IEF 1
Izoelektrická
fokusace
K. Šlais
9/24/2013 IEF 2/799/24/2013 IEF 2/79
Izoelektrická fokusace - IEF
 elektromigrační separační analytická metoda využívající existence
izoelektrického stavu amfolytů, kdy efektivní náboj je nulový.
 pH = pI
 Analyty - proteiny
 Separace - DpI < 0.01
 Fokusace – zakoncentrování
 Charakterizace - pI
9/24/2013 IEF 3/799/24/2013 IEF 3/79
Protein jako amfolyt
9/24/2013 IEF 4/799/24/2013 IEF 4/79
Simul 5
9/24/2013 IEF 5/799/24/2013 IEF 5/79
Druhy IEF
 Gelová IEF
– S nosnými amfolyty
 S imobilizovaným gradientem (IPG)
 Dvourozměrná elektroforéza 2D = IEF + SDS PAGE
 Kapilární IEF
 Preparativní IEF
 Free flow
 Komorová ( např. Rotofor)
9/24/2013 IEF 6/799/24/2013 IEF 6/73
Typický výsledek gelové IEF
IEF 2
9/24/2013 IEF 7/799/24/2013 IEF 7/73
Standardy pI - proteiny
nestabilní,
nečisté,
drahé,
málo barevné,
málo rozpustné při pI
9/24/2013 IEF 8/799/24/2013 IEF 8/73
Nízkomolekulární barevné pI markery
 Požadavky na pI markery
- Škála pI od ~ 2 do 11, po ~ 0.5 pI
- dobré amfolyty, -dz/dpH ~0.5 > 0.05, DpK ~2 < 4
- rozpustnost ve vodě při pH = pI, > 1 mg/ml
- různé barvy, lmax > 400 A1% > 100
- Čistota, > 99 % ,
 - Dostupnost, cena markeru
- Stabilita - hydrolýza, oxidace, fotodegradace, mikroorganismy
9/24/2013 IEF 9/799/24/2013 IEF 9/73
Aminomethylované nitrofenoly
9/24/2013 IEF 10/799/24/2013 IEF 10/73
Žluté pI markery
9/24/2013 IEF 11/799/24/2013 IEF 11/73
Příklad barevného
pI markeru
9/24/2013 IEF 12/799/24/2013 IEF 12/73
pK1 = 3.50
± 0.02
pK2 = 5.92
± 0.02
pI = 4.71
± 0.02
Spektrofotometrické určení pI
N N N N
Me
Me
HO2
C
IEF 3
9/24/2013 IEF 13/799/24/2013 IEF 13/73
Určení pI interpolací v gelové IEF
Gradient pH
Směs 30 jednoduchých pufrů
Biolyt 3 – 10
9/24/2013 IEF 14/799/24/2013 IEF 14/73
Dynamika fokusace v gelové IEF
9/24/2013 IEF 15/799/24/2013 IEF 15/73
Dynamika pH gradientu Biolyt 3-10
Lineární gradient
pH 4 - 10
Po ½ hod malé změny
pH gradientu
9/24/2013 IEF 16/799/24/2013 IEF 16
Dynamika fokusace v gelové IEF
9/24/2013 IEF 17/799/24/2013 IEF 17/73
Vývoj fluorescenčních pI markerů
Vis
fluorescence
9/24/2013 IEF 18/79
pI markers
10.1
9.3
8.4
7.5
6.4
5.3
3.9
Cytochrome C
Myoglobin
Albumin
β – amylase
2μl 4μl
Mass spectrometric characterization of low-molecular-mass
color pI markers and their use for direct determination of pI
value of proteins
Mazanec, K, Slais, K., Chmelik, J.
J. Mass Spectrom. 41 2006 1570-1577
0
50
100
%Int.
