Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 4 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Data Analysis Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 color 4 color 5 color Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Mad Scientist Cartoon upraveno podle J.P.Robinson Data Analysis Analýza hlavních komponent nAnalýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) je v teorii signálu transformace sloužící k dekorelaci dat. Často se používá ke snížení dimenze dat s co nejmenší ztrátou informace. PCA je možno najít také jako Karhunen-Loèveho transformaci nebo Hotellingovu transformaci. http://cs.wikipedia.org/wiki/Anal%C3%BDza_hlavn%C3%ADch_komponent Kompenzace bdlogo 100% 0% Wavelength (nm) Spillover This results in spillover. Notice how in our PE detector, we are also getting signal from FITC and PE-Cy7. We can eliminate the contribution of other signals through compensation. bdlogo Spillover Decreases Sensitivity Without CD45 FITC, No Compensation CD19 PE With CD45 FITC, No Compensation Without compensation, using certain fluorochromes together can decreast the resolution of our data. Here we see data with and without FITC. Without FITC, we get good separation of the positive and negative peaks. With FITC and BEFORE compensation, you can see that the negative and positive peaks overlap. This is due to spillover. bdlogo FITC Spillover If we look at a tube that has only FITC in it, before compensation our sample looks positive for both FITC and PE. You can see from the emission spectra of FITC how it spillsover into the PE detector, causing this false double positive. bdlogo Correct Compensation When compensation is done correctly, the mean of the positive and negative match. bdlogo Factors that Effect Compensation •Reagent Lot-to-Lot Variation •Fluorochrome Stability •Sample-to-Sample Variation •Assay Staining Conditions • Many factors can effect compensation, including reagent lot-to-lot variation (especially in tandem dyes, which we will talk about in the next few slides), fluorochrome stability (degradation caused by light, temperature, and time), sample to sample variation (if you get a specimen that is much brighter than your usual samples), and assay staining conditions (fixative) nŘešení? Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_1.stream Cells were covalently labeled with a bifunctional compound, maleimido-mono-amide-DOTA (mDOTA). This compound can be loaded with a lanthanide(III) isotope ion, and reacts covalently with cellular thiol groups through the maleimide moiety. Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_2.stream Seven unique lanthanide isotopes were used to generate 128 combinations, enough to barcode each sample in a 96-well plate. The seven lanthanide isotopes, their masses and their locations on the 96-well plate are shown. Single Cell Mass Cytometry Single Cell Mass Cytometry [USEMAP] flow cytometry data sharing and analyzing over the web logo [USEMAP] http://www.cytobank.org/nolanlab/ FlowRepository Aplikace průtokové cytometrie ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN buněčný cyklus a ploidyta analýza zlomů DNA inkorporace BrDU exprese cyklinů analýza denaturace DNA ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU imunofenotypizace pomocí CD antigenů (detekce diferenciačních a nádorových markerů) detekce cytokinových receptorů CYTOGENETIKA analýza chromozómů STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ viabilita stanovení intracelulárního pH analýza organel a cytoskeletu stanovení membránového potenciálu oxidativní vzplanutí stanovení intracelulárního Ca2+ stanovení intracelulárních cytokinů Natural Killer ligace značených buněk analýza reportérových genů K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Biologické aplikace průtokové cytometrie nanalýza DNA nanalýza buněčných funkcí nfluorescenční proteiny K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co je důležité při přípravě vzorku a značení… nPostup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit – závisí na typu buněk a konkrétní analýze –suspenze jednotlivých buněk –vitální značení –fixace (etanol, formaldehyd) –permeabilizace (detergenty) –difúze –aktivní transport Analýza buněčného cyklu •jedna z nejstarších aplikací flow cytometrie, stanovení fáze buněčného cyklu podle množství DNA •průtoková cytometrie je vhodná metoda pro rychlou a přesnou determinaci buněčného cyklu •jednoduchým způsobem je DNA obarvena fluorescenční barvou specifickou pro DNA. •Propidium iodide 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - dramaticky zvyšují fluorescenci po vazbě na DNA. Je nutná permeabilizace cytoplasmatické membrány . •Hoechst 33342 •Vybrant® DyeCycle™ •DRAQ5 •Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - mohou být používány pro značení viabilních buněk. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA Analysis DNA content Count 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Analýza histogramu buněčného cyklu nnepoužívá se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu nje nutné používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází File analyzed: LNCaP/- Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 1DA0n_DSD Analysis type: Manual analysis Diploid: 100.00 % Dip G1: 79.55 % at 46.94 Dip G2: 0.15 % at 93.88 Dip S: 20.30 % G2/G1: 2.00 %CV: 4.90 Total S-Phase: 20.30 % Total B.A.D.: 3.32 % Debris: 11.36 % Aggregates: 0.06 % Modeled events: 3970 All cycle events: 3517 Cycle events per channel: 73 RCS: 1.038 Analýza histogramu buněčného cyklu R1 AND R2 FL-W vs. FL-A (BD) FL vs. AUX (Beckman Coulter) „doublets“ C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.904\High.jpg C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.877\high2.jpg C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.415\medium.jpg C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.454\medium2.jpg C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.126\Low.jpg C:\Users\ksoucek\AppData\Local\Temp\Rar$DRa0.282\Low2.jpg Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu File analyzed: SAMPLE2.FCS Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 2DA0n_DSD_ASD Analysis type: Automatic analysis Diploid: 57.22 % Dip G1: 70.35 % at 75.05 Dip G2: 5.60 % at 150.10 Dip S: 24.05 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.02 Aneuploid 1: 42.78 % An1 G1: 83.63 % at 100.15 An1 G2: 5.87 % at 200.30 An1 S: 10.50 % G2/G1: 2.00 %CV: 5.02 DI: 1.33 Total Aneuploid S-Phase: 10.50 % Total S-Phase: 18.25 % Total B.A.D.: 11.22 % Debris: 19.13 % Aggregates: 3.96 % Modeled events: 31253 All cycle events: 24037 Cycle events per channel: 190 RCS: 0.842 Aneuploidie je významný diagnostický marker 450px-Native_American_tobacco_flower Analýza ploidity u vyšších rostlin The image “http://florawww.eeb.uconn.edu/images/byspecies/ALSTROEMERIA_CARYOPHYLLACEA01.JPG” cannot be displayed, because it contains errors. http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Native_American_tobacco_flower.jpg Alstroemeria caryophyllacea Nicotiana tabacum 400px-Corntassel_7095 http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Corntassel_7095.jpg Zea mays endosperm 28 dní po opylení Analýza inkorporace BrdU K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie nbromodeoxyuridin se inkorporuje do DNA namísto tymidinu během S-fáze npo fixaci a částečné denaturaci DNA je možné BrdU detekovat pomocí specifické protilátky značené fluorochromem nv posledním kroku můžeme obarvit DNA n Analýza inkorporace BrdU K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza DNA a RNA nPyronin Y vs. Hoechst 33342 n- Pyronin interaguje s ds RNA a DNA ale jeho vazba na DNA je inhibována přítomností Hoechst 33342 nAcridine orange n- při interakci s RNA emituje červené světlo a při interakci s DNA zelené Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA Detekce mitotických buněk nHistone H3 je specificky fosforylován během mitózy (Ser10, Ser28, Thr11) ndvojité značení DNA vs. H3-P identifikuje populaci buněk v M-fázi http://www.cellsignal.com/products/images/3465_ific_jp_090213.jpg http://www.cellsignal.com/common/cellsignaling.gif Analýza buněčných funkcí nPrůtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou analýzu vitálních buněk Detekce viability njedna z nejjednodušších analýz nfunguje na principu: –detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – –detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM – nethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat nPomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci nLIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits n Detekce viability Přenos signálu pomocí Ca2+ •Cytosol (koncentrace - „klidová“ 100 nM vs. 1-10 mM aktivovaná) •[Ca2+]c aktivuje proteinkinázu C •interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Malviya, A. N. (1998) Cell 92: 17-23. •Jádro •[Ca2+]n interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ Přenos signálu pomocí Ca2+ K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •Mitochondrie •„mitochondriální retikulum“ •[Ca2+]c => [Ca2+]m <=> DYm => apoptóza Přenos signálu pomocí Ca2+ K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ionophor ionophor Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]i •standardizace barvení a kalibrace - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic ® -127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. http://www.cytekdev.com K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kalibrace (pro jednu vlnovou délku) Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) Fmin = 1.25 x FMnCl2 - 0.25 x Fmax K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie - pro ziska Fmax - přidání ionoforu = A23187-Br, ionomycin - Fmin - 2mM MgCl2, Fluo-3 vytváří fluorescenční komplex i s Mg2+ (ale 5x méně intenzinví fluo nez s Ca2+ Detekce intracelulárního pH nFluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH nSNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH nNutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce počtu buněčného dělení nNespecifické fluorescenční označení proteinů pomocí carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE nebo CFSE) n Detekce počtu buněčného dělení Detekce reaktivních kyslíkových skupin nReaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů –posttranslační modifikace proteinů –regulace transkripce –regulace struktury chromatinu –přenos signálu –funkce imunitního systému –fyzický a metabolický stres –neurodegenerace, stárnutí n n O2• – O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme-bound © Simon Melov Potential sites of intervention Oxidative Stress Neurodegeneration