C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\C0021375-Lab_mouse,_SEM-SPL.jpg Myš jako model vývojové biologie Vendula Pospíchalová Modelový organismus v experimentální biologii •intenzívně zkoumaný organismus – cílem je poznání jeho samého, ale především popis obecnějších jevů a vztahů platících i pro jiné organismy •Vlastnosti: - krátký životní cyklus – - větší počet potomstva • - ekonomická nenáročnost • - relativní jednoduchost a nevýjimečnost ve zkoumané oblasti • - dostatečné množství dostupných informací (znalost vývoje, sekvence genomu,…) • http://www.google.cz/url?sa=i&source=images&cd=&docid=AcyitJgsw975iM&tbnid=vKifBL1zJA-70M:&ved=0CAU QjBwwAA&url=http%3A%2F%2Fwww.embl.de%2Faboutus%2Fcommunication_outreach%2Fexplore%2F201107_modelorg s%2Fimage01_spotlight.jpg&ei=172DUbWCCOKJ7AaHioCIDw&psig=AFQjCNH67glvDRtEf3zwSJr5WiHZBaRt-Q&ust=136 7674711174942 Upraveno z http://www.embl.de http://moje-zajmy.blogerka.cz/obrazky/moje-zajmy.blogerka.cz/prirodopis/slon2.jpg Nejčastější modelové organismy v experimentální biologii http://www.allthingsstemcell.com/wp-content/uploads/2009/07/ModelOrganism-copy.png http://www.asmusa.org/division/m/foto/UrLambda2.jpg http://www.universityofcalifornia.edu/everyday/agriculture/images/e_coli.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d9/S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg/240p x-S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg Phage (Bactiophage Lambda) Bacterium (Escherichia coli) Yeast (Saccharomyces cerevisiae) http://www.seymourfish.com/wp-content/uploads/2012/03/Zebra-Danio.jpg Zebrafish (Dario rerio) Zásady práce s pokusnými zvířaty „3R“ •1959 - The Principles of Humane Experimental Technique • - W.M.S. Russell and R.L. Burch •Refinement – zjemnění = dobrá obživa, adekvátní zacházení školenými pracovníky, prostor pro život, pokusy v anestézii •Reduction – zmenšení = počtu zvířat, délky pokusu, pokus se nesmí na stejném zvířeti znovu opakovat •Replacement – nahrazení = pokus se provádí na zvířeti jen tehdy, neznáme-li žádnou alternativu, jinak dáme přednost alternativě (tkáňové kultuře atd.) •pokud to lze, mají se použít organismy z co nejnižších pater fylogenetického stromu – - raději bakterie než myši, raději myši než primáti Legislativa upravující podmínky práce s modelovými organismy •Nutno dodržovat evropské a české normy • 1) zákon České národní rady na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 ve znění platných úprav, vydaného ve sbírce zákonů č. 149/2004 • 2) vyhláška Ministerstva zemědělství o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat č. 207/2004 Sb. •§ 3 a) zvířetem se rozumí každý živý obratlovec, kromě člověka, včetně volně žijícího zvířecího jedince a jeho samostatné života schopné formy, nikoliv však plod nebo embryo •§ 17 (3) Manipulovat s pokusným zvířetem a provádět zákroky vymezené projektem pokusů mohou pouze osoby, které získaly osvědčení o odborné způsobilosti [§ 18 odst. 5 písm. c)]. http://www.autoservismagazin.cz/wp-content/uploads/legislativa.jpg C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520327-Gene_therapy_research_on_mice-SPL.jpg Schéma přednášky http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ab/House_mouse.jpg Myš domácí (laboratorní) (Mus musculus) •Výhody tohoto modelového organismu: •Savec – z tradičních modelů nejblíže k člověku •Malá velikost – snadná manipulace a relativně levný chov •Nejčastěji používaný model v biomedicíně •Velká vědecká komunita – spousta zdrojů (mutantní kmeny, know how) •Genetika – osekvenovaný genom (28 000 genů, 99% má ortology u lidí, divergence 75 milionů let), inbrední linie •Široká paleta experimentálních přístupů – včetně možnosti homologní rekombinace v embryonálních kmenových buňkách a transgeneze •Množství derivovaných buněčných linií pro in vitro kultivace •Nevýhody •Relativně málo – např. nepřístupné embryo, (příliš?) složitý organismus I. Myš jako laboratorní model C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\C0075502-Lab_Mouse-SPL.jpg Životní cyklus myši • Gestace – 19-21 dní • Odstav – 3-4 týdny • Pohlavní dospělost – 6-7 týdnů • Generační doba – 2-3 měsíce • Estrus – polyestrální, 4-5 dní • Počet mláďat ve vrhu 4-10 • Délka života – až 2 roky • Manipulace s laboratorní myší •Přenáší se uchopena za ocas •Pro fixaci myš uchopíme palcem a ukazovákem pevně za kůži za krkem a ocas fixujeme malíkem •Pro intraperitoneální injekci (i.p.) obrátíme zafixovanou myš bříškem vzhůru, hlavou dolů (pokles vnitřností) a druhou rukou aplikujeme injekci http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTFgThyY_lF32YwriXFYiDuOysxttbBTyLb5sNMEfBT5p0R8Yii2A http://www.theodora.com/rodent_laboratory/images/tail_restraint.jpg https://www.aalaslearninglibrary.org/fileupload_content/Course2451/scruff2.jpg C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Bryja lab\Prezentace\Moje prezentace\Výuka\Bi9903 Vyv Biol a fyziol ziv I\klice.jpg Manipulace s laboratorní myší Video – tradiční zacházení s myší Video – zacházení s myší pomocí jen jedné ruky Chov laboratorních myší •Relativně nenáročný – v klíckách- granule, voda, podestýlka, materiál na hnízdo •Max. 6 myšek v jedné klícce •Náklady cca 30Kč na klícku/týden •IVC – individually ventilated cages – brání rozšíření případné infekce • • • http://www.venomousreptiles.org/data/classifieds/images/24554.jpg http://2.imimg.com/data2/AU/AH/IMFCP-4195602/product-images-img87-250x250.jpg http://www.labotal.co.il/upload/categories/cage.jpg IVC Otevřená klícka •Otevřený (konvenční) – vstup i výstup zvířat, osob i materiálu je bez • bariéry, jen se zvýšenými hygienickými opatřeními • - možno vylepšit IVC stojany a flowboxy na přestýlání myší •Bariérový – prostor pro zvířata je oddělen od vnějšího prostředí a • vstup zvířat, osob i materiálu je možný jen přes bariéru • (sterilizace vody, potravy, podestýlky • zvýšená osobní hygiena ) –SPF – specified pathogen free – •pravidelné testy (~ 3 měsíce) na •dané pathogeny (> 40), •uvedeny v certifikátu ke zvířatům -FELASA – Federation of Laboratory • Animal Science Associations Chovy laboratorních myší http://www.lfp.cuni.cz/patofyziologie/materialy/zvirata/izolator.jpg •Izolátorový – prostor pro • zvířata je trvale oddělen • bariérou od vnějšího • prostředí a ošetřovatelů • - imunodeficientní, axenické • (germ-free) a gnotobiotické • myši (definovaná mikroflóra) • • • •Archivace myších kmenů – kryoprezervace – embrya a spermie • - rederivace, in vitro fertilizace (IVF) – pro „oživení“ kmene i pro • „ozdravení“ (očištění od patogenů) (ustanovení SPF linie, izolátory) • • Chovy laboratorních myší Značení laboratorních myší 1)Ušní známky 2)Značení uší nebo prstíků 3)Mikročipy Software pro práci s laboratorními zvířaty pyrat.png pyrat detail.png • Pro správu myší i komunikaci s ošetřujícím personálem • Každá myš unikátní číslo (i třeba jen virtuální) • Databáze informací o každém zvířeti – „iniciály“, rodokmen, historie, chovné záznamy, … • Možnost filtrování při vyhledávání • Nevýhoda – pouze v AJ Kmeny laboratorních myší •Inbrední kmen - produktem 20 a více páření bratr x sestra, kdy všichni jedinci jsou odvozeni od jediného páru a jsou homozygotní ve všech alelách = geneticky identičtí jedinci •Vytvořeny v 1. pol.20.stol. a udržovány (Jackson Lab,NIH,Charles River) •C57BL/6J – „black 6“ - nejpoužívanější kmen, první osekvenovaný myší genom, permisivní pro většinu mutací, resistentní vůči nádorům, •možnost indukce obezity, DM II. typu i aterosklerózy dietou •129 – pro „gene-targeting“ – vysoká frekvence produkce zárodečné linie, mnoho odvozených linií embryonálních kmenových buněk •BALB/c – produkce monoklonálních protilátek pomocí hybridomů •C3H/HeJ – používaný v mnoha odvětvích – výzkum infekčních chorob,.. •FVB/NJ - pro transgenezi – velký samčí pronukleus a velká mláďata • • • • C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G2850146-Transgenic_mouse,_conceptual_artwork-SPL.jpg II. „Experimental toolbox“ v běžně užívané metody a zdroje • - přirozené a indukované mutace - embryonální kmenové buňky (ESCs) - „knock-out a knock-in“ myši - transgenní myši - modelový příklad – β-katenin - zdroje – archivy, databáze,… Metody funkční genomiky Funkční genomika - cílem je určení funkce všech genů v genomu Dva hlavní přístupy: A)přímá genetika (forward genetics) 1.fenotyp (znak) 2.gen - vychází z NÁHODNÉ mutage- neze celého genomu B) reverzní genetika (reverse genetics) 1.sekvence DNA 2.Fenotyp - základem jsou CÍLENÉ mutace http://jaxmice.jax.org/images/jaxmicedb/featuredImage/002019_lg.jpg Přímá genetika – přirozené a indukované mutace 1.Kolekce přirozeně se vyskytujících mutací – vzácný vznik, většinou ve velkých chovech –př. Nahá („nude“, nu/nu, athymická, Foxn1nu) myš •1966: vznik (Glasgow, UK), 1968: myši jsou imunodeficientní (nemají thymus), 1996: myši jsou mutantní v transkripčním faktoru Foxn1 2.Indukované mutace – a) chemická mutageneze – nejčastěji N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) – př. ApcMin myš – model vzniku kolorektálního – karcinomu, mutace v genu Apc –b) Genetické mutace – „gene-traps“ – – inaktivace genu (SA-splice acceptor), – exprese reportéru a DNA značka pro – rychlé určení genu SLC7A5 S2.jpg http://www.cmhd.ca/genetrap/assets/gene_trap.gif C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\mouseDNA.jpg Reverzní genetika „Gene targeting“ – vnášení cílených mutací „Gene targeting“ – homologní rekombinace cílového vektoru v embryonálních kmenových buňkách Jak získat z pozměněných embryonálních kmenových buněk myš A)Klasický (celkový, totální) knock-out – gen zcela vyřazen (dříve často nahrazen selekčním markerem), může vést ke smrti jedince již v prenatálním věku, což neumožňuje studium funkce v dospělém organismu B)Knock-in – do genového lokusu vložena mutace (záměna, inserce, delece,…) nebo např. reportérový gen či Cre rekombináza C)Podmíněný (kondicionální) knock-out – Cre/loxP systém – místně a časově specifická inaktivace genu Genový „knock-out, knock-in“ C) FLOXED GENE B) GENE KNOCK-IN A) GENE KNOCK-OUT Cre/loxP systém • Cre_loxP system loxP recombination Babinet C., Cohen-Tannoudji M.; 2001 loxP loxP site (locus of X-ing over) Nové metody „gene targetingu“ 1.Zinc finger nuclease (ZNF) technologie (© Sigma Aldrich) ZFN-Mediated Targeted Genome Editing Image • založeno na endogenních mechanismech opravy poškozené DNA • funkční v mnoha buněčných liniích a organismech • knock-outové organismy připravené za měsíc či dva 2.TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) (© Cellectis) http://www.vicgene.com/Custom%20Services/Custom2.gif