RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. Nanoparticles for Targetted Drug Delivery Systems and Construction of Vaccines Výzkumný ústav veterinárního lékařství „V neustálém cyklu proměn malé se stává velkým a velké nepatrným“ Lao‘c Microparticles versus nanoparticles The ISO definition of nanoobjects. Included as nanoobjects are nanoparticles (nanoscale in all three dimensions), nanofibers (nanoscale in two dimensions), and nanoplates or nanolayers (nanoscale only in one dimension). * Nanoscale: a size of between 1 and 100 nm. Nanoobjects * Chemical composition, purity, impurities * Particle size and size distribution * Specific surface * Morphology (crystalline/amorphous, shape) * Surface chemistry, coating, functionalization * Degree of agglomeration/aggregation and particle size distribution under experimental conditions (for example, media with/without proteins) * Water solubility (differentiation between soluble, metastable, and biopersistent nanomaterials) * Surface reactivity and/or surface load (zeta potential). Main characteristics of Nanoparticles NANOPARTICLE CLASSIFICATION 1. Dimensionality Moderní farmakologie je založena na dogmatu interakce molekul léčiva s biologickými molekulárními strukturami organismu. Tato interakce vyvolává následné děje, které vedou k žádoucímu terapeutickému efektu. Je zřejmé, že dochází také k dějům, které vedou k nežádoucím účinkům a toxickým projevům léčiva. Tyto účinky jsou souhrnně označovány jako vedlejší účinky léčiva. Pro porovnání terapeutických a vedlejších účinků léčiva se používá termínů jako maximální tolerovatelná dávka (MTD) a terapeutický index léčiva. Výše uvedené dogma lze vyjádřit dvěma rovnicemi, které popisují interakci léčiva a struktury na kterou působí. Kter = [L]. [Ster]/ [SL] Ktox = [L]. [Stox]/ [SL] L – molekula léčiva S – molekulární struktura, na kterou léčivo působí s terapeutickým výsledkem (ter) nebo toxickým výsledkem (tox) K – rovnovážná konstanta tvorby komplexu léčiva L a molekulární struktury S. Selektivita interakce makromolekul jako základ moderní molekulární farmakologie 1. Klasická terapeutika – interakce ligand - protein (enzym – inhibitor) konstanta stability komplexu K = 10-5 - 10-6 – 10-8 M Blokování funkce proteinu 2. Imunoterapeutika – interakce protilátka – ligand (imunotoxiny, cílené nanočástice) konstanta stability komplexu K = 10-7 - 10-9 – 10-11 M Blokování funkce receptoru nebo ligandu, destrukce antigenu buněčnými nebo molekulárními mechanismy, cílení farmak – zvýšení účinnosti klasických farmak 3. Oligonukleotidové sekvence – siRNA, antisense oligonukleotidy extremně vysoká konstanta stability komplexu K = 10-11 - 10-12 – 10-15 M Blokování transkripce nebo translace, extremní selektivita pro vyřazení genového produktu 4. Vnesení nového genu – forma plasmidového vektoru – využití pro zvýšení selektivity postupů 1-3. Inhibice genových produktů na různé úrovni Nanoparticle based drug delivery systems Liposomy Multifunctional nanoparticle Application of nanoparticles in medicine Morfologická klasifikace liposomů Morphology of liposomes Viewed by cryoelectron microscopy Typy liposomů podle jejich funkce • Konvenčí liposomy nespecifické interakce s prostředím, nestabilita v séru • Stéricky chráněné liposomy dlouhodobá cirkulace • Cílené liposomy specifické interakce přes navázaný ligand • Kationické liposomy schopnost interakce s negativně nabitou DNA Syntetický virus • plně syntetická částice • DNA kondenzovaná pomocí kationických liposomů nebo polyaniontů • na povrchu molekuly pro selektivní cílení nebo fúze • produkce v bezbuněčném systému • funkčně připomíná živou atenuovanou virovou vakcínu, nízká bezpečnostní rizika Příprava liposomů • Primární procesní metody – produkce liposomů • Hydratace lipidního filmu • Metoda Proliposom-liposom • Lyofilizace z terc-butanolu • Odstranění detergentu • Sekundární procesní metody – změna morfologie a distribuce velikosti • Vysokotlaká homogenizace • Mikrofluidizace • Extruse přes polykarbonátové filtry • Sonication • Finální adjustace liposomálního preparátu – stabilizace skladovací formy • Sterilní filtrace • Lyofilizace Distribuce velikosti liposomů • DLS (Dynamic Light Scaterring) • SLS (Static Light Scaterring) • Průtoková cytometrie (Flow Cytometry) • Elektronová mikroskopie • GPC (Gel Permeation Chromatography) • AFM (Atomic force microscopy) • MLSA (Multi-angle Laser Stattering Analysis) Hydratace lipidního filmu evaporate Morphology Size distribution Dialýza detergentu –FB stabilizovaný detergentem Proliposom-liposom membránové fragmenty hustě stěsnané a stabilizované na hranách etanolem ve vodném prostředí FB fragmet lipidní dvojvrstvy Koncept fragmentu dvojvrstvy navržený D.Lasicem Příprava lipidního filmu Princip metody odstranění detergentu 1 10 100 0 10 20 30 Micely Liposomy 5 50 200 Size (nm) Volume(%) Zařízení pro metodu odstranění detergentu pomocí dialýzy J. Turanek et al. Analytical Biochemistry. 