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380
Mass/Charge
1[c].17
2[c].17
3[c].11
4[c].11
36 mV 8.4 mV 7.6 mV 42 mV
45B_0002, 22A_0002, 03A_0001, Smeska2_0002
Kratos PCKompact SEQ V2.3.0
247.4
296.0
237.5
239.5
280.0
267.5 358.6295.4 345.6251.4 373.6230.9 333.7
266.0
264.0
277.5
317.9
357.5265.5
246.8
297.2278.0246.9
251.2
296.5
301.9
237.0
343.7
318.9 331.8232.9
358.0345.1
302.9
372.9360.2
376.0
346.3
327.9
306.9 333.0
313.6
Mass spectra of nitro-substituted pI markers
Pardubice 2005
yellow markers
IEF 4
9/24/2013 IEF 19/799/24/2013 IEF 19/73
2D Gel electrophoresis
SDS
PAGE
IEF
9/24/2013 IEF 20/7920
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Voltage[V]
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Time [h]
Current[µA]
Voltage practical
Voltage theoretical
Current practical
Credit:
Deng, X., Hahne, T., Schröder, S., Redweik, S., Nebija, D., Schmidt, H., Janssen, O., Lachmann,
B., Wätzig, H., (2012). The challenge to quantify proteins with charge trains due to isoforms or
conformers. Electrophoresis, 33(2), 263–9. doi:10.1002/elps.201100321
Záznam typické IEF na IPG stripu
9/24/2013 IEF 21/799/24/2013 IEF 21/73
Strips rehydrated 2 hours under Kerosene
run native 7 hours with Nitrogen
Amersham Multiphor.
Test of color pI markers - LM ladder
Hanspeter Schickle,
ETC Elektrophorese-Technik GmbH, Kirchentellinsfurt, Germany
Courtesy of Dr. Hanspeter Schickle,
9/24/2013 IEF 22/799/24/2013 IEF 22/73
in Clinical Proteomics. From Diagnosis to Therapy. J. Van Eyk and M.J. Dunn (Eds.),
Chapter 2, Protein Separation by Two-Dimensional Electrophoresis
Pamela M. Donoghue, Miroslava Stastna, Michael J. Dunn, p 13,
2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Immobiline Dry Strip (Amersham Biosciences) pH 3–10, 18 cm.
Apparatus: Protean IEF Cell (BioRad).
Sample: 10 ml of pI markers mixture diluted with 340ml of IEF buffer (8M urea, 2M thiourea, 4%
CHAPS, 1% DTT, 0.01% bromophenol blue, 1.5% (v/v) hydroxyethyl disulfide, 0.2% (v/v) IPG
buffer pH 3–10).
The acidic end is on the left and the basic end on the right side of the strip.
The pI values of individual pI markers are marked in the picture
IEF of mixture of chosen pI markers in the first dimension strip of 2D gel
electrophoresis
9/24/2013 IEF 23/799/24/2013 IEF 23/73
2D - typical result – silver staining
9/24/2013 IEF 24/799/24/2013 IEF 24/73
2D Gel electrophoresis - Software
IEF 5
9/24/2013 IEF 25/799/24/2013 IEF 25/73
Protein identification by 2D gel electrophoresis -MS
Use of coloured pI - markers to
determine the slope of the pH
gradient and the position where
to ‚cut‘ and remove the
individual Sephadex fractions in
order to fit to the corresponding
narrow pH range IPGs
Courtesy of Carsten Lück
Methods in Molecular Biology, vol. 424: Volume 1: Sample Preparation and PreFractionation,
Edited by: A. Posch ,
Chapter 22, Sample Prefractionation in Granulated Sephadex IEF Gels
Angelika Görg, Carsten Lück, and Walter Weiss, p 277,
Humana Press Inc., 2007, Totowa, NJ
IEF in Granulated Sephadex Gels
9/24/2013 IEF 27/799/24/2013 IEF 27/73
pI markers - LM ladder
Home made strip,
linear gradient pH 4-10,
11cm,
1 min 30V,
50 min 30V -> 3500V,
2 hours 3500V.