http://www.cellectis-bioresearch.com/sites/default/files/TALEN-structure.png Method of the Year 2011: Gene-editing nucleases http://www.youtube.com/watch?v=zDkUFzZoQAs •CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced pallindromic repeats/CRISPR‑associated) • • • • • • • • • •bakteriální „imunitní systém“ – proti bakteriofágům a plasmidům exogenního původu •odhalen u 40 % bakterií a u 90 % archeí, horizontální transfer komponent systému •ZNF a TALEN náročné na výrobu - zapotřebí proteinů, navíc nezcela specifické •Dnes možno připravit mutantní myš pomocí CRISPR/Cas pouze pronukleární injekcí – plasmidu s Cas9 a sgRNA – trvá 1 měsíc 3.CRISPR/Cas9 technologie (© Sigma Aldrich) C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Bryja lab\Prezentace\Moje prezentace\Výuka\Bi9903 Vyv Biol a fyziol ziv I\crispr-genomic-target-site.jpg •Transgenní organismy - jejich genom obsahuje cizorodou DNA, jejíž místo integrace je NÁHODNÉ •Příprava (pokusná myš) - injekce „nahé“ DNA (konstruktu) do zygoty –náhodná integrace do genomu (často ve formě „ tandem arrays“) –implantace do „náhradních“ (foster) matek (200-300 embryí) –genotypování potomstva na přítomnost transgenu (1-10%) –křížení „founderů“, analýza fenotypu Transgenní zvířata Transgeneze vs. Gene targeting Transgenní myši •Smysl pokusu - co se stane, dojde-li k expresi genu v jiné než původní tkáni –nadprodukce proteinu (v původní či jiné tkáni) –produkce změněného proteinu –studium regulačních oblastí genu nebo značení buněk in vivo (exprese „reportérových“ proteinů – GFP, β-galaktozidáza) •Výhody - rychlost a jednoduchost provedení •Nevýhody - náhodná integrace konstruktu – narušení genů v místě integrace –poziční efekt regulačních oblastí genů v místě integrace na expresi transgenu (umlčování transgenu, ovlivnění exprese trangenu atd.) –integrace více kopií konstruktu (efekt „genové dóze“) •Řešení - nutnost analýzy více „founders“ –použití DNA sekvencí eliminujících poziční efekt – (inzulátory, Matrix Associated Regions; MAR) –použití velkých částí chromozomů (Bacterial •Artificial Chromosome; BAC recombineering) Full-size image (54 K) Jaká je role proteinu β-kateninu? C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520289-Vivisection-SPL.jpg B-cat dual function edit 2 β-katenin je multifunkční protein B-cat dual function edit 2 a)Mezibuněčné spoje (Ozawa et al., 1989) b)Signalizace Wnt/β-katenin (Wieschaus et al., 1984) http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/sites/default/files/armadillo-01.jpg http://www.cs.stedwards.edu/chem/Chemistry/CHEM43/CHEM43/Projects04/CATENINS/CATENIN7.jpg http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_02/ch02f31.jpg Armadillo – ortolog beta- kateninu v Drosophile Segmenty v embryu Drosophily Adobe Systems • Savci – 19 členů rodiny Wnt, 10 Fzd • Všechna Metazoa mají komponenty signální dráhy Wnt Ø • Geny aktivované dráhou Wnt/β-katenin: c-Myc, Cyclin D1, Twist, Axin2, Lgr5, ... • Signalizace Wnt/β-katenin řídí buněčnou proliferaci a diferenciaci během embryo- nálního vývoje a obnovu tkání z kmenových buněk v dospělosti • Nefyziologická aktivace vede k vývojovým defektům a ke vzniku nádorů Upraveno z Reya, T. and Clevers, H., 2006 Signální dráha Wnt/β-katenin cadherins Klasický knock-out β-kateninu •Ctnnb1 – velký gen (27 kBp) , kóduje protein β-katenin (781 aa) • •Haegal et al., 1995 – delece – exonu 2-15 – •Ctnnb1-/- - gastrulační defekty, • nevytváři A-P osu (E6) ani • mezoderm (E7) – • embryonálně letální fenotyp • - nemá defekty v