1/6/2014 1 Ctirad Hofr 8. listopad 2013 Fluorescenční metody při studiu biomolekul Molekulární komplexy chromatinu CEITEC Přírodovědecká fakulta Přehled I 1. Jak zviditelnit, co nevidíme? 2. Jak přispělo víno k objevení fluorescence? 3. Jak lze změřit fluorescenci? 4. Jak lze zlepšit viditelnost fluorescence? 1. Jak zviditelnit, co nevidíme? Za použití fluorescence! Umožňuje nám vidět pouhým okem,  co bychom jinak neviděli Příklady fluorescence živočichů Co je to fluorescence? • Prakticky:  fluorescenci  pozorujeme během buzení a po jeho  vypnutí rychle mizí • Doba dohasínání  (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od   excitace po emisi – je řádově  1 – 10 nanosekund Emise z excitovaných singletových stavů elektronů  z xy c =  f c je konstanta, pak jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka je nepřímo úměrná frekvenci f E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka  tím je menší energie záření. B E Světlo = elektromagnetická vlna  1/6/2014 2 Koloběh života fluoroforu Výukový materiál společnosti Invitrogen Spektrum fluoroforu • Excitační/Absorpční spektrum Závislost intenzity absorbce/fluorescence na  excitační vlnové délce při konstantní vlnové  délce emitovaného záření • Emisní spektrum Závislost intenzity fluorescence na emisní  vlnové délce při konstantní vlnové délce  • Nejdůležitější charakteristiky spektra: maxima  Stokesův  posuv Abs./Excit. Emis. Vlnová délka  Intenzita Vznik absorpčního=excitačního spektra Výukový materiál společnosti Invitrogen 10 Excitační spektrum Závislost intenzity fluorescence na excitační   vlnové délce při konstantní vlnové délce  emitovaného záření Em= konst.Ex scan Vznik emisního spektra Výukový materiál společnosti Invitrogen 12 Emisní spektrum Závislost intenzity fluorescence na vlnové  délce při konstantní excitační vlnové délce Ex= konst. Em scan 1/6/2014 3 Závislost emisního spektra na  excitačním světle Výukový materiál společnosti Invitrogen Stokesův posun Emitované světlo má vždy menší energii (větší vlnovou  délku) než je energie absorbovaného světla (menší  ). Rozdíl mezi maximem absorpčního a  maximem fluorescenčního emisního spektra je  specifická charakteristika daného fluoroforu. Vznik Stokesova posunu 15 Výukový materiál společnosti Invitrogen Jak přispělo víno k objevení fluorescence? 2 Experiment  G. G. Stokese Slunce Modré sklo okna v kostele Propouští světlo s  < 400 nm Excitační filtr Roztok chininu Sklenice vína Propouští světlo s  > 400 nm Emisní filtr G.G. Stokes 1852, Cambridge Přístroje pro měření fluorescence  1.      spektrofluorimetry – měří střední signál celého vzorku  umístěného obvykle v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky 2.      fluorescenční skenery (včetně čteček mikrodestiček) – měří  fluorescenci dvojrozměrných makroskopických objektů  (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) 3. fluorescenční mikroskopy – umožňují pozorovat  fluorescenci dvoj‐ nebo trojrozměrných mikroskopických objektů 4.      průtokové cytometry – měří fluorescenci velkého množství  jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich  subpopulací 1/6/2014 4 DetektorXenonová lampa Emisní monochromátor SpektroFLUOROmetr Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon Geometrie při měření fluorescence Kyveta shora Dopadající excitující světlo Emitované světlo Fitr pro výběr excitačního světla I • Long Pass filtr Fitr pro výběr excitačního světla II • Band Pass filtr Filtr emitovaného světla zlepší viditelnost fluorescence Dokumentační systém „inteligentní temná komora“ Umožňuje stanovit hodnotu lokální optické absorpce i fluorescence Zdrojem univerzálního budícího záření je zpravidla transiluminátor, který emituje v UV oblasti. Zdrojem selektivního budícího záření jsou LED diody na bočních stranách Emitované světlo je selektováno filtry v otočném karuselu. Emise je sledována (digitálním) fotoaparátem nebo chlazeným CCD detektorem 1/6/2014 5 Fluorescenční scanner • Snímá oblast a sleduje závislost intenzity  emise fluorescence při daném excitačním  záření •Používá se k detekci fluorescenčně značených a barvených molekul po elektroforetické separaci Fluorescenční scanner ‐ schéma Převzato z produktové dokumentace firmy FujiFilm Fluorescenční mikroskop Hlavní rozdíl oproti spektrometrům : nepoužívá monochromátory, ale excitační a emisní filtr Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/ lightpaths/fluorescence/index.html Čtečka mikrodestiček Převzato z přístrojové dokumentace Biotek Shrnutí I 1. Jak zviditelnit, co nevidíme? 2. Jak přispělo víno k objevení fluorescence? 3. Jak lze změřit fluorescenci? 4. Jak zlepšit viditelnost fluorescence? Fluorescence Stokesův jev Spektrofluorometr Filtrem Proč svítí svítí na diskotéce i to co normálně  nesvítí? 1/6/2014 6 Přehled II 1. Jak fluorescenčně obarvit proteiny a DNA? 2. Jak Vikingové navigovali své lodě v mlze? 3. Co se dá určit z anizotropie při interakci proteinů a DNA? 4. Kde se s anizotropií setkáváme denně? Jaký roztok chininu se hodí na  diskotéku? Tonik obsahuje chinin v koncentraci 30-80 mg/L Fluorescenční značky Vhodná značka pro kovalentní vazbu na  biomolekulu by měla mít následující  parametry: ‐ vysoká intenzita fluorescence  ‐ stabilita i při souvislém ozařování  ‐ minimální vliv na biologické chování      studované molekuly Svítivost značky (Brightness) • je dána součinem kvantového výtěžku a  molárního extinkčního koeficientu  Bs = Q  • Dobrý parametr pro účinnost s jakou značka  přeměňuje excitační světlo na fluorescenci • Po kovalentní vazbě k biomolekule často  dochází k výrazné změně ve svítivosti • Pro praxi je vhodné mít značku se svítivostí  Bc>5000 Příklady svítivosti nevlastních fluoroforů Fluorofor  (cm-1 M-1) Kvantový výtěžek (Q) Svítivost (Bs) Oregon Green® 488 87 000 0.9 78 300 BODIPY FL 91 000 0.9 81 900 Fluorescein (FAM) 79 000 0.9 71 100 JOE 71 000 0.6 42 600 TAMRA 103 000 0.2 20 600 Rhodamine Red-X (ROX) 82 000 0.7 57 400 Texas Red 139 000 0.9 125 100 http://www.promega.com/geneticidproc/ussymp8proc/21.html Příklady fluorescenčních značek • dansyl chlorid (DNS‐Cl; 5‐dimetylaminonaftalén‐1‐sulfonyl chlorid)  • fluorescein‐5‐izothiokyanát (FITC)  • 5‐jodoacetamidofluorescein (5‐IAF)  • tetrametylrhodamin‐5(a 6)‐izothiokyanát (TRITC)  • 4‐chloro‐7‐nitrobenz‐2‐oxa‐1,3‐diazol (NBD‐Cl; 4‐chloro‐7‐nitrobenzofurazan)  • 6‐akryloyl‐2‐dimetylaminonaftalén (Acrylodan)  1/6/2014 7 Fluorescein a rhodaminy • Patří k nejrozšířenějším fluorescenčním značkám • Abs.max.     Em. max.  fluorescein (490nm)  (520) rhodaminy (500‐600 nm)   (530‐620) • Citlivé na polaritu solventu a na pH • vysoká hodnota  ~ 80 000 M‐1cm‐1 • Vysoký kvantový výtěžek Q ~ 0.3‐0.8 • Doba dohasínání fluorescence ~ 4 ns • je syntetizováno velké množství derivátů, které se  používají ke značení proteinů a DNA přes NH2 skupinu nebo SH skupinu • Intenzita fluorescence je závislá na pH • Mají sklon k fotovybělování FITC Alexa Fluor • Vysoký kvantový  výtěžek ‐> vysoká  svítivost • Zlepšená  rozpustnost ve vodě • Malá závislost  fluorescence na pH • Fotostabilní ! Fotostabilita fluoroforů • Po určitém času dojde u  každého fluoroforu  k fotovybělení • Nejdůležitější je fotostabilita  při mikroskopii, kde se  používají vysoké intenzity  excitačního světla • Nejvyšší fotostabilitu ukazují  sondy skupiny Alexa  • Zatím nebyla zjištěna žádná  spojitost mezi strukturou  fluoroforů a jejich  fotostabilitou Reakce esteru značky Alexa Fluor a NH2  skupiny proteinu Alexa Fluor® 488 carboxylic acid, 2,3,5,6‐ tetrafluorophenyl ester (Alexa Fluor® 488  5‐TFP) + NH2 NH R´ R R´´ 11     Značení DNA přes NH2 skupinu Rhodamine Red™‐X,  succinimidyl ester + NH2 DNA s „amino‐linkerem“ 11     DNA značená Rhodaminem Red‐X a  OregonGreen 1/6/2014 8 Fluorescenční sondy • Fluorescenční sondy jsou nevlastní fluorofory, které se  ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často  přitom mění své fluorescenční vlastnosti.  