Trendy v analytické chemii
♦ Komplexní vzorky a jejich úprava
♦ Membránové techniky
Membránové předseparační techniky v analytické chemii. Elektricky indukovaný přenos iontů přes membrány a jeho využití v analýze komplexních vzorků
♦ Elektricky indukovaný přenos iontů přes membrány
Přednáška pro studenty MU v Brně, 24.10.2013 Pavel Kubáň (kuban@iach.cz)
Ustav analytické chemie Akademie věd CR, v.vi.
♦ Praktické aplikace
♦ Spojení se současnou analytickou instrumentací
♦ Shrnutí a výhledy
Úprava komplexních vzorků
Přečištění (Clean-up)
♦ Vliv matrice
♦ Vysoké konc. proteinů/ anorganických solí
♦ Zhoršený analytický výkon
♦ Poškození (otrava) analytického systému
Prekoncentrace
♦ Nízké koncentrace analytů
♦ Analyty nejsou detekovány
♦ Špatné kvantitativní výsledky
Lidská plazma 1:1, esenciální amino kyseliny
Klasické metody pro úpravu komplexních vzorků
Membránové techniky pro úpravu komplexních vzorků
LLE - extrakce v kapalné fází (extrakce kapalina-kapalina)
SPE - extrakce tuhou fází
Snadná automatizace
Vysoká spotřeba organických rozpouštědel a biologických vzorků Časová náročnost Finanční nákladnost Instrumentální vybavení
Dialýza (MWCO membrány, dutá vlákna)
Ultrafiltrace (ploché membrány, dutá vlákna)
Supported liquid membrane (SLM)
Nosič - porézní PP, PTFE (tloušťka 25 - 300 um)
Využití elektrického proudu pro úpravu vzorků
♦ Krátké extrakční časy
♦ Vysoké extrakční účinnosti
♦ Vysoká selektivita
♦ Jednoduchá instrumentace
♦ Volba membrány ?
♦ Elektrodové reakce ?
♦ Vysoký elektrický proud >    kolaps systému
ELEKTROMEMBRANOVE EXTRAKCE - EME
♦ LLE-► velké objemy organických rozpouštědel !
♦ 1996 - LPME (uL množství organiky)
Liu and Dasgupta, Anal. Chem. 68 (1996) 1817-1821 Jeannot and Cantwell, Anal. Chem. 68 (1996) 2236-2240
♦ Stabilita organické fáze !
♦ 1999 - HF-LPME (inertní polypropylenové duté vlákno)
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, Anal. Chem. 71 (1999) 2650-2656
♦ Dlouhé extrakční časy !
♦ 2006 - EME (zkrácení extrakcí použitím elektrického napětí)
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183-190
ELEKTROMEMBRANOVE EXTRAKCE - EME
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183
duté vlákno:
Parametry ovlivňující EME
♦ Složení kapalné membrány
♦ pH a složení akceptoru a donoru
♦ Elektrické napětí / proud
biologický vzorek
♦ Duté vlákno impregnované org. rozpouštědlem (~ 10 u.L) - SLM
♦ Laciné jednorázové extrakční jednotky (< 10 h/cm), není carry-over
♦ DC zdroj napětí (0 - 400 V)
♦ Donor (~ mL) a akceptor (~ 20 uL) jsou vodné roztoky
♦ Doba extrakce
♦ Míchání/třepání
20
EME bazických léčiv - modelový příklad
♦ SLM-NPOE
♦ Akceptor- 10 mM HCI
♦ Donor-v10 mM HCI
♦ Extrakční doba - 5 min při 300 V
EME za použití kapesní baterie - přenosný extrakční systém
SLM-NPOE
Akceptor- 10 mM HCI
Donor - vzorky zředěné 10 mM HCI
Extrakční doba - 5 min při 15 V
Reálné vzorky-plazma, moč
Mikročipová EME
a) PMMA - horní kryt
b) PP membrána
c) 50 um kanálek
d) PMMA - základní struktura
Petersen et al. Microfluid Nanofluid 9 (2010)
Mikročipová EME
A - neupravená moč
B - moč spikovaná léčivy
C - moč spikovaná léčivy + EME
♦ SLM-NPOE
♦ Akceptor- 10 mM HCI
♦ Donor - vzorky zředěné 10 mM HCI
♦ Extrakční doba -10 min při 15 V
♦ Reálné vzorky - moč
♦ FR donor = 3 |jL/min
EME při konstantním elektrickém proudu	
1. Faradayůvzákon m=A-l-t	
	A - electrochemický ekvivalent
Mm 2. Faradayův zákon A=^-^	F = 96485 C mol-'
	z - počet nábojů
n=Vrz	
u Ohrnuv zákon            l = ^	=> Špatná reprodukovatelnost
	EME (RSD až 30%)