IEF in Sephadex gels and IPG strips
Hodný Z., Přidalová J.,
Institute of Experimental Medicine AV ČR, v.v.i., Prague
Courtesy of Z. Hodný
Courtesy of J. Přidalová
9/24/2013 IEF 28/79
Mikropreparativní sIEF v proužku netkané textilie
28
9/24/2013 IEF 29/79
sIEF nosných pufrů s barevnými pI markery
fokusovaná směs:
0,15 ml zásobního roztoku 12ti nosných pufrů v hydroxidu sodném
0,05 ml zásobního roztoku barevných pI markerů
0,15 ml ethylen glykolu; 0,05 ml butanolu; 0,1 ml vody29 9/24/2013 IEF 30/79
Animace průběhu separace
• separace probíhá většinou cca 12 hodin
– večer nadávkování vzorku a zapnutí zdroje
– ráno možno sbírat frakcionovaný vzorek
– pokud není možnost extrahovat frakce, zdroj udržuje nejvyšší
napětí do příchodu obsluhy
30
IEF 6
9/24/2013 IEF 31/79
Odběr frakcí
• dvě základní konfigurace pro odběr frakcí:
1. proužek při separaci v celku – frakce vybrány po IEF na základě
polohy markerů a vystřihnuty
2. proužek dopředu nařezaný na kousky definované délky a
kousky jsou před separací vyrovnány do fokusačního korýtka a
přilepeny roztokem sacharózy příp. jiné fixační látky
• při lepení možnost přidat i směs nosných pufrů a barevných
markerů „instantní proužek“  stačí přidat vodu a vzorek a
zapnout zdroj
31 9/24/2013 IEF 32/79
extrakce frakcí - promývání
32
9/24/2013 IEF 33/79
Frakcionace syrovátky
• optimalizace pro dosažení co nejvyšší čistoty caseinomacropeptidu
– separovaný vzorek – 1% (m/V) roztok surové syrovátky
– přidání spacerů – IMAC (imidazol-1-yl-octové kyseliny) a Tris
(tris(hydroxymethyl)aminometanu)
program ext. zdroje:
100 V – 200 V 4 hod.
200 V – 1000 V 4 hod.
1000 V – 3000 V 4 hod.
3000 V  do sběru frakcí
vzorek:
0,375 ml 1% (w/v) syrovátky;
0,05 ml zásobního roztoku;
barevných pI markerů;
0,1 ml ethylen glykolu;
0,05 ml butanolu;
0,025 ml 0,1 mol·l-1 IMAC;
0,1 ml of 0,1 mol·l-1 Tris;
extrakce: 6mm proužek do
100 µl vody
33 9/24/2013 IEF 34/79
HPLC analýza frakcí získaných z sIEF
Kolona Microbore Poroshell 300SB-C18 (5 μm částice, 1×75 mm) + C18 předkolonka, při 70 °C
Průtok 20 μl·min-1
Voda/ACN s 0.1% (v/v) TFA lineární gradient od 5 do 80 % (v/v) ACN (30 min)
dávkovaný objem: 4 µl
34
9/24/2013 IEF 35/79
Obsah jednotlivých proteinů ve frakcích
Výtěžek:
glykosylovaný CMP 44 % neglykosylovaný CMP 80 %
α-laktalbumin 77 % β-laktoglobulin 101 %
35 9/24/2013 IEF 36/79
Testování dalších typů netkaných textilií
• různé materiály ze vzorkovníku firmy Polytex s.r.o. (Malé
Svatoňovice)
• nejlepší materiál (Novolin, 100 g·m2) podobné charakteristiky jako
původní netkaná textilie ale vyšší pevnost v tahu a menší třepivost –
jednodušší manipulace a omezení odpadávání krátkých vláken
36
IEF 7
9/24/2013 IEF 37/7937
sIEF na PřF MU
• Diplomová práce
– Bc. Petr Švéda, školitel doc. RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.
– vytvoření prototypu společně se separační metodou
– následně převést metodu do výuky na ústavu analytické chemie PřF MU
9/24/2013 IEF 38/799/24/2013 IEF 38/73
Kapilární IEF
9/24/2013 IEF 39/799/24/2013 IEF 39/73
Kapilární IEF standardů
proteiny pI markery
9/24/2013 IEF 40/799/24/2013 IEF 40/73
CIEF mikroorganismů
Sample: E. coli, C. albicans, S. epidermidis, E. faecalis in
physiological saline solution, 4 x 108 cell ml-1.
9/24/2013 IEF 41/799/24/2013 IEF 41/73
CIEF virů s UV detekcí
9/24/2013 IEF 42/799/24/2013 IEF 42/73
Patogeny z různých zdrojů
IEF 8
Tapered capillary in cIEF
9/24/2013 IEF 44/79
Effect of treatment of 100 μm i.d. fused silica capillary with supercritical
water in semi-dynamic mode. Experimental conditions: 400 °C, 32 MPa, 20
replacements of supercritical water.
Supercritical water in preparation of
tapered fused silica capillaries
9/24/2013 IEF 45/79
Dependence the local internal diameter of etched fused silica
capillary on the capillary length.
The cutout of the segment used as the tapered capillary in cIEF
and the detection window are indicated.
