1
LOSCHMIDTOVY
LABORATOŘE
MASARYKOVA UNIVERZITA
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
HaloPen
Moderní biosensor pro detekci halogenovaných
látek in situ
Mikrokalorimetrie
pro studium biomakromolekul
Veronika Štěpánková
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Obsah přednášky
 termodynamika obecně
 historie a současnost kalorimetrie
 isotermální titrační kalorimetrie
 princip, popis přístroje, příklady využití
 diferenční skenovací kalorimetrie
 princip, popis přístroje, příklady využití
 úskalí experimentů
 výhody a nevýhody mikrokalorimetrie
 literatura
2
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Obecně termodynamika
 tepelné změny probíhající v biologických systémech se řídí
termodynamickými zákony
 změna volné energie při přechodu mezi počátečním a konečným
konformačním stavem nebo rozdíl volné energie volných reaktantů a
výsledných produktů reakce
 ∆H je z molekulárního hlediska teplo spojené se vznikem, zánikem a
deformací chemických vazeb
 ∆S je při dané teplotě spojena se změnou v uspořádanosti systému molekul
G = -nRT lnK G = H - TS
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Obecně termodynamika
 termodynamické veličiny možno vyjádřit pomocí tepelné kapacity, kterou
lze experimentálně určovat
 přechod z poměrně rigidního nativního stavu do méně kompaktního
denaturovaného stavu doprovázena nárůstem tepelné kapacity
 uplatnění hydrofobních interakcí při vazbě vede k uvolnění původně
uspořádaných molekul vody do roztoku, což se projeví celkovým snížením
tepelné kapacity
H = ʃ Cp dT
Tkon
Tpoč
S = ʃ Cp/T dT
Tkon
Tpoč
3
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Kalorimetrie
 experimentální technika zabývající se měřením energie ve formě tepla
 umožňuje měřit termodynamické charakteristiky přímo v jediném
experimentu
 různé druhy energie (zářivou, elektrickou či chemickou) lze za vhodných
podmínek převést kvantitativně na teplo
Q = Ck . T
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Počátky kalorimetrie
 Antoine Lavoisier považován za zakladatele kalorimetrie a termochemie
 1782: první známý experiment, při kterém byla změřena tepelná výměna
u biologického systému (tzv. ledový kalorimetr)
4
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Současnost kalorimetrie
 moderní mikrokalorimetry MicroCal (GE Healthcare)
 umožňují sledovat velmi malé tepelné toky (> 4 J)
 objem vzorku v řádu mikrolitrů
Diferenční skenovací kalorimetr
objem cely: 750 μl)
Isotermální titrační kalorimetr
(objem cely: 1400 μl)
Isotermální titrační kalorimetr
(objem cely: 200 μl)
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Rozdělení technik
A) Izotermální titrační kalorimetrie
B) Diferenční skenovací kalorimetrie
5
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Izotermální titrační kalorimetrie
 ITC (z angl. Isothermal Titration Calorimetry)
 měří množství tepla uvolněného nebo spotřebovaného při interakci
molekul
 studované interakce: protein-protein, protein-DNA, protein-ligand, enzymsubstrát,
enzym-inhibitor, protein-lipid atd.
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Izotermální titrační kalorimetrie
 teplotní efekt při sledovaném ději kompenzován známým tepelným
efektem s opačným znaménkem tak, aby teplota v kalorimetrické nádobce
byla konstantní
 měří se výkon topného tělíska (případně Peltierova článku) v čase
Exotermní reakce: ohřev nádobky snížen
Endotermní reakce: ohřev nádobky zvýšen
6
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Izotermální titrační kalorimetrie
 příklady využití:
 stanovení disociační konstanty (Kd)
 vazebný mechanismus
 stanovení reakční stechiometrie (n)
 stanovení entropie, enthalpie a tepelné kapacity (H, S, Cp)
 stanoveni kinetických parametrů enzymatických reakcí (Km, kcat, inhibice ...)
