Neurální kmenové buňky - NSCs
(Neural stem cells)
Gl - glomerular™ vrstva Gr - granulami vrstva
Neurogeneze v dospělosti!
(hlodavci (savci obecně??), zpěvní ptáci)
❖ neurogeneze v důsledku březosti $
❖ neurogeneze v době vábení S neurogeneze regulovaná hormony
RMS - rostrální migrační tok (rostral migratory stream)
Notch ligand
Astrocyte-tike stem ce\\
progenitor
neuron
Oblast s NSCs obsahuje čtyři typy buněk
1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+)
buňky - typ B = NSCs (přesný fenotyp není dosud úplně objasněn - ±GFAP??, ± nestiň ??)
2) spící, případě potřeby intenzivně proliferující buňky vzniklé z buněk B - typ C (TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory)
3) z buněk typu C vznikají buňky A = neuroblasty
4) ependymální buňky - typ E
Shh; Delta/Notch -> Hes Sox1, 2, 3; Emx2; Zic1; Pax6       / g
(NSC)
migrace
radiální glie - embryo a časně postnatálně
Fenotyp neurálních kmenových buněk
Embryonic neural item cell (radial gliaj
\
fVCMWHTl-I
[>D:??
Neural precursor Mil
GD3
Neuronal precursor cell
Immature neuron
Po.atmito(ic, neuron
Adull
nEural stem call
G.Ki) GDts
PSA-NCAM Pfonvnin-t
SSEA-f
Glial precursor cell pro jtmlor «|ij
MGS SSEA-T*
Qligodendrccyle
OJ Ol
Type-2 aslrccyfe
„Niche" neurálních kmenových buněk
rA - radiální astrocyty hA - horizontální astrocyty D - nezralá granulami buňka G - nová granulami buňka
Architektura v subventrikulární zóně (SVZ)
Architektura v subgranulární zóně (SGZ)
The NSC Niche
Astrocytes
NSC přisedají na krevní kapiláry
- přísun živin ?
- NSC exprimují HIF !?! (hypoxií indukovaný faktor)
Původ NSC
- pozůstatek neurogenní populace z časné embryogenéze
B
Symetrické, proliferativní delení       Asymetrické; neurogenní delení Asymetrické; neurogenní delení
Bazálni strana
T T
-o
0
LUL
Apikální strana
Vertkální poloha delení
-Iveuron
Horizontálni poloha delení
Vertikálni poloha delení
0 Jádro
Bazolaterální membrána    n Přichycené spojení ^™ Apikální membrána
Huttner 2005
Proporční změny v symetrii buněčného dělení mezi neurálními kmenovými buňkami (stem) a neurálními progenitory (n , transientně se dělícími buňkami - TA)
v půběhu neurogeneze u myši
A i.(
0.5
0.0
E11
<100 >0
E12
96.5 3.5
Division Type
— stem
neurogenic
E13
86.5 13.5
E14
50 50
E15
82 18
E16
84 16
E17
-100 -0
Haydar 2002
Radiální glie (RG) jako embryonální NSC
Nestin+, Vimentin+, GFAP+, Sox2+, Pax6+
vRG - bipolární RG, ventrikulární zóna oRG - unipolární radial glia-like cells,
vnější ventrikulární zóna IP - přechodné progenitory
Lui et al., 2011
				GW 15.5
		p	■ ■.	Cortical plate
		UK: f: . -i- L	■	
í: 'A •		-	■ ■	
				osvz
				
>í    t   h   1 '1				ISVZ vz
B
en
Self-renewal
u
/V
Differentiation
SOX2 TBR2
oRG call mitotic somal translocation (MST) and daughter cell transit amplification
t—Y—f
H
•-4
oRG cells generated from the VZ and expanded In the OSVZ
Increasad capacity for transit amplification
oRG proliferation
v   y   y   y y=
oRG differentiation
osvz
ISVZ
SOX2
NcuN
CTIP2 Merge
VZ
A lineage of cells in the OSVZ
1a. oRG cells generated from VZ that have pial contact (SOX2* HES1* TBR2")
í
1b, oRG cells generated from □5VZ without pial contact (SOX2* HES1 * TBR2")
2a. Bipolar, early IP cells that express markers of the undifferentiated state (SOX2~HES1*TBR2)
2b, More mature IP cells (SOX2HES1 TBR2']
3.  I mma I u re postmitotic neurons
(SOX2- HES1- MeulM*]
C
A) Buňky exprimující znaky/markery charaktristické pro časné progenitory (Sox2) a neurony (NeuN a CTIP2) ve ventrikulární zóně neokortexu.
B) Dělení oRG ve vnější vertikulární zóně
C) RG/vRG dávají vznik jak vRG tak oRG, zda je vždy zachována délka radiál, fibril není známo
D) oRG produkují přechodně/transietně se dělící buňky schopné dále diferencovat
E) Diferenciace potomků oRG, ztráta exprese Sox2 a snížení aktivity Notch (snížení HES1), zvýšení exprese TBR2
oRG na rozdíl od vRG neexprimují CD133 (Prominin), Par3 (PARD3), aPKC?i, tj. součásti apikální membrány charakteristické pro apikálně-bazálně polarizovaných buněk.
- V průběhu ontogeneze intenzivní proliferace NSC (radiální glie) a TA progenitorů, stimulováno LIF a CNTF v mozkomíšním moku, produkovaných zejména z plexus choroideus, důležitá a dosud neobjasněná interakce s Notch drahou/signalizací.
- LIF/gp130 signalizace působí pleiotropně, u zralejších progenitorů indukuje diferenciaci do glií, zejména astrocyty, a celkově podporuje maturaci neuronů, zejména motoneuronů.
