Technologické aspekty čipových technologií
Boris Tichý
18.9.2012
LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie

Čipové technologie
Princip – sondy vázané na nosný podklad
§DNA
§Proteinové (proteiny, protilátky)
§Buněčné
§Tkáňové
§Chemické látky (malé chemické látky, karbohydráty – glycoarrays)

DNA microarrays
Různé dělení podle…
nTypu sond
nVelikosti a hustoty
nTechnologie výroby
nZnačení
nAplikace
nAtd.

Nosný podklad
§Sklo
§mikroskopické sklíčko (25 x 75 mm)
§speciální formáty
§různé úpravy povrchu – aminosilan, epoxy atd.
§Nylonová nebo nitrocelulózová membrána
§Plast, gel
§Mikrokuličky
§BeadArrays® (Illumina)
§xMAP (Luminex)

Technologie přípravy
§in-situ syntéza sond
§fotolitografie
§masky (Affymetrix)
§mikrozrcátka (Roche/NimbleGen, febit)
§„ink-jet“ (Agilent)
§elektrochemie (Combimatrix )
§deponování sond
§kontaktní - jehly
§bezkontaktní
§mikrokuličky

Fotolitografie



“Ink-jet” syntéza



Spotování (tisk)



Typy DNA sond
§BAC (bacterial artificial chromosome), PAC (P1-derived AC)
§cDNA
§oligonukleotidy
§krátké (~ 25 mery)
§dlouhé (~ 60 mery)
§LNA („locked nucleic acid“)

Značení vzorků
nfluorescence
njednokanálové
nvícekanálové
nautoradiografie
nchemiluminiscence
nkolorimetrie

Aplikace
nExprese
nmRNA
nmicroRNA
nGenotypizace
nSNP array
nAPEX
nResequencing array

Aplikace
nGenomové aberace
nArrayCGH
nTiling arrays
nEpigenetika
nTiling arrays
nArrayCGH
nSNP array

Zpracování vzorků - izolace
RNA
fenol-chloroform – Trizol
kolonka
poly-A
microRNA
DNA
FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)

Zpracování vzorků - QC
RNA
elektroforéza
BioAnalyzer
RT-PCR – 3‘ a 5‘ fragment
DNA
elektroforéza

Zpracování vzorků - amplifikace
RNA
in-vitro transkripce („Eberwine“)
jedno i vícekolová
T7 (T3, SP6) RNA polymeráza
oligo-dT primer s promotorem RNA polymerázy
dvouvláknová cDNA !
další metody
PCR-based (template switching PCR, random PCR, 3' tailing with 5' adaptor ligation PCR)
Ribo-SPIA
DNA
whole genome amplification (WGA)
PCR-based
isotermální

Amplifikace signálu
dendrimery
streptavidin + anti-streptavidin Ab značené biotinem + fluorescenčně značený streptavidin

Značení vzorků
§inkorporace značených nukleotidů (vč. systému streptavidin-biotin)
§inkorporace modifikovaných (aminoallyl) nukleotidů + vazba barvy
§ne-enzymatická reakce vazby na nemodifikované vzorky
§dendrimery
§ligace značených oligonukleotidů, prodlužování řetězce značenými nukleotidy

Hybridizace a odmývání
fragmentace vzorků
enzymatická
ne-enzymatická
hybridizace
teplota
čas
objem
složení pufru
odmývání
teplota
čas
složení pufrů

Hybridizace a odmývání



Skenování
alfaimager, chemiluminiscenční skenery
fluorescenční
rychlost
rozlišení
počet kanálů
typ detektoru
autofokus, extended depth (16bit -> 20bit)

Illumina BeadArray
nSondy vázané na mikrokuličkách
nSučástí každé sondy je tzv. barcode
nSměs kuliček s různými sondami je nanesena na sklíčko s jamkami
nDekódování pomocí hybridizace s barcody
nKaždý čip unikát

xMAP
Sondy vázané na kuličkách
Kuličky kódovány pomocí dvou fluoroforů (až 500 kombinací)
Detekce průtokovou cytometrií (kulička – červený laser, analyt – zelený laser)