Fluorescenční sondy jsou sami v roztoku zpravidla velmi málo fluorescenční. Po vazbě na proteiny nebo DNA se však jejich fluorescence velmi výrazně zvýší. Závislost emisního spektra na polaritě  rozpouštědla Podle zvyšující se polarity: H – hexan CH- cyklohexan T- toluen EA – etylacetát Bu – n-butanol polarita Praktická ukázka • Prodan (N,N‐Dimethyl‐6‐propionyl‐2‐naphthylamine) O CH3 N CH3 CH3 C - Cyklohexan G – Glycerol D - dimetylformamid E - Etanol CH3CH2OH V - Voda H2O Bu - n- Butanol CH3CH2CH2CH2OH OH OH OH N CH3 CH3 O H polarita DNA sondy • Interkalátory EB, AO, TOTO se vážou  vmezeřením mezi páry bazí • Hoechst, DAPI se vážou do malého žlábku  DNA • EB zvyšuje intenzitu fluorescence po vazbě  30x a  se prodlužuje z 2 na 20 ns • DAPI zvyšuje intenzitu fluorescence nejvíc  v blízkosti AT párů • TOTO (Thiazole Homodimer) zvyšuje  intenzitu fluorescence po vazbě 1100x • Sondy s velkou afinitou jak EB homodimer  (váže se 10 000x pevněji než monomer EB)  a kladně nabitý TOT0 zůstávají navázané  na DNA i během elektroforézy a používají  se k vizualizaci DNA na gelu a umožňují  zvýšit citlivost až 500x ve srovnání s  klasickým barvením EB • Jak je možno snížit spotřebu sondy? Interkalace  Benzpyrene TOTO Vazba do žlábku DNA Syber Green  • Selektivně se váže na ds DNA  do malého žlábku • Detekce od  1 ng/mL • Využití při Real‐Time PCR ke   kvantifikaci namnožené DNA Taq 1/6/2014 9 Srovnání sond pro kvantifikaci dsDNA Extinkční koeficienty byly zjištěny pro volné sondy ve vodném roztoku Sonda Citlivost pro dsDNA Extinction Coefficient (cm-1 M-1) Kvantový výtěžek po vazbě na dsDNA Zvýšení intenzity fluorescence po vazbě na dsDNA PicoGreen 25 pg/mL 70,000 0.53 ~2000x Hoechst 33258 1-10 ng/mL 40,000 0.59 ~100x Ethidium bromid 1-10 ng/mL 5,000 <0.3 ~30x http://www.promega.com/geneticidproc/ussymp8proc/21.html Proteinové sondy • Zvyšují intenzitu fluorescence po vazbě na protein • Nejcitlivější fluorescenční sondy pro barvení  proteinů v gelu jsou ze skupiny organokovových  sloučenin SYPRO  • SYPRO Red, Orange, Tangerine, Rose • Vysoká citlivost  ~ ng/mL • Před použitím je nutná kyselá fixace • Primárně používané při barvení proteinů na gelu  • Využití v kriminalistice  Současné barvení DNA a proteinů na gelu • DNA byla  barvena  Syber  Green • Protein  SYPRO  Ruby Indikace Ca2+ v nervových buňkách za  použití Fluoro‐3 Za použití sondy  bylo sledováno  odumírání  nervové buňky Jak Vikingové navigovali své lodě? http://www.nmm.ac.uk The National Maritime Museum 1/6/2014 10 Vikingové používali sluneční kompas 55 http://www.nmm.ac.uk The National Maritime Museum Horvath G et al. 2011 •Poloha severu je určena stínem slunce. •Stín byl vyznačován pravidelně během dne. •Slunce je v nejvyšším bodě  v poledne a proto je vržený stín výstupku nejkratší. •Je to přesně v polovině cesty stínu mezi  východem a západem. •V bodě, kde je křivka nejblíže středu byla vyznačena  čára, která ukazuje směr  sever/jih. Anizotropie fluorescence v  biologické analýze  Hofr 56 Sluneční kámen Fluorescenční metody studia  biomolekul  C. Hofr 57 Poloha slunce mohla být  díky slunečnímu kameni určena i  při  oblačnosti a za mlhavého počasí.  Základní otázky současné vědy • Nebylo náhodou možno navigovat  na základě odhadu polohy slunce  pouhým okem? • Za jakých podmínek je možno použít sluneční  kámen pro určení polohy slunce? Anizotropie fluorescence v  biologické analýze  Hofr 58 Ověření určení polohy slunce za pomocí  znalosti Vikingů  • Dr. Gábor Horváth, Eötvös University Anizotropie fluorescence v  biologické analýze  Hofr 59 okem polarizátorem •Bylo vyvráceno, že by Vikingové mohli navigovat na  širém moři odhadem polohy slunce pouhým okem bez  dalších navigačních pomůcek. •Bylo prokázáno, že polarizátor mohl být používán k  přesnému určení polohy slunce za podmínek mlhy a  neúplné oblačnosti.  