Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Přehled metod pro kvantifikaci biomasy
planktonních cyanobakterií (sinic)
Biomasa?
• Je např. koncentrace chlorofylu-a parametrem
biomasy sinic?
• Vztah biomasa vs. obsah fotosynt. pigmentů
• Co vlastně stanovujeme?
• Srovnatelnost?
Kvantifikace fytoplanktonu
Počty organismů
• Mikroskopie
• Analýza obrazu
• Průtoková cytometrie
Koncentrace pigmentů
• Spektrofotometrie
• Fluorometrie
• Chromatografie
Molekulárně biologické metody
1. Mikroskopické analýzy
• Identifikace taxonů
• Počty buněk / ml
Foto: Kubíček (CCT), pózuje Haňulka (CCT)
Mikroskopické analýzy
Výhody:
• Podrobná identifikace druhů
Nevýhody
• Náročnost na čas a lidské zdroje
• Statistická chyba při počítání, variabilita
• Přehlédnutí pikocyanobakterií
Mikroskopické analýzy
Fluorescenční mikroskop
• Odlišení sinic od řas
• … a léta praxe
Analýza obrazu
• Softwarová analýza
mikroskopických snímků
• Fluorescence
• Objemová biomasa
různých skupin
• Kombinace s průtokovou
cytometrií – FlowCAM
Zdroj: Walker et al. (2002) Journal
of Microbiological Methods 51,
149–162
Průtoková cytometrie
• Kategorizace částic podle
tvaru, velikosti,
fluorescence
• Úroveň rodů a druhů?
• Problém velkých kolonií
• Speciální průtokové
cytometry na fytoplankton
Zdroj: Becker et al. (2002) Cytometry 48, 45–57
Průtoková cytometrie
• Kvantifikace
koloniálních druhů
(Microcystis)
2. Kvantifikace pigmentů
Spektrofotometrie
Absorbance in vivo
• růstové
experimenty,
biotesty
Extrakty
• chlorofyl-a
• fykobiliproteiny
Spektrofotometrie
Chlorofyl-a
• Celkový fytoplankton
• Extrakce org.
rozpouštědlem
(ethanol, methanol,
aceton)
• ISO 10260
Fykobiliproteiny
• Fykocyanin – sinice
• Extrakce fosfátovým
pufrem
• Obtížná a zdlouhavá
extrakce
Fluorometrie
Extrakty
• Méně časté
• Chlorofyl-a,
fykobiliproteiny
• Proces extrakce
stejný jako u
spektrofotometrie
Fluorescence in vivo
• Vhodné pro in situ a
on-line aplikace
• Podrobněji v
příspěvku J. Gregor &
B. Maršálek
In vivo fluorescence řas a sinic
Sinice – fykocyanin
• excitace 590-630 nm
• emise 640-660 nm
Eukaryotické řasy – chlorofyly, karotenoidy
• excitace 440-530 nm
• emise 680-690 nm
Ponorné fluorescenční sondy
• Ponorné
fluorometry + PC
• On-line data
Ponorné fluorescenční sondy
Gregor and Maršálek, 2004, Water Research
Chromatografie
• Komplexní analýza pigmentů
• Problém rozpustnosti chlorofylů a karotenoidů
oproti fykobiliproteinům
• Rozlišení skupin na základě charakteristických
pigmentů, kvantifikace v mg/l chl-a
• CHEMTAX - program určený pro kvantifikaci skupin fytoplanktonu na
základě HPLC analýz; definovaný poměr charakteristických pigmentů a chla
pro jednotlivé skupiny
Chromatografie
Chromatografie
• Vhodné pro eukaryotický fytoplankton
• Sinice – zeaxanthin (fotoprotektivní karotenoid)
Dálkový průzkum Země
• AVHRR
– satelitní snímky
• LIDAR
– LIght Detection And Ranging
– Excitace laserovým paprskem
– Snímání emisního spektra
Dálkový průzkum Země
3. Molekulární biologie
• 16S rRNA pro identifikaci kmenů sinic
• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) pro
stanovení diverzity a struktury přírodních populací
vodních květů sinic
• DNA-array Technology- lze rozeznat různé genotypy sinic
(toxické a netoxické populace)
• + nevyžadují dlouhodobé zkušenosti
• - vyžadují specielní vybavení
Závěr:
• v praxi se běžně používá parametr chl. a
• dále převládají mikroskopické metody
• velmi perspektivní a prověřená metoda je
kvantifikace in situ pomocí fluorescenčních
profilů
• Vždy je nutno zvážit účel, čas, variabilitu a
celkovou přesnost metody
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována
Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem
České republiky