Fyziologie kmenových buněk Proliferation & Differentiation Se If-renewal Jiří Pacherník E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 Podpořeno FRVŠ 540/2007 KMENOVÉ BUŇKY - zdroj buněk dané tkáně / orgánu - primární buňky pro danou strukturu Schopnost - dávat vznik dalším typům buněk (schopnost diferencovat) - sebeobnovy (selfrenewal) = > kmenovost (stemness) Dělení buněk a jejich sebeobnova DbJbíjj buněk (proJiferacs) Symetricky - vznikají dvě identické buňky (^) ® Asymetricky - jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná Diferenciační dělení obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším stupněm v dané diferenciační lin diferenciační dělením symetrické diferenciační dělením asymetrické DVíBfBíiďm^B {fp-zfíi-zňuvíiin) buněk Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů. Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?). Pluripotent Stem Cells (^Totipotent 3 In vivo fertilized egg S cell embryo Cultured undifferentiated stem cells Neural cells Cardiac muscle Blood cells Kmenová buňka aktuální <-> potencionální Přechodně/transientně se dělící buňky (Progenitory)* Terminálne diferencovaná buňka** * Často proliferují a mají schopnost krátkodobé sebeobnovy. 7£ maturace ** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí. Ne všechny terminálne diferencované buňky jsou post-mitotické. přestavba genomu / chromatinu -> exprese jiného paternu genu -> jiná morfologie, jiné funkce a potenciál Determinace - předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu geny a jejich produkty - „houskeeping" (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu) - všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah) specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet - komponenty intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny) Jbasic ructure cture genotyp T— ic jructu Jb ^_^Hructure metal basic menabdMí bd fcwwjtabolipm baa)taboli|sm fenotyp basic structure basic netabolism dle skupin genu, které jsou exprimovány basic structure basic netabolism basic structure basic netabolism basic basic structure basic structure basic netabolism basic structure basic metabolisrr basic structure basic basic structure basic netabolism T basic structure basic metabolism basic structure basic netabolisr basic netabolism Meshorer & Misteli 2 Modifikace histonů - regulace transkripce SUMOylation AcetylatJon Methylation \ / Core histone t Ubiquitmation Phosphorylation ;cql_ a * •to H2N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVK H3 12 3 4 S S ID 11 14 17 18 _A_A_A__A • W H2N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK 23 26271 35 H4 1 3 5 S 12 16 18 20 A Acetylaiian ft Methylation l^ft Phosphorylation - o DNA mod ifications Histon e modif i cations V Meihy(3ied CpG A H3K9ac # H3K9m3 Unmethytatřd CpG O H3K4m3 ft H3K27m3 ESCs MSCs DIFF oř A ? K4nW ^ K27m3 His1r,ntH3 pK* _^ K4m3 K**° TT. on Hislpne H? |—í B Pnuim j foí PcG (* PcG ON f P* Priming lor ON Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4 u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk 0113 k, ; gttO-í 1 MÍKSat JI tf.) EG MBP H3KŮaoK14ac Ji V6ř EC MEř 0 J1 EC H3K27meJ 14 18 23 79 A H3 H3KSrt1*1 r: Ji 1:: f\ U6.5 EjQ mef H3KSm»2 vil: JI Wí ec mef H3K9m*3 ji ve.s ec U=f db_H3K4mM_ i_ 1 °*__1 " 11 b JUfl "1 * JI VfS ec mef H3K4m»2 JJ Ve.i ec mef 0 H3K4me3 H3K73me2 -r- rfl I ji v£i fit 12 20 B H4 C macroH2A JH UB.S H4K20me3 ! Ji US 5 -C HEF macnaH2A JI J1-RA MEF Dai & Rasmussen 2007 HA - model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) -> metylace DNA ETCM - model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks) -> modifikace histonů PT - model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription) -> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu Meshorer & Misteli 2006 Polycomb group (PcG) x Trithorax group (trxG) proteins PcG jsou odpovědné za