2011 Příprava monodispersních liposomů pomocí odstranění detergentu ultrafiltrací Míchaná průtoková ultrafiltrační cela 100:80:200100:80:100 Freeze fracture PROLIPOSOME- LIPOSOME Method Perrett S. et al. J. Pharm. Pharmacol. 1991; 43: 154-161. J. Turánek et.al. Preparation of Sterile Liposomes by Proliposome-Liposome Method. Methods in Enzymology 2003, 367, 110-125 Metoda Proliposom-liposom Mikrofluidizace a vysokotlaká homogenizace Mikrofluidizér M-110L (Microfluidics) HP Homogenizátor B30 (Avestin) Příprava SUV pomocí ultrazvukové homogenizace Lipex – zařízení pro extruzi poháněné stlačeným dusíkem Ruční extrudér LiposoFast Příprava liposomů vysokotlakou extruzí J. TURANEK. Fast-Protein Liquid-Chromatography System as a Tool for Liposome Preparation by the Extrusion Procedure ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 218 (2): 352-357 1994 Vysokotlaká cela Extruze liposomů 400 nm 200 nm 100 nm 80 nm 50 nm SEM polykarbonátového filtuKryoelektronová mikroskopie Zetasizer Nano ZS, Malvern NanoSight 500 Fiel Flow Fractionation Nanocarriers and body compartments Tight junction Normal vs tumour blood vessels SEM images of the luminal surface of blood vessels in normal breast tissue and in mammary carcinomas. Normal EC – rather uniform in size, all in contacts with each other; tumour ECs – deformed, separated from each other, and overlapping each other, multiple cellular projections apparent as well Confocal microscopic images of pericytes on normal venule and a venule on tumour surface Pericytes visualised by immunostaining for asmooth-muscle-actin (red), ECs by staining for the EC marker, CD31 (green). Normal pericytes well organised, adhering closely to endothelium, those on ‘tumour’ vessel disorganised, loosely adhering to the blood vessel. Liver and kidney fenestrations Principle of EPR Effect Penetration of liposomes through epithelial fenestrations - Passive targeting of liposomes Stealth liposomes Doxorubicin Penetration of Stealth liposomes into normal and tumour tissues Application of in vivo fluorescence microscopy Tumour tissue Normal tissue Tumour tissue 400nm 80nm 80nm 80nm • In-vivo imaging In-vivo imaging • s.c. aplikace liposomální suspenze (100ul; 5mg lipidů/ml; 0,4mol % Lyssamin-Rhodamin B) fluorofor: Lyssamin-Rhodamin B Visualizace liposom-DNA depotu fluorescenčním celotělním zobrazením Day 1 Day 28 Kumulace isotopicky značených liposomů s doxorubicine v nádorové tkáni myši Quantify heterogenity of molecules within tumors U-SPECT+/CT JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 99, NO. 5, MAY 2010 Liposomes With High Encapsulation Capacity for Paclitaxel: Preparation, Characterisation and In Vivo Anticancer Effect Paclitaxel • This drug is approved for ovarian and breast cancer treatment and is one of the most exciting anticancer molecules currently available. Suitable drug formulation remains still a problem, because paclitaxel has a low therapeutical index owing to its high lipophilic character and low solubility in water. • The commercially available injection preparation is a sterile solution of the drug in Cremophor EL. Present-day, cancer chemotherapy with paclitaxel frequently causes hypersensitivity reactions in spite of suitable premedication (corticosteroids, anti-histamines). The major hurdles for successful therapy with paclitaxel are the availability of the drug and its delivery. Drug delivery formulations of paclitaxel • Liposomes, niosomes and micels • Water-soluble prodrugs (increased solubility, problems with stability and activity) • Lipophilic prodrugs (enhanced incorporation into lipid-based emulsion) • Enzyme-activitable prodrugs conjugated with antibodies or albumin • Parenteral emulsions • Microspheres • Inclusion complexes with cyclodextrins • Nanocrystals. Liposomal Paclitaxel Increase in MTD, lower toxicity and higher efficiency was found for these preparations when compared with Cremophor based formulation of paclitaxel. Maximum entrapment capacity for paclitaxel in these liposomal formulations was around 3 molar %. Toxicity of PTX-liposomes Liposomal PTX was applied to