velká  odchylka přesné  určení   Horvath G et al. 2011, Hegedüs R et al. 2007 Beringia 2005 Dnešní měření anizotropie fluorescence polarizátor analyzátor detektor      2II II r ΙΙ ΙΙ 1/6/2014 11 61 Měření anizotropie při ustálené fluorescenci • Anizotropie ‐ měří polarizovanou emisi • Polarizátor je na dráze excitačního světla  a dělá z něj rovinně  polarizované • Polarizátor (analyzátor) je na dráze emitovaného světla – fluorescence • Měří se intenzita fluorescence při natočení polarizátoru vertikálně  a analyzátoru vertikálně (VV), následně při natočení polarizátoru  vertikálně a analyzátoru horizontálně(VH) • Ze změřených intenzit se vypočítá hodnota anizotropie  VHVV VHVV II II r    2 6     62 Dipólové momenty přechodu • Dipólový moment přechodu je kvantově mechanická záležitost.  Není skutečným dipólovým momentem. Je dán okamžitým stavem elektronového obalu  molekuly. Velikost dipólového momentu přechodu udává schopnost daného stavu  molekuly absorbovat nebo emitovat světlo. Směr dipólového momentu přechodu  udává směr, ve kterém je světlo molekulou nejlépe absorbováno nebo emitováno.  • Molekuly přednostně absorbují záření, jehož elektrická složka kmitá ve stejné rovině  jako je absorpční dipólový moment přechodu elektronu do vyšší energetické hladiny. • Molekuly přednostně emitují záření ve stejné rovině jako je emisní dipólový moment  přechodu elektronu do nižší energetické hladiny. Absorpce Emise 6     Fotoselekce • Je‐li roztok fluoroforů excitován  lineárně polarizovaným  zářením, potom budou  excitovány pouze ty molekuly,  které mají nenulový průmět  svého absorpčního  přechodového momentu do  směru polarizace budícího  záření Detekce vazby proteinů na DNA ze změny  anizotropie fluorescence Excitace nízká anizotropie vysoká anizotropie t ~ ns Emise 6     65 AF detekce interakce protein‐DNA KD = 2 . 10‐6 M 0.17 0.22 0.27 0.32 0 5 10 15 protein (M) AnizotropieFluorescence KD 6     66 L a T uspořádání měření 1/6/2014 12 Aplikace I Helikázy 67 • Katalyzují rozvíjení DNA nebo RNA za přítomnosti ATP • Hrají důležité role ve většině drah metabolismu nukleových kyselin Helikáza UvrD navázána na DNA Lee & Yang, Cell, 2006 Podílejí se na replikaci DNA  6 68 Sledování rozplétání DNA Aplikace II Interakce proteinů SMH s DNA SMH rodina proteinů (Single Myb Histone) Myb H1/H5 coiled ‐coil GGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAG CCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATC 5’ Myb 5 56 113 180 240 290 H1/5 coiled -coil 1 300 C Telomerická DNA 5’ Netelomerická DNA CATCATGGCTGGTCATGGCTGGTACTAG GTAGTACCGACCAGTACCGACCATGATC - 5' 5' - MW  ~ 25 kDa Vazebná afinita SMH proteinů k DNA 0 0.2 0.4 0.6 0 2 4 6 [protein], M Anizotropiefluorescence normalizovaná KD 0 5 protein Vazebnáafinita Ka(M-1)10-6 Telomerická Netelomerická Vazebná afinita proteinů SMH k telomerické DNA je výrazně vyšší než k  netelomerické DNA. Hofr C. et al. 2009 -5' 5'-GGT T T AGGGT T TAGGGT T TAGGGT T TAG CCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATC Myb doména H1/5 doména Navržený model interakce  SMH proteinů s telomerickou DNA DNA vazebné  místo Myb domény Hofr et al, 2009, Biochemical Journal SMH proteiny ve formě dimeru se vážou  telomerickou DNA s velkou afinitou a  selektivitou ve srovnání s netelomerickou DNA . Anizotropie kolem nás: monitor • Anizotropie se projevuje u LCD monitoru • Co je příčinou? 72 http://www.youtube.com/watch?v=imQnWrLW2i0 1/6/2014 13 Shrnutí II 1. Jak fluorescenčně obarvit proteiny a DNA? 2. Jak Vikingové navigovali své lodě v mlze? 3. Co se dá určit z anizotropie při interakci proteinů a DNA? 4. Kde se s anizotropií setkáváme denně? Reaktivními fluorofory – značkami a sondami  Sluneční kámen = polarizátor Disociační konstanta Monitor