Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Laboratoř patofyziologie volných radikálů BFÚ AV ČR •Imunologie - Stanovení statusu imunitního systému • •Vrozené nebo získané imunodeficience • - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie • - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů •Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie • •Hematologie • •Diagnóza maligních onemocnění •Stanovení funkčních vlastností trombocytů Metodologické přístupy •Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytů (obecně krevních elementů v krvi nebo kostní dřeni) •Funkční testy -Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů -Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita) Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Imunofenotypizace •Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytů na základě exprese vybraných povrchových antigenů případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí intracelulárních antigenů CD2 CD4 Imunofenotypizace •Na základě rozptylu světla jsou buněčné populace rozděleny podle velikosti a granularity •Specifické monoklonální protilátky označené různými fluorochromy proti kombinaci vybraných antigenů umožňující rozdělení populací 1065_35 CD Antigeny • Systém označení povrchových molekul leukocytů • Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře • Dodnes definovány CD1 až CD350 • Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) • • Zdroj informací o CD nomeklatuře – učebnice imunologie, www např. PROW www.Ncbi.nlm.nih.gov/prow/ Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Kmenová buňka CD34 Časný pro-B lymf. CD34; CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38 Pozdní pro-B lymf. CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38; CD20; CD40 Velký pre-B lymf. CD45R; IL-7R; CD19; CD38; CD20; CD25 (rec. IL-2); CD40 Malý pre-B lymf. CD45R; CD19; CD38; CD20; CD40 Exprese vybraných povrchových znaků během vývoje B lymfocytů Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Nezralý B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD40 Zralý naivní B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Lymfoblast CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Paměťová buňka CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Plasmatická buňka CD135; CD38 figure 7-12 modified Nezralé CD3-(jen v cytoplasmě)4-8- dvakrát-negativní tymocyty pTa:b+ CD3+ 4+ 8+ velké dvakrát-pozitivní tymocyty g:d+ CD3+ 4- 8- a:b+ CD3+ 4+ 8+ malé klidové dvakrát-pozitivní tymocyty a:b+CD3+4+8- a:b+CD3+4-8+ malé jedenkrát-pozitivní tymocyty Export do periferie Vývoj T-lymfocytů Možné rozdělení jednotlivých subpopulací lymfocytů podle exprese vybraných povrchových antigenů Vybrané povrchové molekuly charakteristické pro různé typy leukocytů (“markery” jednotlivých typů) Buněčný typ Charakteristické povrchové molekuly Leukocyty (všechny) CD53, CD45, CD43 Hematopoetické prekurz. CD34, CD117, CD137 T lymfocyty CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD27, CD28, CD96, TCR T pomocné l. (Th) CD4 T cytotoxické l. (Tc) CD8 B lymfocyty CD19, CD20, CD22, CD37, CD39, CD40, CD79, BCR Pre-B lymfocyty CD9, CD10, CD138 Plasmatické buňky CD28, CD138 NK lymfocyty CD2, CD11b, CD16b, CD56, CD57, Cd94, CD158 Neutrofilní granulocyty CD11b, CD15, CD87 Monocyty CD14, CD33, CD64, CD87, CD89 Dendritické buňky CD83, Cd86, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209 E Ab1 Možnosti exprese antigenu v rámci dané popuplace A Ab1 B Ab1 C Ab1 D Ab1 F Ab1 There are several patterns of antigen expression. The interpretation of them is important for describing the meaning of co-expression. In A, Ab2 is uniformly expressed, while Ab1 is co-expressed by Ab2 cells in a heterogeneous manner. In B, Ab1 is uniformly expressed, while Ab2 is co-expressed by Ab1 cells in a heterogeneous manner. In C, a population of Ab1^+ Ab2^- cells is found, but it is the Ab2^+ cells that exhibit heterogeneous expression to produce the Ab1^+ Ab2^+ population. Thus, Ab1 cells are not positive for Ab2. In D, there are two distinct populations: Ab2^+Ab1^- and Ab2^+Ab1^+ , while in E, the two populations are Ab1^+Ab2^- and Ab1^+Ab^+. In F, correct interpretation can be difficult because this pattern is exhibited by highly autofluorescent cells that are Ab1^-Ab2^- or dead cells that non specifically bind Ab1 and Ab2. If it is either of these two situations, all combinations of antibodies used will show this pattern on the same percentage of cells. If this pattern represents a true subpopulation of cells it will be unique to the one antibody combination. Izotypová kontrola Monoklonální protilátky stejné třídy proti irelevatním antigenům CD45 Všechny leukocyty, lymfocyty silněji CD14 Monocyty CD3 Všechny T lymfocyty CD19 Všechny B lymfocyty CD4 Pomocný T lymfocyt CD8 Cytotoxický T lymfocyt CD56 NK lymfocyt Příklad výběru detekovaných antigenů pro určení zastoupení a počtu jednotlivých subpopulací lymfocytů v periferní krvi Příklad kombinace jednotlivých protilátek při použití dvojího značení Zkumav-ka FITC PE Stanovení 1 CD45 CD14 %lymfocytů v ohraničení (gate) pro lymfocyty 2 Iz.kont. Iz. kont. Nespecifická vazba – autofluorescence 3 CD3 CD4 Pomocné (Th) lymfocyty 4 CD3 CD8 Cytotoxické (Tc) lymfocyty 5 CD3 CD19 Celkové B- lymfocyty 6 CD3 CD56 NK buňky Neutrofily Monocyty Lymfocyty Forward Light Scatter 0 200 400 600 800 1000 SS a FS leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Kontrola “čistoty” lymfocytárního ohraničení na základě FS a SS CD45 FITC (log) R1=monocyty (CD14+) R2=lymphocyty (CD45>monocyty) R3=granulocyty (CD45