Speciální seminář z biologie
nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
FN Brno, PřF a LF MU Brno
MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.
MOÚ Brno, LF a PřF Brno
2013
Seminář 2
Dva pohledy na vývoj
nádorů, dva přístupy ve
výzkumu nádorů, ...
Šest získaných vlastností maligního
nádoru (Robert A. Weinberg 2000)
Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras
Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB
Poškození apoptózy produkce IGF
Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy
Posílení angiogeneze produkce VEGF
Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu
získaná schopnost příklad
Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech
nutných změn.
Z Úvodní přednášky kurzu Molekulární biologie nádoru:
Tři vlastnosti vystihující maligní nádor
(Richard Klausner 2002)
• Nemoc genomové nestability
(výjimky: leukémie, některé lymfomy, Ewingův
sarkom)
• Nemoc změněného buněčného chování
• Nemoc změněného tkáňového chování
Z Úvodní přednášky kurzu Molekulární biologie nádoru:
Dva odlišné pohledy na vývoj
nádorů: organicismus a
redukcionismus
• Redukcionisté – SMT („somatic mutation theory“) – soustředí se
na rozplétání genetických a molekulárních souvislostí
kancerogeneze; vysvětlují nádory poukazováním na mutace a
genetické příčiny, expresi poškozených genů a tím také na
buněčnou úroveň (Robert Weinberg); („ biological mainstreem“)
• Organicisté – TOFT („tissue organization field theory“) zkoumají
vývoj nádorů na úrovni tkání; vidí příčinu nádorů v
narušení struktury tkání, vycházejí spíše z vývojové biologie (Ana
Soto, Carlos Sonnenschein; Mina Bissell)
• Hybridní teorie…
Dva odlišné pohledy na vývoj
nádorů: organicismus a
redukcionismus
• Redukcionisté – SMT („somatic mutation theory“) – soustředí se
na rozplétání genetických a molekulárních souvislostí
kancerogeneze; vysvětlují nádory poukazováním na mutace a
genetické příčiny, expresi poškozených genů a tím také na
buněčnou úroveň (Robert Weinberg); (mainstreem - hlavní proud)
„The hallmarks of cancer“
(Hanahan D. and Weinberg R.A. 2000, Cell 100: 57-70)
Hallmarks
(1) Produkce vlastních proliferačních signálů
(2) Necitlivost k signálům zastavujícím b.c.
(3) Odolnost k buněčné smrti
(4) Neomezený replikační potenciál
(5) Indukce angiogenese
(6) Aktivace invasivity a metastázování
Enabling hallmarks
(7) Genetická nestabilita a mutace (3)
(1)
(5)
(2)
(6)
(4)
Hallmarks of Cancer: The Next Generation
(Hanahan D. and Weinberg R.A. 2011, Cell 144: 646-674)
Hallmarks
(1) Produkce vlastních proliferačních signálů
(2) Necitlivost k signálům zastavujícím b.c.
(3) Odolnost k buněčné smrti
(4) Neomezený replikační potenciál
(5) Indukce angiogenese
(6) Aktivace invasivity a metastázování
Enabling hallmarks
• Genetická nestabilita a mutace (7)
• Přítomnost zánětu podporující nádor (8)
Emerging hallmarks
• Přeprogramování energetického metabolismu (9)
• Schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem (10)
Tumor microenvironment (11?)
(8) Přítomnost zánětu podporující
nádor
• Téměř všechny nádory obsahují buňky imunitního systému,
odpovídající chronickému zánětu.
• Zánět může přispívat vývoji nádoru tím, že zajišťuje přísun
bioaktivních molekul do nádorového mikroprostředí a tím: zvyšovat
přežití a proliferaci, tlumit buněčnou smrt, stimulovat angiogenezi,
přestavbu ECM, stimulovat EMT.
• Buňky zánětu produkují látky (např. molekuly reaktivního kyslíku a
další), které jsou mutagenní a stimulují genetickou nestabilitu a tím
zrychlují celý proces kancerogeneze.
• Centrální molekulou ovlivňující všechny fáze zánětlivého procesu je
transkripční faktor NF-κB.
