Analýza genové exprese pomocí cytometrických (a jiných) metod Studium exprese a funkce microRNA Eva Slabáková, Ph.D. BÍ9393 Analytická cytometrie 12.11.2013 Oddělení cytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno E-mail: slabakova@ibp.cz tel.: 541 517 166 Analýza exprese a funkce microRNA Genová exprese a způsoby její analýzy Regulační RNA molekuly Strukura, vznik a funkce miRNA Databáze a predikce miRNA Metody analýzy miRNA - microarrays -qPCR - „bead-based methods" - funkční analýzy Ústřední dogma molekulární biologie Transkripce Translace Genetická informace (DNA) + RNA polymeráza + Nukleotidy + Transkripční faktory i mRNA transkript mRNA transkript + + Ribosom + Aminokyseliny i Protein Úrovně regulace genové exprese Modifikace a ,_ remodelace chromatinu _^ Transkripční faktory Sestřih RNA "- transkriptu Stabilita mRNA «- HP*'-ij Degraded mRNA Editace RNA transkriptu (připojení čepičky a polyA-konce) _t Regulace translace (iniciační, elongační a terminační faktory) Posttranslační modifikace proteinů 1 Detekce RNA v živých buňkách SmartFIare™ technologie (Merck Millipore): ,f 1 /U Využívají technologii nanočástic zlata - pro I JI ,/ A buňky netoxické Konjugace nanočástic s řetězci oligonukleotidů komplementárními se sekvencí studované RNA (capture strand) Do buňky je próba dopravena s komplementárním řetězcem obsahujícím fluorofor (reportér strand) IAMAAAA~0\ACCATACACCGTCACrTTGCTTGACCC Capture 5trand »-AGTTGGTATGTGGa>.CT Reportér Strand SmartFIare™ Technologie - princip a výhody ? v \;.. ****** ^ Detekce in vivo Data na úrovni buněk Netoxické Možnost downstrearr zpracování Sortování buněk Multiplexování 2. Úloha RNA v regulaci buněčných funkcí ■ 1998 objev RNA interference (Andy Fire a craig Meiio, Nobelova cena 2006) ■ Význam RNA interference (RNAi): ■ Inhibice translace, vedoucí ke snížení proteinové exprese ■ Udržení genomové stability (umlčení transposonu) ■ Obrana proti virové infekci ■ Experimentální umlčení genů ■ Genová terapie Proč studovat miRNA ■ Evolučně konzervovaný mechanismus ■ Tkáňově specifická a časově ohraničená exprese během embryogenéze ■ Schopnost regulovat až třetinu genů v organismu (kontrola buněčného cyklu, apoptózy, vývojových a fyziologických procesů, buněčného cyklu, apoptózy, ...) ■ Změny v expresi při mnoha onemocněních Many microRNAs are down-regulated in primary human tumours Human tissues 2. Regulační RNA molekuly ■ siRNA - short interfering RNA (dsRNA prekurzory s perfektní komplementaritou) ■ miRNA - microRNA (dsRNA prekurzory s nedokonalým párováním) i piRNA- Piwi-interacting (sekvence nejsou konzervované; umlčení retrotransposonů v zárodečných buňkách) Kim V. IM. Genes Dev. 2006;20:1993-1997 Drosha Dicer Hairpin —C-.....-■»* -22 nt miRNA 21-28 nt siRNA irukuľEi m i RNA O. OL ■ miRNA často kódována introny genů ■ Struktura vlásenky ■ „Seed region" - 8 nukleotidů s perfektním párováním 3. Biogeneze miRNA 1. Dlouhý primární transkript -> pri-miRNA (stovky nt-desítky kbp) 2. Sestřih - RNasa III Drosha + Pasha/DGCR8 -> pre-miRNA (70 nt) 3. Export (Exportin 5) 4. Maturace - Rnasa III Dicer -začleněníjednořetězcové 19-23 nt dlouhé miRNA do komplexu RISC (tvořen proteiny Argonaut) 5. Negativní regulace mRNA -inhibice translace nebo degradace (P-bodies) 3. Funkce miRNA Vazba komplexu na 3'UTR Degradace mRNA Inhibice translace - iniciační nebo elongační fáze http://www.nature.com/nro/multimedia/rnai/animation/index.html Srovnání regulace pomocí miRNA a transkripčních faktorů 1 Levels of miRNA are posttra nscript io na I ly regulated. JThis results in a miRNA attachment to the 3'UTR of a gene and inhibition of translation or mRNA degradation, or its detachment and activation of translation, thus, acting as a molecular switch that could result in an immediate early effect in response to an incoming signal. i I \ «WWW-" »»MNWMWi \ J On the other hand, transcriptional regulation requires: 1 DNA remodeling; 2 attachment or detachment of the transcription factor; ^inhibition or activation of RNA synthesis, before an effect on ^protein levels is observed, thus, resulting in a relatively late response to an incoming signal le Status Qto ď Therapeubc Targebng. Journal of Cardi Databáze a predikce miRNA miRBase (11/2013 ver. 20) www.mirbase.org Targets lllllll miRBase Počet miRNA 18/11/2008: 8 619 záznamů (700 lidských) 4/11/2010: 15 172 záznamů (1114 lidských) 22/11/2011: 18226 záznamů (1587 lidských) 19/11/2012: (2237 lidských) 12/11/2013: 24521 záznamů (2578 lidských) 4. Predikce cílových molekul Každá miRNA může regulovat až stovky různých molekul miRNA jsou krátké 3'UTR jsou dlouhé a nepříliš kvalitně osekvenované a a notované Dosud málo ověřených cílových molekul Vazebná místa nejsou dokonale komplementární Klíčová oblast specifity je krátká (6-8 nt) TargetScan PicTar miRBase Target Targets (^TargetScan TWu ^■■^ Prediction of microRNA targets I ' I I I I I I I I I I k miRBase 4. Metody analýzy miRNA ... aneb co brát v úvahu při výběru metody „Throughput" - počet vzorků, miRNA Cena (reagencie, materiál, instrumentace) Otevřená vs. uzavřená platforma (možnost vytvářet vlastní assays) Možnost standardizace Případné artefakty 5. Metody analýzy exprese miRNA Number of analytes vs number of samples Planar arrays i based multiplex arrays Number of samples per run Northern blot microarrays qPCR bead-based methods funkční analýzy a. Northern blot Časově náročná metoda pro malý počet vzorků a miRNA Number of analytes vs number of samples 3 Z Northern Bead based multiplex arrays Number of samples per run b. Arrays Umožňují detekci velkého množství miRNA u malého počtu vzorků Rozlišení zralých miRNA a prekurzorů Výsledky nutno validovat další metodou locked nucleic acids for miRNA detection Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes '/>"•'1........................................................ umber of analytes vs number of samples Number of samples per run c. qRT-PCR - SYBR Green „ „ miRCURY™ LNA microRNA PCR system Pomerne s„p1; SpeCifiCká Fitít-strand cDNAsynltieiiä metoda Slouží k 0, m ověření '-:...;.ľ:r*"™' ► výsledků sasrS získaných pomocí microarray Specifický SL"-"i"' design primerů „,.„„....... EXIQON c. qRT-PCR - TaqMan Chen eř al. 2005 (ABI) TaqMarr Probe Chemistry Number of analytes vs number of samples Planar arrays RT-PCR Bead based multiplex arrays Northern Number of samples per run d. Bead-based methods (klinické aplikace) as 100 distinct bead sets sS; Uniform polystyrene beads 5.6 microns diam Internal labeling with • 2 dyes • Each at 10 distinct levels FlexmiR Workflow Label total RNA Hybridize miRNA targets to Wash away Add SAPE Analyze samples on with biotin LNA-doped microspheres unbound sample reporter molecule Luminex analyzer X ^ LJL Funkční analýzy Slouží k ověření biologické funkce konkrétní miRNA Analýza cílové sekvence pomocí luciferázové aktivity Zvýšení nebo snížení exprese konkrétní miRNA Funkční analýzy Luciferazove Assay for m RNA specific miR Function reportéry A m No specific miR - Funkční analýzy Knockdown pomocí modifikovaných prób - inhibitorů ■ Over-exprese miRNA „„„' p™»1 .» ve formě prekurzoru nebo zralé miRNA — J mlszlpflntt-m1=raSlNA. Shrnutí miRNA mohou negativně regulovat až 30% genů interakcí s 3'UTR na m RNA Profil exprese miRNA se mění při celé řadě onemocnění - diagnostický či terapeutický potenciál Metoda analýzy exprese závisí na počtu detekovaných miRNA a počtu vzorků Vybrané výsledky z „high-throughput" metod je vhodné ověřit jiným přístupem Závěr ■ Metody analytické cytometrie lze využít ke studiu genové exprese ■ Bead-based metody detekce miRNA ■ Detekce RNA v živých buňkách pomocí nanočástic (detekce průtokovou cytometrií či mikroskopicky)