B
neural specification
Noggin Chandin
5MPs
neuro Notch
epithelium
BMPft
neurogenesis
5MAD1 Ngn1 [*~ neurogenic gen«        gli^enfc genes
melhylatkwi—|!
ŕ
c
giiogenesis
STATU p5TAT3 SHP-2—|Uak
pJDOŕCBP 5MAD1pSTAT3 f*-glitxjöniL g&nes
STAT3-- pSTAT3
adult
S3* !Č
m
svz
progenitors
Dvojitá úloha Notch a gp130/STAT3 signalizace v neurogenezi
- Notch a STAT3 aktivita se vzájemně podporují
(STAT3 reguluje expresi ligandů Notch, Hes aktivuje STAT3)
- oba v závislosti na dalších faktorech a statusu buněk podporují sebeobnovu NSC a indukci gliogeneze
Plexus choroideus
linker hersenhelft —s\~ - \
Interhennisferische spieet
rechter heisenhelft
sleuven gevuld met hersenuocht
plexus choroideus
rale
senkanners
'Icxm cboroidru;
Sei teil vfinricpj
Kin innen l.usuhkj
k4. Vent rittI
I For;) Al hl PvlHytiltlie
Schéma kortexu hlodavců (A) a člověka (B)
LuietaĽ 2011
Rodent
Cortical plate
Intermediate zone
Subventricular zone
Ventricular zone
B
Human
Cortical plate
Mature neuron
Intermediate z one/sub pi ate
Outer fiber layer*
Migrating neuron
Integrin
Mature neuron:
NeuN*
Outer subventricular zone
Inner fiber layer
Inner subventricular zone
Ventricular zone
ISVZ IP
SOX2' HES1 TBR2"1
Mechanismus regulace RG buněk
neurální progenitory/IP aktivují Notch dráhu u RG buněk a tím blokují jejich diferenciaci Notch je dále regulován hladinou volného a s Par3 vázaného NUMB (úloha bazálni membrány)
Lui etal., 2011
Neuronal State
Notch signal ing
RG
state
Secreted 1 actors
MmcJ-öombl
NEUROG2 ASCL1
HES1/5
B
MitOSiS
(vertical cleavage, majority)
SVZ IP cells
Neuronal tjiffefentiation
RG
seif-renewaf
Notch
signr. iiu
Mitosis
{oblique/horizontal cleavage, minority)
oRG cell
LGN
■
Low active NUMB
sequestered NUMB
Low Par3
Low sequestered NUMB
Interphase
Regulace klíčových signálních drah komponentami asociovanými s vazbou na bazálni membránu
Notch signaling
NUMB
Shh signaling
T
N-cadherinP aE-catenin adhesive p-catenin
Par3, Par6. aPKC
Luietal., 2011
V průběhu embryogenéze jsou NSC tzv. radiální glie ventrukulární zóny
(vRG + oRG)
Adultní NSC jsou:
1) radiálním gliím podobné buňky, jako v průběhu embrvogenezef?)
2) adaptované/pozměněné časné přechodné progenitory (IP)?
3) v dospělém mozku nejsou kmenové buňky s neomezenou schopností sebeobnovy, existují pouze IP schopné několika cyklů dělení
Differentiation zone
E13.5
Cerebral cortex
: :fJ-V Basal '* ganglia
Figure 1.2 Coronal schematic of the developing mouse telencephalon. Adapted from (30).
NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají vznik buňkám všech tří zárodečných listů (netvoří pohlavní buňky, nebylo prokázáno) u chimér se také NSCs nepodílí na hematopoéze i přesto, že v případě likvidace hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26) na druhou stranu není jasné, zda NSCs tvoří všechny typy nervů a glií (SC x TA) neurální multipotentní progenitory byly izolovány i z retiny, optického nervu, hypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchy tyto směsné populace nejsou schopné dlouhodobé proliferace in vitro tak jako NSCs a také si zachovávají některé epigenetické znaky podle místa původu po poškození mozku je možno neurogenezi detekovat i v striatu, neokortexu nebo v místech kortiko-spinálních motoneuronů NSCs s věkem ubývá, podobně jako ostatní adultní SSCs, každopádně je lze izolovat z mozkové tkáně i několik hodin (4-6h) po diagnóze klinické smrti in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. „neurosfér" ve speciálních médiích určených pro expanzi neurálních progenitorů, bez séra, ale s nadbytkem FGF2 a EGF LIF-gp130 / Notch blokují diferenciaci NSC, a podporují jejich proliferaci „neurosféry" jsou plovoucí útvary s navýšeným množstvím neurálních progenitorů a NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i glií i neurální progenitory (TA) lze dlouhodobě kultivovat
Příprava neurosfér, primární a sekundární neurosféry (Dirks, 2008)
self renewal
O --*
expansion stem cell     £Gp pQp
pn mary neurosphere 1000's of cells
Oq   qO      few stem cells O O and
dissociation Q      O     O     many ******* cells OOO ^ self-ienewaJj
V
multi lineage
differentiation serum
sticky substrate
expansion EGFFGF
secondary neurosphere
number of stem cells
size of progenitor divisions
\
neuron
astrocyte
o ligode ndrocy te
	^^^Ě ^^^^^^^ EOT;	
		-■ d
In vitro kultivace NSC - neurosféry
c) E       + nestiň; d) E     J + buněčná jádra
A - kolonie ze zdravé kostní dřeně; B,C kolonie z kostní drěně NSCs (ROSA) transplantovaných myší po ozáření D,E - GM-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA); G,H - M-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA); D,G a E,H - bez a s X-Gal; F - granulocyty + makrofágy & I - makrofágy, stanovení May-Grunwald-Giemsa