(9) Přeprogramování energetického
metabolismu
• Normální buňky v aerobních podmínkách metabolizují glukózu
glykolýzou na pyruvát a pak na CO2 oxidativní fosforylací v
mitochondriích; v anaerobních podmínkách probíhá glykolýza.
• Nádorové buňky i v aerobních podmínkách přeprogramují svůj
metabolismus a upřednostňují glykolýzu, stav, který se označuje
jako „aerobní glykolýza“ (Warburgův efekt). To je méně efektivní
(asi 18x) způsob získávání energie a je kompenzován zvýšenou
expresí transportérů glukózy (GLUT1) a importem glukózy do buněk.
• Tento stav může být dále prohlubován hypoxií, která stimuluje expresi
transportérů glukózy a také enzymy glykolytické dráhy.
• Zvýšená glykolýza vede k produkci glykolytických intermediátů – substrátů
biosyntézy nukleosidů a aminokyselin.
• Warburgův efekt pozorovatelný i v dalších rychle se dělících, např.
embryonálních buňkách. Možná obecněji spojeno s rychle proliferujícími
buňkami.
• Praktické využití: FDG-PET – pozitronová emisní tomografie využívající 18F-
deoxyglukózu.
• Otto Heinrich Warburg vyslovil
hypotézu (1924), že aerobní glykolýza
je typická pro nádorové buňky a že je
důsledkem poškození mitochondrií.
Považoval nádory za typ
„mitochondriální dysfunkce“
• Nobelova cena 1931 za práci o
respiračních enzymech (plus další dvě
nominace!).
Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even
Warburg Did Not Anticipate
(Ward P.S. and Thompson C.B. 2012, Cancer Cell 21: 297-308)
• Způsob metabolismu nádorových buněk není pasivní odpovědí na
poškození mitochondrií, ale je výsledkem přeprogramování, které je
řízeno onkogeny a které podporuje anabolický růst.
• Metabolity samy mohou být onkogenní - tím, že ovlivňují buněčné
signalizace a blokují buněčnou diferenciaci.
• Většina neproliferujících,
diferencovaných buněk je při
produkci ATP závislá na
efektivitě oxidativní
fosforylace. Metabolizují
glukózu na pyruvát a ten v
mitochondriích oxidují přes
Krebsův cyklus na CO2.
• Bez příslušné signalizace
růstovými faktory nedokáží
získávat další živiny. Aby získaly
nezbytnou energii, podstupují
autofagii a katabolizují tuky a
aminokyseliny.
• Maximalizují zisk ATP.
Ward P.S. and Thompson C.B. 2011, Cancer Cell 21: 297-308
Buněčný metabolismus: quiescentní
vs. proliferující buňky
• Na rozdíl od prokaryot a jednobuněčných eukaryot, živočišné buňky nejsou
autonomní v absorpci živin. Kompetují o limitované množství růstových
faktorů, které absorpci řídí.
• Po stimulaci růstovými faktory
buňky zvyšují absorpci živin,
především glukózy a glutaminu.
• To umožňuje uspokojit
požadavky rostoucích,
proliferujících buněk na
anabolické pochody: syntézu
tuků, proteinů, nukleotidů
(biomasy).
• Přebytek uhlíku je sekretován
ve formě laktátu.
• Hlavní metou není maximalizace
zisku ATP, ale syntéza biomasy.
Ward P.S. and Thompson C.B. 2011, Cancer Cell 21: 297-308
Buněčný metabolismus: quiescentní
vs. proliferující buňky
• Právě snížený důraz na oxidativní fosforylaci pravděpodobně vedl k mylnému
názoru, že proliferující (a nádorové) buňky nevyužívají mitochondrie.
• Součástí přepnutí - proliferující vs. klidový
stav - je přeprogramování mitochondrií.
Metabolismus je přímou odpovědí na
signalizaci růstovými faktory
• Podle tradičního (demand – požadavek, poptávka) modelu je změna
metabolismu sekundární odpovědí na signalizaci růstovými faktory: RF
stimulují proliferaci, tím se navyšuje poptávka po ATP, snižuje se podíl
ATP:ADP a to v důsledku vytvoří alosterický efekt.