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Izotermální titrační kalorimetrie
Referenční cela Cela se vzorkem
Injektor s ligandem
adiabatický plášť
T
konstantní
příkon
Exotermní reakce
 přísun energie snížen
Endotermní reakce
 přísun energie zvýšen
příkon podle
T
7
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Izotermální titrační kalorimetrie
výstup
Referenční cela Cela se vzorkem
Injektor s ligandem
T
konstantní
příkon
příkon = dQ/dT
příkon podle
T
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
A) Stanovení vazebných parametrů
B) Stanovení kinetických parametrů enzymů
ligand
produktsubstrát
8
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Stanovení vazebných parametrů
 záznam tepelné změny generované
během přikapávání malého objemu
ligandu do cely se vzorkem
Využití ITC
Čas (min)
μcal/s
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Titrační experiment
Ligand v injektoru
Vzorek v cele
9
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení vazebných parametrů
 záznam tepelné změny generované
během přikapávání malého objemu
ligandu do cely se vzorkem
 závislost uvolněné energie na molárním
poměru ligandu a vzorku vypočtena
integrací jednotlivých píků ze známé
koncentrace vzorku v cele a ligandu v
injektoru
Čas (min)
μcal/s
kcal/mol
stechiometrie (n)
H
n
H
H Kb = 1/Kd
stechiometrie (n)
Molární poměr
kcal/mol
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení vazebných parametrů
 nelineární regresní analýza
kcal/molinjektantu
molární poměr
10
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení vazebných parametrů
 ITC poskytuje celkový obrázek o vazebných energiích
 G přímo souvisí s celkovou vazebnou afinitou (zápornější G , vyšší afinita)
 H indikuje změny ve vodíkových a van der Waalsových vazbách
 S indikuje konformační změny a změny v hydrofobních interakcích
 stechiometrie udává poměr ligandu a makromolekuly při vzájemné vazbě
G = -nRT lnKd
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
ITC poskytuje celkový obrázek o vazebných energiích
3 různé ligandy, stejná G ale ...
 vazba ligandu A: energeticky výhodné
vodíkové vazby a van der Waalsovy interakce,
provázeno konformačními změnami
11
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
ITC poskytuje celkový obrázek o vazebných energiích
3 různé ligandy, stejná G ale ...
 vazba ligandu A: energeticky výhodné
vodíkové vazby a van der Waalsovy interakce,
provázeno konformačními změnami
 vazba ligandu B: energeticky výhodné
hydrofobní interakce, dehydratace povrchu
molekuly
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
ITC poskytuje celkový obrázek o vazebných energiích
3 různé ligandy, stejná G ale ...
 vazba ligandu A: energeticky výhodné
vodíkové vazby a van der Waalsovy interakce,
provázeno konformačními změnami
 vazba ligandu B: energeticky výhodné
hydrofobní interakce, dehydratace povrchu
molekuly
 vazba ligandu C: energeticky výhodné jak
vodíkové vazby a van der Waalsovy interakce,
tak hydrofobní interakce
12
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
1. metoda vícenásobné injektáže
2. metoda jediné injektáže
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 Detekce tepelné energie generované během konverze substrátu na produkt
Metoda vícenásobné injektáže
 roztok enzymu v reakční cele
 malá množství substrátu injektována postupně
 reakce psudo-prvního řádu
dQ1/dt
dQ2/dt
13
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 Detekce tepelné energie generované během konverze substrátu na produkt
dQ1/dt
dQ2/dt
hodnota Happ se zjistí
experimentálně, nechá-li se
reakce doběhnout až do
konce; V – objem reakční cely
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 Detekce tepelné energie generované během kompletní konverze substrátu
na produkt
Metoda jediné injektáže
 roztok substrátu v reakční cele
 roztok enzymu injektován jednorázově
 totální konverze substrátu enzymem
 několik tisíc bodů v rámci jednoho měření
14
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 Detekce tepelné energie generované během kompletní konverze substrátu