mice within 15 s by i.v. route via tail vein. The size of liposomes was about 200 nm. The dose of 200 l contained 0.41; 0.82 a 1.64 mg PTX/mouse (20.5, 41 and 82 mg PTX /kg), respectively. No symptoms of toxicity were seen based on the Berlin test. The highest dose of PTX used for the treatment of mice is about 100 mg/kg (usually 10-25 mg/kg). Maximal cumulative doses of PTX used for experimental testing on mice models are 120 mg/kg (3-5 doses with an interval of 48 h, 30 mg/kg per single dose). In view of this fact, the side effects of our liposomal PTX are negligible in comparison to Taxol (Paclitaxel solubilised in Cremophor, Bristol-Myers Squibb Co), whose toxic dose is about 20-25 mg/kg (Cabanes A., et al. Comparative in vivo studies with paclitaxel and liposome-encapsulated paclitaxel. INTERNATIONAL JOURNAL of ONCOLOGY. 1998, 12, 1035-1040). Expanses of lung metastases of B16F10 melanoma cells in mice treated with PTX-liposomes 100 Cumulative dose of PTX mg / kg 50 25 Control Cumulative dose of PTX mg/kg Group V Group IV Group I Group II Group III 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Experimental Groups Numberofmetastaticfoci B * ** JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 99, NO. 5, MAY 2010 Lyophilised Liposome-Based Formulations of a-Tocopheryl Succinate: Preparation and Physico-Chemical Characterisation Štěpán KOUDELKA, Josef MAŠEK, Jiří NEUZIL, Jaroslav TURÁNEK New anticancer drugs based on derivatives of vitamine E O OH C H 3 C H 3 CH 3 C H 3 C H 3 C H 3C H 3 C H 3 a-TOH O O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 O -O O a-TOS a-TAM O N C H 3 C H 3 CH 3 C H 3 C H 3 C H 3C H 3 C H 3 O H O O a-TOM O O C H 3 C H 3 CH 3 C H 3 C H 3 C H 3C H 3 C H 3 O H O O In vitro activity Mechanism of action at cellular and subcellular levels O O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 O -O O Ester bond in aTOS is cleavable by nonspecific esterases (decreased activity of this enzyme was found in 85% of cancer cells) aTAM represents those derivatives which are resistant to degradation by nonspecific esterases Higher cytotoxicity but also serious side effects (lethal neurotoxicity) O N C H 3 C H 3 CH 3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 3 O H O O In vitro cytotoxcity – melanoma B16F10 Control Log (C) M) Absorbance(A540) 0 0.3 0.6 0.3 -1 0 1 2 3 0 0.6 a-TOS a-TAM a-TOM a-TOH a-TOS a-TAM a-TOM a-TOH A B C a-TAM 5 M, 8 h a-TAM 8 M, 8 h Liposomes 10% aTOS, extrusion through filters 200nm Liposomes 20% aTOS, extrusion through 600nm Stability of Lyophilised Liposomal Preparation of aTOS Saccharose:Lipid Molar Ratio 5:1 Hollow fibers implants with tumour cells Hollow Fibres Cross section of hollow fibre Cells growing inside the hollow fibre Postoperative Cure The effect of liposomal TAM and liposomal TAM-PTX on survival of B16F10 melanoma cells in hollow fibres implanted to C57/Black mice (female, age of 8-9 months) C1 C2 TAM1 TAM2 TAM-PTX1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Control 1 Control 2 Liposomal TAM1 Liposomal TAM2 Liposomal TAM-PTX1 Group A540 Liposomal VE analogs suppress breast carcinomas in Transgenic FVB/N c-neu mice with spontaneous breast carcinomas Relativetumorsize 1 3 5 A 0 5 10 15 Days of treatment BControl a-TOS Control a-TAM 0 5 10 15 * * * * * * * * control 1d control 13d Treated α TAM 13d Kationické liposomy • elektrostaticky interagují s negativně nabitou DNA za tvorby komplexů (lipoplexy) • interakce komplexů s povrchovými proteoglykany buňky • vstup do buněk pomocí endocytózy nebo fagocytózy • po injekci mohou být přijímány APC buňkami infiltrujícími místo injekce • ochrana DNA před degradací nukleázami Kationické lipidy Kationické lipidy CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 H H HH ONHNH NHNH2 NH NH NHNH2 O CH3 CH3 L1 L2 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 H H HH ONH ONH O NH NHNH2 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 H H HH NH O ONH O NH NHNH2 NH ONH O CH3 CH3 O NH NHNH2 4 4 4 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 H H HH NH O NH NHNH2 L3 L4 L5 L6 Kationické liposomy jako nosiče léčiv Journal of Controlled Release 2012 Liposomální antivirotika – BHV-1 in vitro model na MDBK buněčné linii HPMPC (S)-1-(3- hydroxy-2- phosphonylmethoxy propyl)cytosine (Cidofovir®) N N NH2 OP O OH OH OH O O NH NH NH NH2 CH3 Bulky hydrophobic ligand 1 10 100 1000 10000 0 5 10 15 20 25 0% Lp-spermine 10% Lp-spermine 20% Lp-spermine 30% Lp-spermine Size (d.nm) Number(%) Inhibice virové replikace (TEM)