• Podle alternativního (supply-based) modelu růstové faktory přímo,
primárně přeprogramují jak absorpci živin, tak jejich metabolismus.
Úloha některých onkogenů při
přeprogramování metabolismu
PI3K/Akt (následující hned za
RTK) zvyšují absorpci glukózy
prostřednictvím transportéru
GLUT1 a stimulují glykolýzu.
Akt stimuluje syntézu acetyl-CoA
nutného k syntéze lipidů.
mTORC1 stimuluje syntézu
proteinů a mitochondriální
metabolismus.
Myc zvyšuje absorpci glutaminu a
jeho další metabolismus.
Myc podporuje mitochondriální
biogenezi.
Myc podporuje syntézu
aminokyselin a nukleotidů – na
transkripční úrovni i stimulací
mitochondrií.
Úloha nádorových supresorů při
přeprogramování metabolismu: p53
• p53 snižuje import glukózy represí transkripce transportérů
GLUT1 a GLUT4.
• p53 stimuluje mitochondriální respiraci prostřednictvím SCO2.
• a mnoho dalších…*
⇒ p53 je antagonistou
Warburgova efektu
• p53 je nezbytný pro
adaptaci na stres
prostředím
Vousden KH, Ryan KM. 2009
Bayley JP, Devilee P 2012 *
Přeprogramování metabolismu a
nádory
• V přepnutí mitochondrií hraje roli alternativní sestřih pyruvát
kinázy: isoforma M2 (PKM2) podporuje anabolické, syntetické
nastavení mitochondrií. V nádorech často upřednostňována
exprese PKM2 před PKM1.
• Amplifikace některých genů souvisejících s metabolismem u
některých nádorů: např. gen pro hexokinázu II amplifikován v
nádorech jater; gen pro fosfoglycerát dehydrogenázu
amplifikován u nádoru prsu a melanomů; a další.
• Při přeprogramování metabolismu důležitá účast izocitrát
dehydrogenázy (IDH). U nádorů docela časté mutace IDH1 a
IDH2 (např. gliomy a glioblastomy).
Přeprogramování mitochondrií
1. Přeprogramování energetického metabolismu
• navýšená glykolýza, tj.Warburgův efekt
• zvýšená spotřeba glutaminu jako zdroje energie: přeměna
glutaminu na laktát za účasti malát dehydrogenázy produkuje
NADPH, který je nezbytný k syntéze mastných kyselin
2. Zvýšená rezistence k apoptóze
3. Zvýšená produkce reaktivních kyslíkových radikálů
(10) Schopnost vyhnout se destrukci
imunitním systémem
• Podle dlouhodobě obecně přijímané představy by imunitní systém
(IS) měl rozpoznat a eliminovat většinu nádorových a prenádorových
buněk. O tom svědčí (a) skutečnost, že u lidí s
poškozeným IS se často vyskytují některé typy nádorů; (b)
experimenty na myších s poškozeným IS: např. nádory z takových
myší jen obtížně tvoří nádory u imunokompetentních myší, apod.
⇒ To znamená, že nádorové buňky nějak unikají dohledu IS…
• Nicméně epidemiologická data zatím neúplná, nejasná a ne zcela
jednoznačná. Proto je (10) zatím „jen“ vznikající, nově uvažovaný
(emerging) znak nádorů.
• Uvidí se dále…
(11) Nádorové mikroprostředí
Nádor je komplexní tkáň! V nádorové tkáni se vyskytují nejenom
transformované nádorové buňky (a), ale také normální
„nepozměněné“ buňky, které „spolupracují“ při vývoji nádoru (b).
Z Úvodní přednášky kurzu Molekulární biologie nádoru:
(11) Nádorové mikroprostředí
Buněčné typy, které jsou součástí nádorů a významně ovlivňují
jejich biologii:
• nádorové buňky a nádorové kmenové buňky (nádor iniciující b.)
• endoteliální buňky
• pericyty
• buňky imunitního systému, které jsou součástí zánětu
(makrofágy, neutrofily, T a B lymfocyty, žírné buňky, myeloidní
progenitory, ..)