Cancer Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Immune Function DNA Damage Oncogenesis Mitochondrial Damage Energy Crisis Cell Death © Simon Melov Hydroethidine HE EB N CH2CH3 NH2 H2N H Br- N CH2CH3 NH2 H2N + O2- Phagocytic Vacuole SOD H2O2 NADPH NADP O2 NADPH Oxidase OH- O2- DCF HE O2- H2O2 DCF Example: Neutrophil Oxidative Burst © J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OH HO Cl O COOH H Cl O HO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O 2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence .1 1000 100 10 1 0 20 40 60 PMA-stimulated PMN Control 80 © J. P. Robinson, Purdue University - DCFH-DA - DHR-123 - HE Oxidative Burst K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie The Nobel Prize in Chemistry 2008 n"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Nobel Prize® medal - registered trademark of the Nobel Foundation http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescenční proteiny nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. –je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. –modré světlo excituje green fluorescent protein. –Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. –luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. –modré světlo excituje green fluorescent protein. – – Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny n Osamu Shimomura –1961 objevil GFP a aequorin n http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm nScience. 1994 Feb 11;263(5148): nGreen fluorescent protein as a marker for gene expression. nChalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. n nDepartment of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. n n A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny nDouglas Prasher nMartin Chalfie mice_400x300 [USEMAP] Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm in vivo molekulární vizualizace Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: 1336-1340, 2000. KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System Fluorescenční proteiny nSergey A. Lukyanov –Objevil „GFP-like“ proteiny u nesvětélkujících korálů n Roger Tsien n~ 2002 – mutace FP = barevné spektrum nhttp://www.tsienlab.ucsd.edu/ http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20PLATE%20-%20Beach.jpg The image “http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20Rendered%20GFP%20-%20640.jpg” cannot be displayed, because it contains errors. Roger Y. Tsien Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Nature Methods - 5, 283 (2008) Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 S, G2, M- SCFSkp2 Fucci shRNA for TTL Ventura, Meissner, Dillon, McManus, Sharp, Van Parijs, Jaenisch and Jacks . PNAS 2004 “Cre-lox regulated conditional RNA interference from transgene”. shRNA elements: TTL-1 tgcatcaaataagcatgagattccaagagatctcatgcttatttgatgcttttttcacgtagtttattcgtactctaaggttctctagagtacgaataa actacgaaaaaagagct TTL-2 tggcaacgtttggattgcaattccaagagattgcaatccaaacgttgccttttttcaccgttgcaaacctaacgttaaggttctctaacgttaggtttg caacggaaaaaagagct Pz-HPV-7 cells - shRNA for TTL (Lentivirus infection) in vivo molekulární vizualizace biarsenical–tetracysteine system nNefluorescenční, membránově permeabilní biarsénová značka vytváří kovalentní fluorescenční komplex s jakýmkoliv intracelulárním proteinem obsahujícím krátký tetracysteinový motiv (CCPGCC) biarsenical–tetracysteine system Click azide/alkyne reaction http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/applications/cell_tissue_analysis/da ta_diagram/750_wide.Par.94243.Image.-1.-1.1.gif Invitrogen Aplikace Click-IT (Invitrogen) Multiplex imaging with Click-iT® RNA assays. NIH3T3 cells were incubated with 1 mM EU, formaldehyde-fixed, and permeabilized with Triton® X-100. EU incorporated into newly synthesized RNA (red) in some cells was detectied using the Click-iT® RNA Alexa Fluor® 594 Imaging Kit. Tubulin (green) was detected with anti-tubulin mouse IgG9 and visualized with Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG. Nuclei (blue) were stained with Hoechst 33342. Aplikace Click-IT (Invitrogen) analýza syntézy DNA (proliferace) 02ClickiTAnim01 Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine 02ClickiTAnim01 • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine 02ClickiTAnim01 BrdU03 BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br 02ClickiTAnim01 Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing 02ClickiTAnim01 Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing Br Br Br Br BrdU 02ClickiTAnim01missing Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EduBlack01 02ClickiTAnim01 EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT™ EdU 02ClickiTAnim01 Click-iT™ EdU FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 FluorBefore01 FluorAfter01 02ClickiTAnim01 Click-iT™ Edu FluorAfter01 FluorAfter01 FluorAfter01 FluorAfter01 • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Shrnutí přednášky nanalýza DNA nanalýza buněčných funkcí nfluorescenční proteiny n Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. 1. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 2. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 3. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 4.vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 5.co je to click-IT. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie