §Nevýhoda – malá hustota studovaných molekul ve spotu – pre-frakcionace pomocí 2D kapalinové chromatografie Čipy pro stanovení protilátek § § Antigen čipy §Na povrchu spotované známé antigeny úsyntetické proteiny, peptidy §Inkubace se sérem obsahujícím studované protilátky §Detekce přítomnosti protilátek ve vzorku, nejčastěji v séru Xiaobo et al. 2010 Bead array - mikrosféry § § §průměr ~ 5-10 μm (velikost lymfocytu) § polystyrenové nebo latexové kuličky §„kódovány“ rozdílnými barvami nebo velikostmi § Detekce – na principu flow cytometrie úrozpoznávání rozdílně kódovaných mikrosfér úidentifikace a kvantifikace proteinů ve vzorku §Množství stanovovaných proteinů je limitováno počtem druhů mikrosfér (~500) §Možnost automatizace §Využití – cílené – zejména detekce cytokinů, protilátek (alergie, autoimunita), ale např. i detekce fúzních proteinů a onkoproteinů ú www.lucerna.chem.ch Buněčné čipy § § §Přímý formát úSpotované protilátky úInkubace s buněčnou suspenzí úNapř. spotované CD molekuly – inkubace s leukocyty – charakterizace leukemických buněk § §„Transfekční čipy“ - buňky rostou na povrchu čipu s naspotovanou cDNA úBěhem růstu přijmou cDNA úČip se spoty buněk exprimujících různé cizorodé proteiny Buněčné čipy § § § §Detekce úPřímo mikroskopicky na sklíčku úDalší charakterizace značenými protilátkami Tkáňové čipy §Varianta RPA čipů (zpětný formát) §Spotují se celé vzorky tkání např. bioptických §Inkubace se značenými protilátkami §Velikost spotu 0,6 - 2mm nrd1254-f2 SELDI § § §Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation §Inkubace lyzátů na makrospotech adsorpčního povrchu s různou povrchovou úpravou §Nespecifická vazba proteinů §Detekce hmotnostní spektrometrií §Nižší citlivost §Umožňuje vyhledávání neznámých biomarkerů Funkční čipy § § §Studium interakce s jinými molekulami úInkubace s jinými proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) §Studium posttranslačních modifikací §Studium enzymatické aktivity §Studium kofaktorů a inhibitorů §Studium interakcí ligand-receptor Spotovány nativní proteiny §Potřeba zachování struktury a biologické aktivity úProblém imobilizace, zachování konformace a orientace na čipu i během skladování ú1. funkční čipy – mikrojamičky v silikonovém elastomeru na povrchu mikroskopického sklíčka (Zhu et al., Nat Genet 2000) § §Nespecifická vazba přímo na povrch úAdsorpce úKovalentní vazba přirozených chemických skupin proteinu na upravený povrch úAktivní část proteinu může být schovaná, problém zachování konformace § §Chemoselektivní vazba – připojení chemické skupiny na definovanou pozici proteinu → specifická reakce s komplementární chemickou skupinou na povrchu sklíčka úOrientovaná pozice na sklíčku ú §Imobilizace přes specifický rekombinantní tag Imobilizace přes rekombinantní tag §Během syntézy studovaného proteinu se na C nebo N konec přidá afinitní tag, který specificky interaguje s povrchem čipu §Zachování orientace, konformace §Funguje jako „spacer“ – oddálení proteinu od povrchu - odkrytí reaktivních míst a umožnění interakcí úPoly(aminokyseliny) – poly(His), poly(Cys), poly(Lys) úGlutathion-S transferáza (GSH) úMBP (maltózu vázající protein) úBiotinylovaný tag ú… protein attachment biotinylation 50Å Využití interakce biotin - streptavidin cDNA BCCP rec rec promoter §Rekombinantní proteiny exprimované v E.Coli §Proteiny jsou vázané na sklíčko přes afinitní „tag“ úBiotinylated Carboxyl Carrier Protein (BCCP tag) úBCCP tag je správně složen pouze pokud je protein správně složen úPouze správně složený BCCP tag je biotinylován úPouze biotinylovaný protein se váže na streptavidinem pokryté sklíčko Boutell et al., Proteomics. 2004 Využití interakce biotin - streptavidin § § streptavidinem pokryté mikroskopické sklíčko biotinylovaný BCCP tag správně složený protein Analýza DNA-vazebných schopností p53 mutantů chip barevny s vyznacenyma kodonama §P53 array – 50 variant p53 úwt ú48 mutací – 43 missense, 5 nonsense úpolymorphismus R72P §Studium efektu mutací a polymorfismů úna interakci s jinými proteiny úna konformaci – konformačně-specifická protilátka úna vazbu k DNA - vazba proteinů navázaných na čipu k fluorescenčně značeným oligonukleotidům obsahujícím responzivní elementy p53 cílových genů ú In situ syntetizované čipy §„Samoskládací“ (Self-assembling) §cDNA naspotovaná na sklíčku → in vitro translace → in situ imobilizace N Ramachandran et al. Science 2004 Další typy funkčních čipů § § §Doménové čipy úSpotovány pouze jednotlivé domény proteinu úPochopení protein-proteinových interakcí § §Peptidové čipy úInkubace s proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) § §Čipy s chemickými knihovnami úInkubace s proteiny (enzymy, receptory…) úStudium inhibitorů, studium ligand-receptorových interakcí- vyhledávání terapeutik Typ čipu Molekuly imobilizované na čipu Stanovované molekuly Inkubace Počet spotů Použití expresní protilátkové (přímý formát) známé protilátky antigeny neznámý vzorek - proteinový lyzát > 1000 proteinové profilování lyzátové (zpětný formát) neznámý vzorek - proteinový lyzát antigeny známé protilátky >1000 proteinové profilování antigen čipy známé antigeny protilátky neznámý vzorek – protilátky v séru >1000 stanovení přítomnosti protilátek v séru funkční protein-protein známé proteiny v nativním, funkčním stavu nebo peptidy, nebo chemické látky partnerské molekuly interagující s proteiny nebo proteiny >100 studium interakcí proteinů s partnerskými molekulami protein-DNA, RNA protein-nízkomolekulární látky Enzym- substrát Využití §Studium biomarkerů – diagnostické, prognostické, prediktivní §Identifikace terapeutických cílů §Studium vlivu terapie §Detekce autoprotilátek, studium imunitní odpovědi § §In vitro diagnostika – více než u ostatních typů čipů úNejčastěji diagnostika autoimunitních onemocnění úDiagnostika infekčních onemocnění