• fibroblasty asociované s nádory
• kmenové a progenitorové buňky z bezprostředního okolí nádoru,
které nejsou přímou součástí nádoru
• …
(11) Nádorové mikroprostředí
(11) Nádorové mikroprostředí
Hallmarks of Cancer: The Next Generation
(Hanahan D. and Weinberg R.A. 2011, Cell 144: 646-674)
• t.č. ředitel ISREC (Swiss Institute for
Experimental Cancer Research), Lausanne,
Switzerland
• úloha angiogeneze a mikroprostředí ve
vývoji a progresi nádorů, s ohledem na
možné využití při cílení terapie
prof. Douglas Hanahan
„The hallmarks of cancer“
(Hanahan D. and Weinberg R.A. 2000, Cell 100: 57-70)
Accessories to the crime: Functions of
cells recruited to the tumor
microenviroment
(Hanahan D. and Coussens L.M. 2012, Cancer Cell 21:
309-322)
„…Nádorové buňky nevyvolávají nemoc samy, ale
svádějí a korumpují ostatní buňky ve svém okolí, aby
se postavily mimo zákon buněčné společnosti…“
„… Different stromal cell types
1. angiogenní vaskulární buňky (AVCs) a pericyty
2. infiltrující buňky imunitního systému (IICs)
3. fibroblasty související s nádorem (CAFs)
demonstrably contribute to the core and emergent hallmarks of
cancer, namely, sustaining proliferative signaling, evading growth
suppressors, resisting cell death, enabling replicative immortality,
inducing angiogenesis, activating invasion and metastasis,
reprogramming energy metabolism, and evading immune
destruction. Stromal cell types are significantly influencing most
of the hallmark capabilities, highlighting the realization that
malignant cancer cells, despite their mutational entitlement, do
not act alone in elaborating the disease…“
Accessories to the crime: Functions of cells
recruited to the tumor microenviroment
(Hanahan D. and Coussens L.M. 2012, Cancer Cell 21: 309-322)
Hallmarks of Cancer: The Next Generation
(Hanahan D. and Weinberg R.A. 2011, Cell 144: 646-674)
Hallmarks
(1) Produkce vlastních proliferačních signálů
(2) Necitlivost k signálům zastavujícím b.c.
(3) Odolnost k buněčné smrti
(4) Neomezený replikační potenciál
(5) Indukce angiogenese
(6) Aktivace invasivity a metastázování
Enabling hallmarks
• Genetická nestabilita a mutace (7)
• Přítomnost zánětu podporující nádor (8)
Emerging hallmarks
• Přeprogramování energetického metabolismu (9)
• Schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem (10)
Tumor microenvironment (11?)
hybridsměremkTOFT?
Východiska redukcionistů
• Dominantní pohled biologie posledních 50 let: vývoj = rozkrytí
genetického programu, kde vliv prostředí téměř nehraje roli.
⇐ Vývoj laboratorních zvířat ve stabilních laboratorních
podmínkách dával tomuto genocentrickému pohledu výrazně za
pravdu!
⇐ Molekulární biologie byla nositelkou pokroku, přinesla nové
pohledy, hluboké vhledy, ohromné pochopení biologických
procesů.
⇐ Historie objevů týkajících se nádorů
⇒ vývojová genetika
⇒ fenotyp = přímé/přesné zobrazení genotypu
Dva odlišné pohledy na vývoj
nádorů: organicismus a
redukcionismus
• Organicisté – TOFT („tissue organization field theory“) zkoumají
vývoj nádorů na úrovni tkání; vidí příčinu nádorů v
narušení struktury tkání, vycházejí spíše z vývojové biologie (Ana
Soto, Carlos Sonnenschein; Mina Bissell)
Některá východiska organicistů a
TOFT
Vývojová plasticita lidských plodů, vliv prostředí na vývoj plodu:
• neuroendokrinní cesta: nervový systém monitoruje prostředí a
přenáší signály na endokrinní systém;
• epigenetická cesta: látky z prostředí mění metylační vzorec genů
a tím jejich transkripční úroveň, kompetenci;
• přímá modulace genové exprese, především působením hormonů.
