C3181
Biochemie I
02b-Bílkoviny – základní metody studia
FRVŠ 1647/2012
10/9/2013
1
Petr Zbořil

Obsah
•Přehled obecných metod.
•Významné metody studia – sekvenace.
•Syntéza peptidů.
10/9/2013
Petr Zbořil
2

Metody studia bílkovin
•
•Studium
ostruktury – molekulární vlastnosti
ofunkce – (katalytické aj. vlastnosti)
o
•Podle potřeby a účelu
oisolace do potřebné čistoty
ostudium in situ
•
•Isolace – metody více či méně komplikované podle účelu
–čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event. farmakologii,
–hrubé isolace pro průmysl apod
•
•Isolační postupy – separační metody
•
•

Obecné kroky při isolaci bílkovin
•Izolace – přehled metod
o-desintegrace materiálu
o-preparativní centrifugace
o-srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti
o- membránové separace
o- chromatografie
o- (preparativní elektromigrační metody – elektroforéza)
o- krystalisace
•
•Analytické postupy – včetně metod separačních
oelektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku,
ospektrální metody
oAbsorpční
odisperzní
ochiroptické metody
oNMR
orentgenostrukturní analýza,
oMS – moderní metoda umožňující i štěpení řetězce
odalší speciální metody
o
•

Určení primární struktury
•Analýza aminokyselinového složení.
oBílkovina se hydrolyzuje totálně (silně kyselé či zásadité prostředí, zatavená ampule, autokláv)
oSměs aminokyselin se analyzuje standartními metodami
oiontoměničovou chromatografií (analytické provedení)
onověji hydrofobní chromatografie nebo kapilární zonová elektroforéza.
•Kvantitativní analýza
oDerivatizace činidlem poskytujícím barevný či fluoreskijící
oTéměř univerzální – ninhydrinová reakce – modrofialové zbarvení se všemi aminokyselinami s
výjimkou Pro (a Hypro), kdy vzniká žluté zbarvení.
oDalší způsoby derivatizace (dansylace, fluorescamin aj.)
•
•




Ninhydrinová reakce
•
•
•
•
•
•
•
•
•Schéma ninhydrinové reakce obecně, λ = 570 nm
•
•
•

Ninhydrinová reakce
•
•
•
•
•
•
•
•Ninhydrinová reakce s prolinem, λ = 440 nm
•

Iontoměničová chromatografie aminokyselin
•
•
•
•
•
•
•Eluční profil aminokyselin
–Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení

Určení pořadí aminokyselin - sekvenace
•Sangerova metoda
oN-koncová AK označena dinitrofluorbenzenem
oPoté kompletní hydrolýza řetězce
•
•
•
•
•
•
•Určení sekvence insulinu

Určení pořadí aminokyselin - sekvenace
•Edmanova metoda
oN-koncová AK označena fenylisotiokyanátem
oPoté mírná hydrolýza N-koncové AK, zbytek řetězce lze opětovně analyzovat (ca 30 kroků)
oCyklický proces – automatický sekvenátor
•
•
•
•
•
•
•

Určení pořadí aminokyselin - sekvenace
•
•
•
•
•
•
•
•Schéma sekvenátoru
oJednotlivé kroky oddělené promýváním
•

Určení pořadí aminokyselin - sekvenace
•
•Další speciální operace
oDenaturace
oSeparace řetězců
oRedukce –COOH
•Jiná specifická štěpení
oEnzymatická
oChemická (bromkyan)
•
•
•
•
•

Syntéza polypeptidů
•
•Význam
–Příprava velkých množství přirozených bílkovin (inzulin, HGH aj.)
–Příprava modifikovaných a umělých bílkovin
•Možnosti – chemická či enzymová syntéza – výhody a nevýhody
•Chemická syntéza
–Aktivované reaktanty
–Kondensační činidla
–Nežádoucí reakce – ochrana skupin – blokace
–Problém odstranění meziproduktů
•Enzymová syntéza
–Molekulárně biologické postupy
•

Syntéza peptidú
•Reaktanty
oBlokující skupina
oKondensační činidlo

Sled reakčních kroků
Merrifieldovy syntézy