mezibuněč- • ných spojích -kompenzuje • γ-katenin (Huelsken et al.,) Podmíněný knock-out β-kateninu •„Loss of function“ (LOF) alela („exon 3-6“, „exon 2-6“) –Podmíněná inaktivace genu v určité tkáni – po Cre rekombinaci •posun čtecího rámce – nevzniká protein (= nulová alela) – => nefunkční kanonická signalizace Wnt • •„Gain of function“ (GOF) alela („exon 3“) –Po Cre rekombinaci delece exonu 3, ale fúze exonu 2 a 4 ve správném čtecím rámci – vzniká zkrácený protein bez N-koncové části s degradačním motivem (S45, T41, S37, S33) = stabilní – => kanonická signalizace Wnt trvale zapnuta – Podmíněná aktivace β-kateninu http://atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/WNTSignPathFig3.gif Cre rekombinázy („deleter strains“) •Transgenní nebo „knock-in“ kmeny •Exprese dána promoterem – vybíráme silné a tkáňově specifické •Otestování aktivity pomocí reportérové myši – využití lokusu ROSA26, který je exprimován v průběhu embryogenese a i v dospělosti ve všech buněčných typech • A) ROSA26-LacZ - beta-galaktozidáza (lacZ) tkáň exprimující tento enzym + X-gal (substrát) -> modrý nerozpustný produkt Fig. 12. Exprese Troy Cre odpovídá expresi Troy (in situ hybridizace) B) ROSA26–EYFP - Reportérová myš pro značení a izolaci živých (=nefixovaných) buněk pro další kultivace a experimenty Cre recombináza fúzovaná s estrogenovým receptorem (CreERT2) je regulována tamoxifenem • Tamoxifen: syntetický analog estrogenu, jeho metabolit 4-0HT (4-hydroxytamoxifen) se váže na modifikovaný estrogenový receptor (ERT2) • CreERT2 – místně i časově specifická regulace rekombinace DNA Experimenty odhalující funkci β-kateninu Rozlišení duální funkce β-kateninu http://atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/WNTSignPathFig3.gif Valenta T. et al., 2011 Jak získat myš s cílenou mutací? • LoxP myš 1.Jax nebo jiná laboratoř (www.jaxmice.org) – A) Hledání v literatuře – B) Specializované databáze (www.informatics.jax.org) 2.KOMP, EUCOMM – (www.komp.org, www.eucomm.org) 3.Vytvořit svou vlastní myš (sám či na objednávku - ZNF, TALEN, CRISPR) •Cre myš 1.Jax nebo jiná laboratoř – A) hledání v literatuře – B) specializované – databáze 2.Udělat si svou myš 3. 3. 3. 3. 3. http://4.bp.blogspot.com/-mP7HyylhzzU/Tq41w8zqZlI/AAAAAAAAAC0/37mCFtAyjH0/s400/mutant_mouse_lead.jp g The web services of the International Knockout Mouse (IKMC) have been transferred to the International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC). Cíl IKMC – připravit (kondiciovaný) knock-out pro každý myší gen Updated 2013-05-06 Pomoci tohoto přístupu zjistit funkci každého genu - nutno systematicky studovat fenotyp myší - tzv. myší kliniky (jedna budována i u Prahy) - www.mousephenotype.org - IMPC The IMPC Pipeline Testy prováděné v myších klinikách https://www.mousephenotype.org/impress C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520399-Laboratory_mouse,_conceptual_artwork-SPL.jpg Shrnutí •Myš je nejpoužívanější model pro – biomedicínský výzkum •Chov konvenční vs. bariérový chov –IVC, SPF, izolátorový chov •Výborný genetický model – –inbrední kmeny, možnost manipulace genomu –– gene targeting vs. transgeneze •Klasický vs. kondicionální knock-out (knock-in) –Cre/loxP systém, ZNF, TALEN, CRISPR •Cre linie – test na reportérových myších –ROSA26-LacZ, ROSA26-EYFP •Databáze – www.jaxmice.org, www.komp.org, www.eucomm.org –www.informatics.jax.org, www.creline.org, www.mousephenotype.org • • • C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520348-Laboratory_mouse-SPL.jpg Děkuji za pozornost!