9/24/2013 IEF 46/79
9/24/2013 IEF 47/79
Resolution of several Dickeya bacterium species with
similar isoelectric points by capillary isoelectric focusing
employing
cylindrical (left) and tapered (right) capillary.
Combination of Capillary Isoelectric Focusing in a Tapered Capillary with MALDI-TOF MS for
Rapid and Reliable Identification of Dickeya Species from Plant Samples
Horka, M; Salplachta, J; Karasek, P; Kubesova, A; Horky, J; Matouskova, H; Slais, K ; Roth, M
ANALYTICAL CHEMISTRY Volume: 85 Pages: 6806-6812 , JUL 16 2013
9/24/2013 IEF 48/7915. dubna 2013 IEF, 48/79
Preparative Liquid phase IEF
Total 2.5 ml sample
Ten 0.25 ml fractions
2 hours run time
Rotofor
MicroRotofor
pI = 5.3pI = 3.9
Preparativní
autofokusace
peptidů + pI markerů
Tomas, R; Yan, LS; Krenkova, J; Foret, F.
ELECTROPHORESIS, 28 (13): 2283-2290
2007
IEF 9
9/24/2013 IEF 49/7949
ZOOM® IEF Fractionator
(Invitrogen)
• komůrka pro fokusaci je oddělena
polyakrylamidovými disky s
definovaným pH
• proteiny musí procházet přes tyto
disky dokud nedorazí do
izoelektrického bodu
• objem každé části 650 µl
• vysoká reprodukovatelnost
• příprava vzorku: rozpustit,
denaturovat, alkylovat, bez zákalu
a částic
Use of pI-dye markers as online
trackers for the focusing
of peptides during
electrophoresis on the
OFFGEL fractionator device
(OGE). 22 hours runtime
Courtesy of M. Heller DKF,
University of Bern, Switzerland
P.E. Michel, F. Reymond, I. L.
Arnaud, J. Josser, H. H. Girault, J.
S. Rossier,
Electrophoresis 2003, 24, 3–11
Agilent 3100 OFFGEL Fractionator
pI-based fractionation of proteins and
peptides with liquid-phase recovery.
introduced May 30, 2006, Codeveloped
with DiagnoSwiss S.A.
OFF - GEL electrophoresis
Use of pI-dye markers as on-line trackers for the focusing of peptides
during electrophoresis on the OFFGEL fractionator device (OGE).
•pI-marker dyes were added at 10 ug (dark orange, pI 3.9; violet, pI 5.2; red, pI 6.2; bright
orange, pI 8.0) or 30 ug (yellow, pI 10.1), respectively.
•Peptide/dye solution was distributed into the 13 wells of the OGE.
•IPG strips pH 3-10 from BioRad re-hydrated in OGE buffer were used.
•Focusing was done by setting a maximal potential (1250 or 1500 V) and a current limit of 50 uA.
Courtesy of M. Heller, DKF, University of Bern, Switzerland
9/24/2013 IEF 52/7915. dubna 2010 IEF, 52/79
Parallel isoelectric focusing.
Charged proteins/peptides migrate through the dPC™ chip between the acidic and basic
sides until they encounter a gel plug whose pH is at or near their pI. The uncharged
protein/peptide will no longer migrate and become "trapped" in these plugs
dPC™ Chip Specifications
Fractionation Time 30 -45 minutes
pH Ranges* 4.2-6.2, 6.0-8.0, 7.2-9.2
Max. Resolution 0.05 pH
Number of plugs per chip 41
Throughput 1-6 samples/run
96 samples/8 hr
Loading Capacity 20-100 μg Typical Load
2.0 mg Maximum Load
G. Zilbersteinet al, Parallel isoelectric focusing
chip; Proteomics2004, 4, 2533–2540.
S. Buhskpan et al, Matrixes, Arrays, Systems
and Methods;
US PT 7,166,202, 2007.
9/24/2013 IEF 53/799/24/2013 IEF 53/73
Free-Flow Electrophoresis
The miniaturization of FFE implies several advantages especially considering sample volume and
separation speed. In contrast to the tens of milliliters of sample consumed by conventional large scale FFE
devices, microfluidic FFE systems require only tens of nanoliters up to hundreds of microliters of sample.
This is especially interesting in clinical analysis where often only low sample volumes are available.
Furthermore, instead of residence times of up to tens of minutes, microfluidic FFE (µ-FFE) devices
separate within several seconds.