⇒ ekologická vývojová biologie (eco-devo) – např. hypotezující, že
expozice xenoestrogenům může souviset se zvyšující se incidencí
leiomysarkomů dělohy, nádorů varlat, nádorů prsu
• Historický náhled 19. století: podstatou nádorů je změněná
organizace tkání; asociace mezi embryonálním vývojem a
karcinogenezí (formulace TOFT: 1999).
SMT vs. TOFT
Je „normálním“ stavem buněk stav quiescence (SMT) nebo
proliferace (TOFT)?
Příčina a vysvětlení nádorů:
• SMT: příčinou jsou mutace, vysvětlením nádorového fenotypu
jsou změny buněčné proliferace;
• TOFT: příčinou i vysvětlením nádorového fenotypu je
změněná/porušená organizace tkání.
Mutace v zárodečné linii:
• SMT: Jak takové mutace mění proliferaci?
• TOFT: Jak tyto geny vyvolávají změny v histogenezi a
organogenezi?
→ příklad: APC a β-katenin, CDH1,…
SMT vs. TOFT: experimentálně
SMT:
• „enhanced proliferation of cell on dish“ – dvourozměrné in vitro
modely, práce s buněčnými liniemi…
• v nekonečně mnoha variantách, uspořádáních, …
• přinášející různou míru vhledů, nových pohledů, hlubšího
pochopení, většího nepochopení, ještě většího zmatku, …
~ mainstreem
SMT vs. TOFT: experimentálně
Neoplastický fenotyp je potenciálně reverzibilní prostřednictvím
interakcí buňka-buňka/ tkáň-tkáň, což bylo i prokázáno
experimentálně:
• Transplantace raného embrya do ektopických míst (ledvina,
peritoneální dutina) vede k vývoji nádorů – teratokarcinomů.
• Naopak umístění teratokarcinomových buněk do raného emrya
(blastocysty) vede k vytvoření normální tkáně/orgánu.
• Buněčná jádra z řady nádorových buněk po přenosu do
enukleovaných oocytů vedla k normálnímu pre- i po-implantačnímu
vývoji.
• Modifikace některých složek ECM vedly k normalizaci nádorového
fenotypu.
⇒ Nádorový fenotyp je adaptivní, reverzibilní, vznikající, objevující
se (emergentní) na úrovni organizace tkání.
⇒ Epigenetická kontrola?
SMT vs. TOFT: experimentálně
„Theory-neutral experimental strategy“: vliv mutagenů na vznik a
vývoj nádoru prsu (J Cell Sci 2004):
• Působení mutagenů na stromální složku tkáně nebo na
parenchymální složku tkáně:
→ K neoplasii vedla pouze kombinace ovlivněného stroma s
neovlivněným parenchymem, nikoliv naopak.
⇒ Cílem karcenogeneze je spíše stroma než parenchym!!?
Organicisté – TOFT („tissue organization field theory“) - zkoumají
vývoj nádorů na úrovni tkání; vidí příčinu nádorů v narušení struktury
tkání, vycházejí spíše z vývojové biologie (Ana Soto, Carlos
Sonnenschein; Mina Bissell)
Redukcionisté – SMT („somatic mutation
theory“) – soustředí se na rozplétání
genetických a molekulárních souvislostí
kancerogeneze; vysvětlují nádory
poukazováním na mutace a genetické příčiny,
expresi poškozených genů a tím také na
buněčnou úroveň (Robert Weinberg);
Organicisté – TOFT („tissue organization field theory“) - zkoumají
vývoj nádorů na úrovni tkání; vidí příčinu nádorů v narušení struktury
tkání, vycházejí spíše z vývojové biologie (Ana Soto, Carlos
Sonnenschein; Mina Bissell)
Redukcionisté – SMT („somatic mutation
theory“) – soustředí se na rozplétání
genetických a molekulárních souvislostí
kancerogeneze; vysvětlují nádory
poukazováním na mutace a genetické příčiny,
expresi poškozených genů a tím také na
buněčnou úroveň (Robert Weinberg);
Mina Bissell
THINKING
OUTSIDE
THE CELL
„…For decades, the
national scientific
establishment ignored
Mina Bissell.
Now her insights could
revolutionize
how cancer is understood
and treated…“
Mina Bissell – východiska:
mnoho lidí má okultní nádory
• Prekancerózní léze i maligní nádory jsou pravděpodobně mnohem
častější než se obvykle uvádí, než se domníváme.