na produkt
Metoda jediné injektáže
 roztok substrátu v reakční cele
 roztok enzymu injektován jednorázově
 totální konverze substrátu enzymem
 několik tisíc bodů v rámci jednoho měření
Smutná realita 
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 Detekce tepelné energie generované během kompletní konverze substrátu
na produkt
15
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití ITC
Stanovení kinetických parametrů enzymatické reakce
 příklad: studium inhibičního účinku benzamidinu na trypsin
μcal/s
Koncentrace substrátu (μM)
v(s-1)
Čas (min)
bez inhibitoru
s inhibitorem
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Diferenční skenovací kalorimetrie
 DSC (z angl. differential scanning calorimetry)
 měří množství tepla, které se uvolní nebo spotřebuje při tepelně
indukovaných konformačních přechodech (tání DNA, denaturace proteinů)
 přechod z nativního rigidního stavu do méně kompaktního více flexibilního
stavu doprovázen nárůstem jak entropie tak tepelné kapacity
 dvě identické kalorimetrické cely umístěné ve stejném termostatu
 eliminuje vliv tepelné kapacity rozpouštědla u velmi zředěných roztoků
biomolekul
 využití DSC:
 stanovení všech termodynamických parametrů charakterizující děj uvnitř cely
16
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Diferenční skenovací kalorimetrie
výstup
Referenční cela Cela se vzorkem
T
příkon podle
T
konstantní
zvyšování teploty
Nn
N
D
Tm
Cp
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Diferenční skenovací kalorimetrie
výstup
Referenční cela Cela se vzorkem
T
příkon podle
T
konstantní
zvyšování teploty
plocha = Sdplocha = Hd
G = H - TS
17
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití DSC
Studium termostability proteinů v přítomnosti denaturantů
 příklad: pokles teploty tání proteinu halogenalkan dehalogenasy v přítomnosti
vysokých koncentrací organických rozpouštědel
Tm pufr = 47 °C
Tm DMSO 50% = 32 °C
Tm aceton 50% = 25 °C
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Využití DSC
Popis termodynamických změn vyvolaných kovalentní vazbou
protinádorově účinných sloučenin kovů na DNA
 příklad: vytvoření komplexu cisplatina-DNA snížilo hodnotu entalpie pro tání
DNA, což odpovídá narušení vodíkových vazeb v okolí navázané cisplatiny
H DNA = 390 kJ
H cisplatina-DNA = 290 kJ
18
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Úskalí experimentů
 zajistit dokonale stejný objem roztoků v obou celách
 zajistit precisní ohřívaní a měření teploty obou cel
 eliminovat bublinky plynu (tepelná roztažnost plynů je větší než kapalin)
 vyloučit vzájemné interakce mezi molekulami proteinů
 zvolit rozpouštědlo ve kterém je bílkovina rozpustná v celém zkoumaném
teplotním rozsahu
 zvolit pufr jehož disociační teplo je co nejmenší (fosfát, acetát, glycin ...),
Tris pufr nevhodný
 přechody mezi konformačními stavy by měly být reversibilní (nejlépe
splněno u proteinů s molekulovou hmotností do 40 kDa)
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Výhody & nevýhody
- omezené využití pokud nelze dosáhnout rovnovážného stavu reakce
- neposkytuje dostatečnou citlivost měření při použití velkých objemů
vzorků nebo v případě analýzy průběhu reakce za dlouhý časový úsek
+ kvantitativní, levná a univerzální metoda
+ přináší časovou, materiální i finanční úsporu
+ měření enzymové aktivity bez nutnosti značení
+ umožňuje kvantifikaci bez nutnosti oddělit ostatní složky reakční směs
19
Biofyzikální chemie II, 29.11.2013
Literatura
 C. Hofr. Mikrokalorimetrie biologicky významných molekul. Čs. čas. fyz.
(2006), 56, 288-292.
 M. J. Todd, J. Gomez. Enzyme kinetics determined using calorimetry: A
general assay for enzyme activity?. Anal. Biochem. (2001), 296, 179-187.
 M. W. Freyer, E. A. Lewis. Experimental design, data analysis, and probing
macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. (2008), Methods
in cell biology, vol. 84, 79-113.
 D. Sheehan. Physical Biochemistry: Principles and applications. (2000),
John Wiley and Sons.
 Video: http://www.youtube.com/watch?v=uLxvSFnuGd0