9/24/2013 IEF 54/7924.9.2013 IEF 54/79
FFIEF of seven fluorescent IEF markers
Voltage = 150 V, current = 50 mA
Markers (pI 4, 5.1, 6.2, 7.2, 8.1, 9, and 10.3) are fully separated
within less than 2 s.
The sample flow rate was 0.4 mL/min (v = 2 mm/s).
The apparent kinks in the fluorescent tracer paths are caused by
merging multiple photographs.
Copyright American Chemical Society. © 2008
colorless fluorescent markers
Microfluidic high-resolution free-flow isoelectric focusing
Kohlheyer, D., Eijkel, J. C. T., Schlautmann, S., van den Berg, A., Schasfoort, R. B. M.,
Anal. Chem. 2007, 79, 8190–8198.
IEF 10
9/24/2013 IEF 55/79
WEBER, Gerhard; Margeritenweg 23 85551 Kirchheim (DE).
WO/2002/050524, 07.12.2001,
Preparative Free Flow Electrophoresis
FFE Service GmbH
Dr. Gerhard Weber
D-85551 Kirchheim
Germany
24.9.2013 9/24/2013 IEF 56/799/24/2013 IEF 56/73
Základní idea
 Fluidika – kontinuální rozšiřování plochého kanálu při
toku kapaliny od vstupu k výstupu při čemž je
generován rozbíhavý tok
a současně,
 IEF - malé příčné napětí na vstupu kanálu a
vysoké příčné napětí na výstupu kanálu
IEF v rozbíhavém toku (divergent flow IEF, DF IEF)
9/24/2013 IEF 57/799/24/2013 IEF 57/73
+ -
vysoká
nízká
k
Separované frakce
nosné amfolyty & analyty
anolyt katolyt
vysoká rychlost toku
malé napětí
krátká separační dráha
rychlá separace
Fluidika – rozbíhavý tok
IEF – řízení elektrického
proudu vodivostí kapaliny k
Jednoduché zařízení:
Membrány eliminovány
použitím porézního lože
Separační plocha a vstupy a
výstupy kapaliny tvořeny
netkanou textilií
Kontakty k elektrodám tvořeny
netkanou textilií
Tok generovaný hydrostaticky
IEF v rozbíhavém toku
vysoké napětí Účinná fokusace
9/24/2013 IEF 58/799/24/2013 IEF 58/73
Divergent flow IEF
The polypropylene nonwoven web 0.1 mm thick lies on white
polyvinylchloride flexible sheet
input strips dipped in Petri dishes containing:
above left – anolyte
above middle - solution of carriers and pI markers
above right – catholyte
middle left - carbon rod anode
middle right – carbon rod cathode
output strips - bottom - microplate
Streamlines of red pI markers from left pI
= 3.3, 4.7, 6.2, 7.6, 11.0
Flow due to hydrostatics and capillary elevation
Constant power load 1 W
No cooling
Šlais K. Electrophoresis 29 2008 2451-2457
9/24/2013 IEF 59/799/24/2013 IEF 59/73
Dynamics of divergent flow IEF
1 W constant power load
switched off at 11 hod 30 min
switched on at 11 hod 40 min
Flow inputs:
Anolyte: 0.05 M H3PO4 , 5.2 mS/cm,1 mL/h
Catholyte: 0.05 M NaOH, 11mS/cm, 1 mL/h
Carriers and pI markers: 0.75 mS/cm, 4 mL/h,
Holdup volume: 1 ml
Separation area: 71 cm2
Streamlines of red pI markers from left
pI = 3.3, 4.7, 6.2, 7.6, 11.0
Šlais K. Electrophoresis 29 2008 2451-2457
9/24/2013 IEF 60/799/24/2013 IEF 60/73
time stability
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12 14 16
time [hours]
position[pixels]
MO
pI 5.2
hemoglobin
cytochrom C
Kolísání linií 3.96 %, 3.94 %, 1.26 % a 1.88 %
Časová stabilita polohy linií IEF v rozbíhavém toku
Šťastná M., Šlais K., Electrophoresis, 2008, 29, 4503-4507
Linie od leva
oranžová - methyl oranž, levandulová - marker pI 5.2
hnědá – hemoglobin, 0.5 mg/ml, cihlová – cytochrom
C, 0.5 mg/ml, průtok 0.18 mL.min-1
IEF 11
9/24/2013 IEF 61/799/24/2013 IEF 61/73
Preparativní DF IEF piva
Mazanec K., Bobalova J., Slais K. Anal Bioanal Chem 2009, 393, 1769-1778
9/24/2013 IEF 62/79
DF IEF extraktů ječmene, sladu a piva
Kontinuálně dávkované pI markery:
oranžová – marker pI 2.5
fialová - marker pI 11
Vstup - Extrakt ječmene (neodsolený) + pufry + markery pI 2.5 a 11
průtok - 0.23 ml/ min,
vodivost - 1.0 mS/cm
Vstupní elektrody: 4 mA, 20 V
Výstupní elektrody: 6 mA, 800 V
1 kapka roztoku směsi pI markerů
Mazanec K., Bobalova J., Slais K.