• 1935 – Arnold Rich rutinně vyšetřil biopsie náhodně odebrané z
prostaty při pitvě mužů, kteří zemřeli ze zcela jiných příčin. Ve
42 z 292 (14%!!) vzorcích detekoval malé karcinomy.
• Recentně, při pečlivější a cílenější analýze detekovány nádory
prostaty u 34% čtyřicetiletých mužů!!
• U 39% čtyřicetiletých žen (zemřelých z jiných příčin)
detekovány nádory prsu.
• Podobná pozorování u plic, slinivky a dalších tkání.
• Frekvence záchytů tak vysoká u štítné žlázy, že přítomnost lézí
je zde považována za „normální“ nález.
⇒⇒⇒⇒Proč nemáme nádory častěji??
Mina Bissell – některé experimenty:
Virus Roussova sarkomu (RSV) obsahující aktivní onkogen:
• infikuje kuřecí buňky v kultuře na Petriho miskách
• injikován do křídel kuřat, vyvolává sarkomy
• po injikování do kuřecích embryí, nevede k vývoji žádného
nádoru; je-li takové embryo destruováno a buňky kultivovány v
kultuře, mají transformovaný charakter
• jak embryo stárlo a blížilo se k vylíhnutí, některé tkáně jevily
známky aberace/transformace
⇒ Kontext je klíčový, mikroprostředí – tedy to, co je mimo buňku je
rozhodující, i když buňky nesou aktivní onkogen!!
Mina Bissell – některé experimenty:
Buňky mléčné žlázy:
• po umístění na ploché dno Petriho misky ztrácejí polaritu,
schopnost produkovat mléko – „zapomenou“ formu i funkci,
kterou měly uvnitř mnohobuněčného těla
• po přemístění na materiál, který simuluje 3-D prostředí reálné
tkáně, se buňky reorganizují a získávají typický vzhled,
strukturu, funkci
• po odstranění matrix kolem buněk mají buňky tendenci zahájit
apoptózu
⇒ Když buňky a ECM adekvátně vzájemně komunikují, každá buňka
ví, kam v systému patří a co má dělat
⇒ takto je malignita držena pod kontrolou!
Mina Bissell – některé experimenty:
Platí to i naopak? Nesprávná signalizace z mikroprostředí
narušuje homeostázi a indukuje buněčnou transformaci??
• během stárnutí se mění struktura stroma (stroma: fibroblasty,
vaskulatura, buňky imunitního systému, ECM)
• korelace mezi fibrotickým stroma a nádory jednoznačně
prokázána např. u jater
• prokázána korelace mezi zvyšující se stromální denzitou a
pravděpodobností vývoje nádoru prsu
⇒ Fibroblasty nejsou pouhými diváky procesu kancerogeneze, často
jsou přímo v centru dění, aktivně se účastní a přímo organizují
(orchestrate) transformační proces.
Mina Bissell – některé závěry:
• Změny genů nádorových buněk jsou důležité, ale samy o sobě
nevysvětlují kancerogenezi (ne všechno)! Bez pochopení úlohy
mikroprostředí, struktury tkáně/orgánu tento proces
nepochopíme!!
• Při hledání nové protinádorové terapie mají „běžné“ 2-D tkáňové
kultury jen omezenou vypovídací hodnotu.
• Má smysl vyvíjet protinádorovou terapii, která cílí nikoli přímo na
nádorové buňky, ale právě na mikroprostředí - stroma,
fibroblasty…
K takovým terapeutikům patří např. Endostatin, Bevacizumab
(Avastin), Anastrazol, Bortezomib…
Jak moc záleží na tom, zda SMT
nebo TOFT?
V nádorové biologii:
• Jak budou postaveny experimenty?
• Jak budou interpretovány výsledky?
• Jak důkladně budeme znát kancerogenezi, její skutečné příčiny
(na jaké úrovni komplexity nádory vznikají?), a také tu
nejobecnější biologii…?
V praxi:
• Diagnostika: relevance vyšetření konkrétních genů, proteinů?
• Jak se bude vyvíjet nová terapie?
Děkujeme za pozornost!