22	
EME bazických léčiv Konstantní U (5 V)
♦ SLM - ENB
♦ Akceptor - 10 mM HCI
♦ Donor - STD, moč v 10 mM HCI
♦ Doba exlrakce - 5 min
EME spikované moči při konstantním proudu
RSD = 7-15%
2.0 25 3.0 3 5 4 0
Konstantní i (4 uA)
CE-UV v 15 mM fosfátovém pufru (pH 2.9
RSD = 3-8%
1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0
Konstantní U (5 V)
RSD = 6-12%
Konstantní í (4 |jA)
RSD = 3 - 7%
♦ Zlepšení reprodukovatelnosti
♦ Podobné výsledky pro ostatní analytické parametry
Linearita LOD
♦ Vhodné zdroje konstantního proudu nejsou laciné
Slampová et al. J. Chromatogr. A 1234 (2012) 32
Glyphosate a
aminomethylfosfonová kyselina ve vzorku env. vody
a - bez EME b - po EME
EME léčiv proti závislosti na alkoholu a opiátech v biologických vzorcích
Praktické aplikace EME v analýze biologických, environmentálních a dalších komplexních vzorků
t      *      c      *      ■;      u      ■■ I
imii w*Kh wŕit rtiiiíKd *ri lAiímrnmutMOr^m-1   »infl T*.f*i mi* mwfhwkíiJ tlMt burf au n*lwfii al pH ■ M ilu > EM radK-J hic In ú* *un« *T ŕkartU rkM (tiwlni i IWV rinrU p«írHiil aikf rntf. S ■ [ ME. -A • i- nmuskrt Hunu nnyJr. 11 cotĽn a xka kyd of Hi* ml-' <É akr ftici ICI EME »T nomartrf ynnt m>f4ri Pi EJW (finn? un(4i iphM *n íchkcki
Rezazadeh et al. J.Chromatogr. B 879 (2011) 1143
EME peptidů v biologických vzorcích
♦ SLM-NPOE/DEHP
♦ Akceptor-100 mM HCI
♦ Donor- vzorky zředěné 10 mM HCI
♦ Extrakční doba -20 min při 100 V
♦ Reálné vzorky - plazma, moč
♦ SLM-1-octanol/DEHP
♦ Akceptor-0.1 M HCI
♦ Donor-vzorkyzředěné 0.1 M HCI
♦ Extrakční doba - 5 min při 50 V
♦ Reálné vzorky - plazma
EME amfetaminů v biologických vzorcích
♦ SLM - NPOE/TEHP
♦ Akceptor- 100 mM HCI
♦ Donor - vzorky zředěné 1 mM HCI
♦ Extrakční doba - 7 min pri 250 V
♦ Reálné vzorky - moč
EME dekompozičních produktů nervových bojových látek v environmentálních vzorcích
♦ Akceptor - Dl voda
♦ Donor-vzorky zředěné Dl
♦ Extrakční doba - 30 min při 300 V
♦ Reálné vzorky-env. vody
EME těžkých kovů ve vzorcích vod a biologických vzorcích
♦ SLM-1-oktanol/DEHP
♦ Akceptor-100 mM HAc
♦ Donor - vzorky zředěné Dl
♦ Extrakční doba - 5 min při 75 V
♦ Reálné vzorky - kohoutková voda, kojenecká strava
Kohoutková voda
Mléko v prášku (kojenecká strava)
Kubáň et al. Electrophoresjs 32 (2011) 1025
i-1-1-1-1
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 _migration time (min)_
EME lithia v tělních tekutinách
♦ Endogenní Li+ (sérum 0.2 - 2 uJvl, moč 0.5 - 20 u.M)
♦ Terapeutické Li+ (sérum 0.5 - 1.5 mM)
♦ SLM - 1-oktanol
♦ Akceptor- 100 mM kys. octová
♦ Donor - vzorky zředěné 0.5 mM Tris
♦ Extrakční doba - 10 min při 75 V
♦ Reálné vzorky - sérum, plazma, krev, moč
EME lithia v tělních tekutinách
Endogenní Li*
Terapeutické Li*
5.4 5.S 5.S S.O 62 6.4
Strieglerová et al. Electrophoresjs 32 (2011) 118;
EME amino kyselin v tělních tekutinách
EME amino kyselin v tělních tekutinách
♦ Endogenní koncentrace ~ 100 u.M
♦ Koncentrace při metabolických poruchách    (MSUD ~ 500 u.M)
(PKU -350- 1500 u.M)
♦ SLM - ENB/DEHP
♦ Akceptor-2.5 M kys.octová
♦ Donor - vzorky zředěné 2.5 M kys. octovou
♦ Extrakční doba - 10 min při 50 V
♦ Reálné vzorky - sérum, plazma, krev, moč
CE-C4D v 2.5 M kys octové
6 8 10 1í krev migration time (min)_
MSUD - rozvětvené amino kyseliny (Val, Leu, Ne)
PKU-fenylalanin (Pne)
EME shrnutí
■ Clean-up a prekoncentrace v jednom kroku
■ ~ 10 (j.L organického rozpouštědla/analýza
■ Jednorázové extrakční jednotky
■ Krátké extrakční časy
■ Vysoká selektivita SLM
■ Vhodné pro biologické vzorky
■ Volba SLM !