Anal Bioanal Chem 2009, 393, 1769-1778
24.9.2013 62/79
9/24/2013 IEF 63/79
Kombinovaný sken IEF
gelu frakcí z DF IEF piva
Barevné pI markery skenované ihned po gel IEF
Proteiny skenované po vybarvení Commassie
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
3
pI
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
3
pI
11
MALDI-MS spektra 20ti DF
IEF frakcí proteinů ze
surového extraktu
ječmenného sladu.
Mazanec K., Bobalova J., Slais K.
Anal Bioanal Chem 2009, 393, 1769-1778
24.9.2013 63/79 9/24/2013 IEF 64/79
Preparative divergent flow IEF without carrier ampholytes
for separation of complex biological samples
DF IEF without carrier ampholytes with
yeast lysate sample and colored pI
markers.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
3.7
5.3
6.3
fractions
8.5
11.0
pIs
+ +
-
input
output
2.6
M S 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M
Separation of proteins in individual
yeast lysate DF IEF fractions by
polyacrylamide gel IEF.
M. Stastna, K. Slais, Electrophoresis,31, 2010,433-439
Desalting, preconcentration, preseparation
24.9.2013 64/79
9/24/2013 IEF 65/7965
Projekt FRVŠ 2012
Vypracování laboratorní úlohy na zařízení
pro izoelektrickou fokusaci v rozbíhavém
toku
• laboratorní úloha vyučována v rámci
předmětu C9320 Metody
biochemického výzkumu na PřF MU
• výuky se zúčastnilo 45 studentů
• projekt byl úspěšně obhájen před
komisí PřF MU 20. února 2013
• Použití chladicího boxu:
• Chlazení
• Odpařování
• Kontaminace
• Bezpečnost
9/24/2013 IEF 66/79
Electrolyte system for fast preparative focusing in wide pH
range based on bidirectional isotachophoresis (BITP)
,
L- leading anion of strong
acid
L+ - leading cation of strong
base,
C- - anionic counter ions,
C+ - cationic counter ions,
S- - anionic spacers,
S+ - cationic spacers,
T- - the fastest C- in LB in
anionic ITP part and
T+ - the fastest C+ in LA in
cationic ITP part.
IEF 12
9/24/2013 IEF 67/79
The composition of LB, LA and spacer electrolytes used
for simulation and in the experiment verification
catholyte pK
u x10-9
[m2V-1s-1] Mw
simulated
conc [mM]
conc [mgL-
1]
lysine 10.79 -26.4 146.19 7 1023.3
ACA 10.80 -28.8 131.20 10 1312.0
GABA 10.56 -29.0 103.10 10 1031.0
β-alanine 10.24 -30.8 89.10 10 891.0
glycine 9.78 -37.4 75.00 7 525.0
asparagine 9.02 -31.6 130.00 5 650.0
TAPS 8.30 -25.0 243.28 5 1216.4
TAPSO 7.70 -26.0 259.28 5 1296.4
NaOH 13.70 +51.9 40.00 60 2400.0
anolyte
glutamic acid 2.16, 4.32 +27.4, +27.6 147.13 5 735.7
β-alanine 3.55 +38.5 89.10 10 891.0
GABA 4.03 +28.8 103.10 10 1031.0
ACA 4.37 +29.8 131.20 10 1312.0
creatinine 4.83, 9.20 +37.0, 37.2 113.10 5 565.5
IDPN 5.29 +30.0 123.20 5 616.0
BisTris 6.40 +26.0 209.20 5 1046.0
HEMorf 6.80 +30.2 131.20 5 656.0
H2SO4 -82.9 98.00 25 2450.0
pK
u x10-9
[m2V-1s-1]
Mw
simulated
conc [mM]
conc [mgL-
1]
spacers
MOPS 7.20 -26.9 209.30 3 627.9
ACES 6.70 -31.3 182.20 3 546.6
MES 6.09 -28.0 213.25 3 639.8
picolinic acid 5.30 -29.6 123.11 3 369.3
ammonium acetate 4.76 -42.7,-39.4 77.09 3 231.3
glycolic acid 3.89 -42.4 118.10 3 354.3
phosphoric acid 2.16,7.21,12.67 34.6,61.4,71.5 192.12 3 576.4
imidazol 7.15 +52.0 68.10 3 204.3
EtMorf 7.70 +30.0 115.20 3 345.6
Tris 8.08 +29.5 121.10 3 363.3
morpholine 8.35 +41.3 87.00 3 261.0
ammediol 8.70 +33.5 105.10 3 315.3
aminomethylpropano
l 9.60 +30.0 89.14 3 267.4
etylaminoethanol 10.00 +30.0 89.14 3 267.4