inaktivaci transkripce cílových oblastí trxG jsou odpovědné za aktivaci transkripce cílových oblastí - obecně patří mezi skupinu proteinů modifikujících chromatin - regulují zejména transkripci homeotických genů - význam v ontogenezi -jsou odpovědné za epigenetickou pamět genomu - rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA PRE - PcG responsive element TRE - trxG response element -jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou (PcG 4 základní skupiny komplexů), specifita těchto komplexů k daným PRE/TRE je dána dalšími asociujícími specifickými podjednotkami PRC2/3/4 PRC2/3/4 PRC2/3Í4 Quiescence Differentiation Checkpoint Stem cell Cell number GO mechanisms renewal expansion A hadiska ^Snovnosú ivom daJší burjščrjé ivpy se buňky dáJÍ mi; Totipotentní - mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu Pluripotentní - mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy) Multipotentní - může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady (Oligopotentní - podobné jako multipotentní, ale méně typů) Unipotentní - dávají vznik jen dvěma typům buněk Nullipotentní - mohou se pouze dělit, nemění fenotyp TaiipaianiJTJj buňky -1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci) - Omezené možnosti dělení (neprobíhá transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.) - Existují pouze přechodně 2-cell stage Ztráta totipotence v průběhu časné embryogenéze - vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk - tento proces je ireverzibilní The Erophutolast will becomť part oŕ ihc pľace ni lI. http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer Magdalena Zernicka-Goetz 2006 ME EM MM 4 EE * RANDOM 80% of all embryos M - meridiální / E - ekvatoriální Orientace blastomer 4-buněčného embrya a její vliv na zachování absolutní totipotence těchto buněk "ME" EMBRYO still permits CHIMERA OF A/V CELLS MERIDIONAL CHIMERA MA LV VEGETAL) regulative development CHIMERA A OR V CELLS ARREST AT PERI- DI IT --> IMFLANTATION --> Píotyowihx^hlííiche-elralí, Development2005 P\i\npo-íBímň buňky (savci) a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy buňky epiblastu / primitivního ektodermu buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) kmenové buňky teratomů (?) ! (somatické kmenové buňky?) b) In vitro: embryonální kmenové buňky embryonální zárodečné buňky embryonální nádorové buňky (kmenové buňky teratomů) indukované pluripotentní kmeové buňky spermatogoniální kmenové buňky (z dospělých varlat) ! (somatické kmenové buňky?) Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gastrula Ectoplacontai cone Visceral endoderm ectoderm Boiani & Scholer 2005 Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,... ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové. Pleopotence (změna v determinaci) pluripotentní buňka \ multipotentní tkáňově specifická buňka Pleopotence / \ i progenitory 1 I multipotentní tkáňově specifická buňka o ^-^(Pleopotentní buňka) terminálne diferencované buňky Schopnost sebeobnovy = self-renewal Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / m u Itipotence /..... = > kmenovost = stemness - Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp / relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...) = VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY - Některé somatické, terminálne diferencované buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálnejšou ale quiescentní (spící) = FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY (snad některé hepatocyty a buňky plicních epitelů) - Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni = Sebeobnovující se diferencované buňky - dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (orgai - relativně pomalá proliferace - jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní - jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení - s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí profesionální SC - v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, „niche" (koutek) - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... _ ??? Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní) Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta) a kmenové buňky trofoblastu KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen „in vitro1 jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání relativně rychle p rol iterují některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé pluripotentní (embryonální původ) mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = „asymetrické/symetrické" dělení mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... ??? Embryonální kmenové buňky -> odvozené z vnitřní buněčné masy (Kmenové buňky epiblastu) Embryonální zárodečné buňky ■> odvozené z primordiálních zárodečných buněk Embryonální nádorové buňky -> odvozené z kmenových buněk teratomů Somatické kmenové buňky odvozené -> odvozené ze somatických kmenových buněk REGULACE KMENOVÝCH BUNĚK Existence kmenových buněk je regulována a) vnitřními (intrinsic) faktory (vývojově specifické transkripční faktory a specifické kombinace drah transdukce signálů) b) vnějšími (extrinsic) faktory (v niche) Kmenové buňky mohou existovat jen v příslušném „NICHE" Co v NICHE najdeme? růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný kontakt, hypoxie, nedostatek živin? Podobně jako se zdají být somatické SCs tkáňově/orgánově specifické, jsou specifické i jejich „niche". b. Mouse bone marrow KB nemohou být bez „niche „Niche" KB je závislé na KB Naveiras, 2006 Cap cell » Osteoblast "~—\T\ ----NICHES------------i „_-___!-[_ Myofibroblast * Astrocyte Basement mb -I: c. Moose small intestine d. Mouse sjbventncülarand subgrarutarzone a C. elegans (one-cell stage] b £>. meianogaster (neuroblast) Apical G MC _ PAR- 3/PA R- 6/ P KC- 3 PAR-2, PAR-1 — LIN-5/Ga ■ ■ ■ GPR-1/2 • PIE-1 — Microtubules DNA - PARS/PARů/aP KC - Mud/Pi ns-Loco/G,,, - Mira. Pon Brat. Numb. Prospero - Microtubules DMA c D- metanogaster (SOP) Anterior Posterior pi lb \^ plla — PAR3/PAR6/aPKC — Mud/Pins-Loco/Grri — Pon O \ui b. Nejrdl ..wj 4% Recycling endosome — Microtubules «3> DNA Apical Basal Polarity Apical Příklady mechanismů regulujících symetrii buněčného dělení na modelových orgaismech NB - neuroblast SOP - sensory organ progenitor (Jan & Jan 2000; Robert Andrews & Julie Ahringer 2007) Planar Polarity Apical Q^J N B hrj GMC Post. Ant. Basal NB Basal SOP Polarized Gpithelium Delaminating neuroblast Metaphase neuroblast Bazooka Inscuteable Pins Numb/Prospero Úloha (trimerických) G-proteinů v regulaci polohy dělícího vřeténka Horizontální orientace vřeténka Náhodná orientace mitotického vřeténka u buněk s inhfoovanými Gpy Symetricky dělící se buňka Asymetricky dělící se buňka Symetricky dělící se buňka ™ Pocfoet laterální polarity Proteiny určující neurální osud buňky Gpy v komplexu s Got W Volný Gpy íf Inaktivovaný volný Gf3y jsaj 2005 Dělení genomu u progenitorů/kmenových buněk při asymetrickém dělení First round of DNA replication, cell division (ED DNA Replication -► /i CldU Cytokinesis Second round of DNA replication, cell division <0) Äff DNA Replication s?*\ IdU li li o \ Conboy 2007 Daughters indistinguishable ** * * Hoechst First Label Second Label Merge (CldU) Daughters distinguishable Četnost asymetricky a symetricky dělících se kmenových buněk kosterní svaloviny in vitro - potvrzení výše uvedené hypotézy Sca-1 - znak kmenové buňky koserní svaloviny Desmin - protein charakterizující myoblast (časný progenitor svalové buňky) Hoechst Brd U Desmin Merge * * * Hoechst Desmin Sca-1 Merge Ii -II» I I » o. S "C m o. rä o =i £ 25 BrdU + :-Desmin +; - +: - - ; 4- + BrdĽ+, Desmine Brdu-, Dcsmin-Brdu+, Desmin-Brdu- Desmin* Desmin Sca-1 i : ■ + +: -+ ■ - O Desmin+, Sca-1-O Desmin-, Sc*H O Desmin+, Sca-1 + O Desmin-. Sca-1- o, +: - Conboy 2007, Signální dráha LIF (leukémii inhibující faktor) -> gp130 signalling _^»self-renewal _ Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophilý) Význam gp130 signalizace v průběhu embryogenéze Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory) Signální dráha TGFp / BMPs (Transformující růstový (growth) faktor (3 kostní (bone) morfogenetické proteiny) Type 1 Type II ►0*"Smad)v Smad4 Cytoplasm l-Smad Smad4 Nucleus 1 Interakce v signálování rodiny TGFbeta TGF-JJ1 TGF-p2 TGF-p3 Ugand O nu Rl Activin Nodal Lefty O BMP2/4 BMP6 BMP7 O MIS/ AMH O li inn- MISR11 R-Smad activation T[iRl Smad2 Smad3 A L K1 . Smadl I> SmadS Smad& Endothelium restricted ActRIB ALK7 Smad2 Smad3 BMPRIA BMPRIB Smadl ~S SmadS SmadS ALK2 Smadl Zy SmadS SmadS INTERKCE FGF & TGFß DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU FGF, IGF EGF, HGF > Ras >MEK1 MH1 B Srn ad 1 Erk1,2 Other kinases BMP receptor MH2 W ¥ ® MH1 Smad2 NucJear import —I Epidermal d fferentíatíon Mesoderm ventralization Massague, 2003 TGFß, Nodal. Activin receptors MHZ (B Nuclear import Mesoderm induction 98 Signální dráha Hedgehog sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) Ptc - Patched Smo - Smoothened Cytoplasm Ligand Notch RAM donům Ankyrki i-cp&ati Cytoplasm RBP-J independent RBP-J \ dependent * Signální transdukce Notch, po navázání Ugandu (DSL rodina = Delta, Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně i intracelulární (NICD - Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru s CSL (= CBF1 - Cp binding factor 1) aktivuje transkripci. Kadheriny sprostredkovaná komunikace mezi buňkami Phosphorylation sites site Calcium-bimJing site Cíli riHTiibranc Calcnin& Integriny, aktivace vazbou ECM, zprostředkovaná transdukce signálu 03 JNK *-> ^ "J* Antr Signální dráha jaderných receptoru obecně cell membráne Boghog 2; Wikipedia Signální dráha jaderných receptoru and ® ( N R ) jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory TF TF ( N R I N R ) transkripce transkripce DNA\ sebeobnova x diferenciace ?differenciace x sebeobnova? HYPEROXIE x NORMOXIE x HYPOXIE x ANOXIE anoxie - 0% kyslíku tkáňová hypoxie - 0-3% kyslíku tkáňová normoxie - 3-5% kyslíku atmosféra - 21% kyslíku In the human organisms, 02 concentration varies significantly between the tissues: in the lung parenchyma and in circulation (McKinley and Butler, 1999; Saltzman et al., 2003; Johnson et al., 2005; Wild et al., 2005), as well as in well irrigated parenchymal organs (liver, kidneys, heart; Wo" Ifle and Jungermann, 1985; Jungermann and Kietzmann, 1997; Roy et al., 2000; Welch et al., 2001; Mik et al., 2004) it is comprised between 14% and 4%. In other tissues, relatively less irrigated, 02 concentration is even lower: in the brain, it varies from 0.5% to 7% (Whalen et al., 1970; Nwaigwe et al., 2000; Hemphill et al., 2005) in the eye (retina, corpus vitreous), from 1 to 5% (Buerk et al., 1993; reviewed in Yu and Cringle, 2005), in the bone marrow, from 0% to 4% (Tondevold et al., 1979; Chow et al., 2000). HYPOXIE Embryogenéze Organogeneze Homeostáza Pathologie GROWTH FACTOR t CYTOKlhES (PDOF. TGF0, ILlMNFo. IL5,ILÍ.IL1U| 5UFPRE5-"50H GENES ONCOGENES (rtiL HSl.(i16J l(rj:, r Ii, HC HERZerbi ftwtflj [VE G F -5lr [ HEO*HQIQQEME3IB PERITUHOH^L IN FLAMM ATD R V HE*CTIC*t ^ TUMOR SlCOB FLOW In this figure the structural and functional effects of Hypoxia, HIF-1 and VEGF on tumor microcirculation, cancer metabolism and therapies are illustrated. The vicious circles that occur are also shown. (Modified with permission from: Baronzio et al. Anticancer Res 1994; 14:1145-1154.) J UbiquitJn HIF - hypoxií indukovaný faktor HIFlb (ARNT) + HIF la = HIFI (obecná buněčná odpověď na hypoxii) - (-) exprese c-myc / cbl -> CC arrest - stabilizace NICĎ (Notch) => sebeobnova - (+) glykolýza (PĎK, Glutl/3, LDH A, HK,..) - (+) MTC4 (ef lux laktátu) - (-) mitochondrie = (-) oxid. fosforylace (-) ROS HIF2a = HIF2 (částečně buněčně specifické, EPO) - podpora buněčného cyklu - (+) exprese Oct4... + HIF3a = HIF3 (.. .?..různé, buněčně specifické) Modifikace glykolýzy prostřednictvím HIF Plasmatic membrane zvýšení expresse GLUT1,4 zvýšení exprese enzymů glykolýzy inhibice přeměny pyruvátu na AcetylCoA Lactate ^ a-Kfttoglutarate I Mutant IDH1 2-h y d roxy -gl u ca rate Gít/taminolysis Glutámate <:_Glutamine GLS Figure 2 - Metabolic remodeling in cancer cells and regulation by signaling pathways invoking oncogenes and tumor suppressor genes. The key enzymes of glycolysis the TCA cycle, the pentose phosphate pathways glutarninolysis, nucleotide, and lipid biosynthesis are shown as the regulation points by oncogenes and tumor suppressor genes. Inhibice glykolyzy v dusledku oxidativni fosforylacc Glucose PI Giuco&e-e-p + to me ppp Fructose-6-P ADP. AMP ATP ADP I ' © Fnictose-1h6-bteP - glyceraltiehyde-S-P 1,3-dlphosphoglycerate t ' J Phosphogtyc&rate kinase 3-phosphaglycerate 2-phosphoglycerate 2WjO-- I I 2ADP - 2NAD- phosphoenolpyruvate | | Pywitfte fa/rase-? pyruvate Lactate deshydrogenass-S lactate+ H- ATP citrate V + to the TCA cycle Modifikace lipidového metabolismu prostřednictvím HIF Triacylglycerol Hypoxic adaptation of lipid metabolism Regulace HIF - všechny podjednotky HIF prakticky konstitutivní exprese - regulace zejména degradací podjednotek HIFa (- Částečně i regulací transkripce) Degradace HIF v přítomnosti 02 - hydroxylace prolyl hydroxylasami PHD, FIH - degradace v proteasomu zprostředkovaná pVHL faktorem 02high O£low Active HIF hydroxylases Inactive HIF hydroxyI PHDs FIH Stable HIF-b Pro As Unstable HIF-s HO-Pro Asrtr-OH Co-activator recruitment pVHL mediated Blocked p300 oo-degradation activator recruitment HIF-1jr? \ / Inactivation of HIF transcriptional activity Activation of HIF transcriptional activity HYPOXIE <& HIF (hypoxií indukovaný faktor) a Normoxia Cell proliferation and survival HIF-1a regulation by proline hydroxylation Expert Reviews in Molecular Medicine 2005 Published by Cambridge University Press Stabilita a transaktivační aktivita HIF je také regulována dalšími postranslačními modifikacemi včetně fosforylace Increased VEGF Increased CXCR4 Increased CXCL12 DPP-4 -T Inactive Sitagliptin CXCL12 HIF-1 GSK-3 Akt inactive p-GSK 3 +02 p-HIF-1 OH-HIF-1 + VHL Proteoso me degradation Lithium inhibits this at 2 meq Lithium enhances this at 0.8 meq Ischemia (0.1 mM Glc, 0.1% ROS generation Dissociation of GRX/TRX from ASK1 Activation of ASK1 (^pVHL^) 1 p38 MAPK (a, ß,r8) HIF-1 ň-^ Ub Proteasoma! degradation Prolyl hydroxylásy ( PHD; + Asparagin hydroxylasy; + ?) - sensory kyslíku a regulátory stabilizace HIF-Xalpfa - kofaktory a-ketoglutarát (2-oxoglutarát), 02, Fe2+,.. R-2HG Succinate Fumarate S-2HG_I Hypoxia R05 Co J4/N r34 ZOG Substrate Intracellular iron store Succinate Substrate OH H2°2 re Fe^ + *OH + OH Ascorbate /G5H PHD regulují aktivitu NFkB PHD regulují translokaci glutamátového receptoru a iontového kanálu TRPA1 (a) Normoxia Hypoxia 4 ^ Ser O GLR-1 trafficking to synaptic sítě Pra Ser 'eěI-EJE^) G lr-1t raffi c ki ng «- __ to sy r, apti c s it e Inactive Pro^^^^ GLR-1 P «* (b) Hypoxia TRPA1 s* Cys-SH Cys-SH Na^Ca3* TRPA1 membrane 4 recruitment Normoxia TRPA1 Hyperoxia r 0H cys-&H TRPA1 O 2 PHD □ H Pro TRPA1 ^1 o. PHD3 Ma* Ca3* TRPA1 *■ internalization Activating transcription factor 4 ATF4 PHD1/3 Binding Negative regulation of transcription factor activity Human precursor RMA processing 19 hPRP19 PHD3 Binding Inhibition of cell death Paired box gene 2 Pax2 PHD3 Hydroxy lati on (?) Negative regulation of transcription factor activity Sprouty homolog 2 Spry 2 PHD1/2/3 Hydroxy lati on Negative regulation of Sprouty 2-mediated inhibition of FGF-induced ERK1/2 activation* TCP-1 ring complex* TRiC PHD3 Binding Protein folding (?); activity (?) Osteosarcoma amplified 9 OS-9 PHD2/3 Binding Enhanced hydroxylase activity A-kinase (PRKA) anchor protein 12 AKAP12 PHD2 Binding (?) Enhanced association of HIF-1a and PHD2 Mi tog en-activated protein kinase organizer 1 Morgl PHD3 Binding Enhanced hydroxylase activity Inhibitor of growth protein 4 ING4 PHD2 Binding Enhanced hydroxylase activity Iron-only hydrogenase-like protein 1 I0P1 PHD2 Binding (?) Enhanced hydroxylase activity (?) Melanoma antigen gene protein-AH MAGE-11 PHD2 Binding Decreased hydroxylase activity Cerebellar degeneration-related protein 2 Cdr2 PHD1 Binding Enhanced repression of HIF Myogenin Myogenin PHD3 Hydroxy lati on Stabilization of myogenin protein Kinesin-like protein 1B [J KIFlBfl PHD3 Hydroxy lati on (?) Induction of apoptosis Large subunit of RNA polymerase II Rbp1 PHD1/2 Hydroxy lati on Activation of Rbp1 and tumor growth promotion p(2)-Adrenergic receptor p(2)AR PHD3 Hydroxy lati on Regulation of receptor degradation Human homol og of the Caenorhůbtíitis eiegans biological clock protein CLK-2 HCLK2 PHD3 Hydroxy lati on Promotes DNA damage response Cysteine synthase like-1 CYSL-1 EGL-9 Binding Inhibition of Egl-9 in hypoxia Phospho-diesterase 4D PDE4D PHD2 Binding; hydroxylation Regulation of intracellular cAMP levels Pyruvate CoA SH + NAD .Pyruvate dehydrogenase ,S- C02 + NADH, H+ Acetyl-CoA ^HC03 + Pyruvate carboxylase S^ADP +Pi V_ Citrate Qxaloacetate ] NADH, H NAD Aeon i tase Malate dehydrogenase Malate Citric acid cycle Legend o Hydrogen Q Carbon Oxygen Q Sulfur CoA Coenzyme A Ordinary bond High-energy bond Adenosine triphosphate Jjfl^ Guano sine cSiTR^' triphosphate NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Q Coenzyme Q Pyruvate dehydrogenase Enzyme Isocitrate HD+ de hydro gerta; Zralejší mitochondrie => víc ATP = > víc ROS (reaktivní kyslíkové radikály) = > poškození DNA = > peroxidace lipidu, deregulace signálních drah HYPOXIE => stresované mitochondrie (bez 02(?) a Acetyl-CoA) => přechodně víc ROS (=> stabilizace HIFI (?)) => přechodně akumulace f umarátu a sukcinátu (=> inhibice PHD => stabilizace HIFI) Produkce ROS mitochondriemi | HIF I Oxidant dependent signaling pathways? Hypoxia TH.O 2^2 cytosof iniermembrane Space H+ HH 02 HjP HIFI - indukuje autofagii mitochondrií - potlačuje biogenezi mitochondrií - potlačuje maturaci mitochondrií = > snížení ROS + 02 -* Mitochondrial ROSt HIF-la v 1' ^^^^ PDH Autophagy i i ISCU1/2 l Mitochondrial ROS + Glucose > Gluti * Glutamine SLCAAS 0 Glutamine CCR Molecular Pathways FENOTYP KMENOVÝCH BUNĚK x HYPOXIE Kmenové buňky - některé (?) vysoká hladina HIFI, i v normoxii!!! - některé (?) hypoxické niche - Wartburguf efekt = glykolýza nezávisle na dostupnosti 02 - potlačená aktivita/zralost a počet mitochondrií = > málo ROS = > závislost na glykolýze - hypoxie (3-5%) podporuje kmenovost - hypoxie (3-5%) podporuje reprogramování na iPSC Hypoxie prostřednictvím HIFI - potlačuje oxidatívni fosforylaci inhibicí biogeneze a aktivity mitochondrií = > snížení produkce ROS => podpora kmenovosti - podporuje glykolýzu = > nezávislost na mitochondriích a oxidatívni fosforylaci - stabilizuje NICĎ = > vyši aktivita Notch ~ podpora kmenovosti - farmakologické inhibitory PHD zvyšují pool quiescentních HSC a jejich regenerační potenciál po ozážení in vivo [Fomstai et ai.. 2013 Biood] čímž potlačuje diferenciaci a udržuje kmenovost Mitochondrie a kmenové buňky Glycolysis X Lactate Pyruvate ----■-■ UCP2-—4 TCA ATP Re programming Mitochondria Maturation MtDNA :ony number | ATP production t Mitochondrial OxPhos ^ Total cell mass ^ Lactate production Elongated shape, and XuetaL.Cell Metab. 2013 cristae-rich morphology Globular shape, and cristae-poor morphobgy Inhibice maturace a funkce/aktivity mitochondrií (deplecí klíčových enzymů) = podpora kmenovosti (HSC) [Yu etal., 2013 Cell Stem Cell; Takubo et al., 2013 Cell Stem Cell]