■ EME parametry !
Spojení membránových předseparačních technik se současnou analytickou instrumentací
Extrakce a následná analýza off-line
6. On-line mikročipová EME
♦ SLM - 0.2 |jL NPOE
♦ Akceptor-100 mM HCOOH
♦ Donor-vzorky zředěné 10 mM HCl
♦ Extrakční doba - 10 min při 15 V
♦ Reálné vzorky - moč
♦ FR donor = 9 |jL/min
♦ FR akceptor =0-3 |jL/min
Peteisen et al. Anal. Chem. (2011) 44
7. In-line spojení jednorázové open-tubular kapilárni pŕedkolonky s CE
Stanovení hlavních anorganických kationtú v séru a plazmě
8. In-line spojení jednorázové SLM s lab-made CE
Stanovení rychle migrujících amino kyselin v séru a plazmě
PTFE-2 x 2 x 3 cm
♦ SLM-2.5|jLENB/DEHP
♦ Akceptor - Dl voda
♦ Donor- plazma, sérum, mc
♦ Objem-50 uL
♦ Extrakční doba - 5 min
Kubáň and Boček J. Chromatogr. A 1234 (2012) 2
9a. In-line spojení jednorázové SLM s komerční CE ■ Beckman
♦ SLM: 1 - 10 |jL organického rozpouštědla
♦ Donor: surové biologické vzorky
♦ Akceptor: Dl voda
♦ Objem: 20 -40 uL
♦ Jednorázové extrakční jednotky!!!
9b. In-line spojení jednorázové SLM s komerční CE -Agilent
♦ SLM: 1 - 10 uL organického rozpouštědla
♦ Donor: surové biologické vzorky
♦ Akceptor: Dl voda
♦ Objem: 10 uL
♦ Jednorázové extrakční jednotky!!!
Stanovení formátu v lidském séru a plné krvi
Normální hodnoty: 0 - 0.4 mM Otrava metanolem: 1 - 35 mM > 10 mM vážné zdravotní následky
♦ Support: PP fólie (100 um)
♦ SLM:10uLMeOH
♦ Donor: surové sérum, plná krev
♦ Akceptor: Dl voda
♦ Objem: 10 uL
♦ Doba extrakce: 60 s !!!
lod: 30 mM neředěné sérum, 35 mM neředěná plná krev
Celková doba analýzy: ~ 4 min!!!
10. Volné kapalné membrány
- pacient po intoxikaci metanolem
♦ Extrakčníjednotky- PFA, PTFE, FEP hadičky (ID 0.5 -1.0 mm)
♦ Minimální spotřeba rozpouštědel/vzorku (350 nL - 1.5 |jL/extrakce)
♦ Laciné, jednorázové extrakčníjednotky (- 1 kč/cm), eliminace sample carry-over
♦ Stabilní a precizně definované fázové rozhraní
Pantůčková et al. J. Chromatogr. A 1299 (2013) 33
|j-EME bazických léčiv přes volné kapalné membrány
♦ LM: 1.5 uL ENB
♦ Donor: surová moč a sérum + 20 ug/mL léčiv
♦ Akceptor: Dl voda
♦ Objem: 1.5 uL
♦ Extrakční napětí: 100 V
♦ Extrační čas: 5 min
SHRNUTI A VÝHLEDY
♦ Membránové techniky jsou ekologické, laciné, rychlé a efektivní
♦ Elektrický proud je vhodný pro úpravu komplexních vzorků
♦ Výsledný akceptor je možno dávkovat do různých analytických systémů
♦ On-line a in-line spojení je velice atraktivní