piperidin 11.10 +39.8 85.10 3 255.3
9/24/2013 IEF 68/79
Computer simulation of dynamics in newly suggested
electrolyte system based on bidirectional ITP
9/24/2013 IEF 69/79
The animation of the experiment with colored
indicators subjected to BITP electrofocusing in newly
suggested electrolyte system and carried out on
nonwoven strip in V-shape trough during 30 min.
9/24/2013 IEF 70/79
0 min
12 min
30 min
cathodeanode
[cm]
loading area
XIXVIIIVIIIISPADNSI
The examples of representative images displaying
bidirectional ITP electrofocusing process in nonwoven
strip in V-shape trough with colored pH indicators taken
at 0, 12 and 30 minutes.
9/24/2013 IEF 71/79
simulation
experiment carried out
on linear nonwoven
strip in the V-shape
trough
The electrofocusing dynamics shown as dependence of
zone position on analysis time
9/24/2013 IEF 72/79
210 µL/min
LC
S
LA
cathode
anode
X
IX
VIII
VI
III
SPADNS
210 µL/min
LC
LA
S
cathode
anode
X
III
SPADNS
a b
The images of bidirectional ITP electrofocusing with
continuous flow in rectangular (a) and trapezoidal (b)
separation beds under the same experimental conditions
IEF 13
9/24/2013 IEF 73/79
210 µL/min cathode
anode
LC
S
LA
X
SPADNS
cytC
myo
a
b LC
LA
S
c
The example of bidirectional ITP separation and
electrofocusing in continuous flow of cytochrome C
(cytC) and myoglobin (myo)
9/24/2013 IEF 74/79
• FF- BITP v rozbíhavém kanále
možnost analýzy větších
částic (bakterie, buňky)
74
9/24/2013 IEF 75/79
Conclusions
The examined electrolyte system is suggested mainly
for preparative sample treatments with relatively low
(reasonable) number of eluted collected separated
fractions, typically between 10 to 20 fractions. Thus, the
total sum of spacers and counter ions does not need to
substantially exceed number of 20,
compounds needed for preparation of the running
solutions can be chosen from available cheap
components,
The buffers are typically low molecular organic
molecules which can contribute to compatibility with
downstream fraction processing.
9/24/2013 IEF 76/79
Running solutions can be optimized in advance and,
vice versa, observed experimental results can be
directly used for simulation and further solution
modification.
By nature of ITP, the described method of focusing by
bidirectional ITP with use of multiple counter ions is
directly applicable for the separation and enrichment
of ampholytes as well as both weak and strong
electrolytes.
When the suggested electrolyte system is used in
continuous flow devices the properties of leading
electrolytes (mainly their pH and conductivity) make
them simultaneously the electrode electrolytes. This
strongly simplifies both the device construction and the
operation.
9/24/2013 IEF 77/79
The main advantage of the use of the suggested
electrolyte system is seen in the possibility to use high
current densities at the initial stages of focusing without
danger of the local overheating. This fact strongly
reduces the time needed for analysis completion and it
applies to both modes of suggested bidirectional ITP
including linear mode and planar arrangement with
continuous flow.
Analytical and Bioanalytical Chemistry , 01792-2013
Electrolyte system for fast preparative focusing in wide pH range based on
bidirectional isotachophoresis.
Slais, Karel; Stastna, Miroslava
9/24/2013 IEF 78/7978/79